Name: 나노 제형에도 Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) 분석 실험을 사용 하 여 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-30T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 15 s
Description: 학습하세요 나노 의약품 안전성 평가를 위한 LAL 분석법으로 엔도톡신 오염을 정량 측정하는 방법을. 표준화된 시험법으로 나노재료의 생물학적 안전성을 확보할 수 있습니다.

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연구는 국립 암 연구소에서 연방 기금에 의해 지원 되었다 건강의 국가 학회, HHSN261200800001E 계약. 이 발행물의 콘텐츠 뷰 또는 정책의는 부의 보건 및 인적 서비스, 반드시 반영 하지 않습니다도 무역 이름, 상용 제품의 언급지 않습니다 또는 조직 미국 정부에 의해 승인을 의미 합니다.

1입니다. 나노 샘플의 준비
<ol><li>준비 랄에 연구 샘플 학년 물.</li>
	<li>샘플 pH 범위를 6-8 인 경우에, pyrogen 무료 수산화 나트륨 또는 염 산을 사용 하 여 pH를 조정 합니다.</li>
	<li>랄을 사용 하 여 학년 물 연구 샘플의 여러 희석을 준비 합니다. 높은 희석은 최대 유효 희석 (MVD)를 초과 하지 않는 다는 것을 확인 하십시오. MVD 추정에 대 한 자세한 토론 섹션을 참조 하십시오.</li>
</ol>2. 랄 형식 사이 시 약 일반의 준비
<ol><li>LAL 시 약 물 pyrogen 무료를 사용 하 여 0.1 n.의 농도에서 작업 솔루션을 준비 하는 집중된 수산화 나트륨 재고 희석</li>
	<li>LAL 시 약 물 pyrogen 무료를 사용 하 여 집중된 염 산 주식을 희석 하 고 0.1 n.의 최종 농도에 작업 솔루션을 준비</li>
	<li>제어 표준도 (CSE)의 준비<ol>
<li>제조업체에서 제공 하는 분석의 인증서에 따라 CSE reconstitute 참고: 인증서에 제공 하는 정보에 관한 중요 사항에 대 한 토론 섹션을 참조 하십시오. 카탈로그 번호 및 다른 랄 형태로 특정된 CSE 공식의 응용 프로그램에 대 한 세부 사항에 대 한 테이블의 자료 를 참조 하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>LAL 시 약의 준비<ol>
<li>LAL 시 약 제조업체에서 제공 하는 분석의 인증서에 따라 reconstitute 참고: LAL 시 약 준비에 관한 중요 한 세부 사항에 대 한 토론 섹션을 참조 하십시오. 카탈로그 번호 및 다른 랄 형태로 주어진된 LAL 시 약 배합의 응용 프로그램에 대 한 세부 사항에 대 한 테이블의 자료 를 참조 하십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 탁 랄 분석 결과
<ol><li>교정 표준의 준비<ol>
<li>Using 랄 학년 물 900 µ L, CSE의 100 µ L, 많은 중간 희석 교정 0.001에서 1 EU/mL의 농도 범위와 표준의 준비를 활성화 하는 데 필요한 준비.</li>
		<li>첫 번째 튜브 라벨 고 각 관으로 랄 급 물 900 μ를 추가 합니다. 1EU/mL의 농도 함께 교정 표준 준비 10 EU/mL solutionn의 100 μ를 추가 합니다.</li>
		<li>3 더 낮은 교정 표준 준비 위에서 설명한 대로 직렬 10 희석을 반복 합니다. 1 EU/mL 0.001에서 배열 하는 4 개의 교정 표준 준비 된 확인 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>품질 컨트롤의 준비<ol>
<li>1 EU/mL CSE 솔루션의 50 µ L 랄 급 물 950 µ L 결합 하 여 0.05 EU/mL 품질 관리를 준비 합니다. 참고: 컨트롤 준비에 관한 자세한 토론 섹션을 참조 하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>금지/향상 (IEC) 컨트롤의 준비<ol>
<li>1 EU/mL CSE 솔루션의 25 µ L의 주어진된 희석에 테스트 접한 475 µ L를 결합 하 여 0.05 EU/mL의 농도와 IEC를 준비 합니다. 참고: 추가 정보에 대 한 토론 섹션을 참조 하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>실험 절차<ol>
<li>약 30 분 사전에 설정 하 여 워밍업 악기를 허용 합니다. 설정 검출 파장 660 nm이 탁도 랄에 대 한 적절 한입니다.</li>
		<li>사용자 이름 및 암호를 입력 하 여 로그인.</li>
		<li>컴퓨터 화면에 해당 아이콘을 클릭 하 여 소프트웨어 (테이블의 재료)를 엽니다.</li>
		<li>소프트웨어 홈 화면에 데이터 수집 을 선택 합니다. 일반 탭에서 해당 공간으로 홈 화면에 테스트 ID와 데이터 그룹 정보를 입력 합니다.</li>
		<li>하드웨어 탭을 클릭 하 여 드롭다운 메뉴에서 악기 종류를 선택 합니다.</li>
		<li>설정 검출 파장 660 nm이 적합 chosing에 의해 탁 랄 랄 탁도 방법.</li>
		<li>일련 번호, 시스템 ID 및 직렬 포트 정보는 화면에 표시를 확인 합니다. 확인을 클릭 합니다. 확인 한번 더 확인을 클릭 합니다.</li>
		<li>샘플 테스트는 동일한 순서에 샘플 ID를 입력 합니다. 기본 단추를 사용 하 여 부정적인 제어, 표준 곡선 및 테스트 샘플 입력.</li>
		<li>각 샘플에 대 한 중복 튜브를 준비 하 고 미리 레이블이 유리 튜브로 200 µ L (테스트 비율 4:1) 또는 부정적인 제어 (물), 교정 표준, 품질 관리, IEC 및 테스트 나노 100 µ L (테스트 비율 1:1)를 추가 합니다.</li>
		<li>첫 번째 테스트 유리병, 그것을 짧게, 그리고 테스트에 삽입 슬롯 악기 회전 목마에 소용돌이를 50 µ L (테스트 비율 4:1) 또는 LAL 시 약의 100 µ L (테스트 비율 1:1)를 추가 합니다. 1:1 비율을 사용 하는 경우 LAL 시 약의 볼륨은 100 µ L입니다.</li>
		<li>다른 샘플에 대 한 위에서 설명한 절차를 반복 합니다. 프로세스는 한 번에 하나씩 샘플링합니다. 참고: 자세한 내용은 토론 섹션을 참조 하십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 비 랄
<ol><li>교정 표준의 준비<ol>
<li>Using 랄 학년 물 900 µ L, CSE의 100 µ L, 많은 중간 희석 1 EU/mL의 농도와 교정 표준의 준비를 활성화 하는 데 필요한 준비.</li>
		<li>Using 900 µ L 랄 급 물과 표준 1 EU/mL 교정의 100 µ L, 0.1 EU/mL의 농도에서 두 번째 교정 표준 준비.</li>
		<li>두 더 낮은 교정 표준 준비 위에서 설명한 대로 직렬 10 희석을 반복 합니다. 1 EU/mL 0.001에서 배열 하는 4 개의 교정 표준 준비 된 확인 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>품질 컨트롤의 준비입니다.<ol>
<li>1 EU/mL CSE 솔루션의 50 µ L 랄 급 물 950 µ L 결합 하 여 0.05 EU/mL 품질 관리를 준비 합니다. 참고: 컨트롤 준비에 관한 자세한 토론 섹션을 참조 하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>금지/향상 (IEC) 컨트롤의 준비<ol>
<li>1 EU/mL CSE 솔루션의 25 μ 테스트 접한의 475 μ와 결합 하 여 0.05 EU/mL를 준비 합니다. 참고: 추가 정보에 대 한 토론 섹션을 참조 하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>실험 절차<ol>
<li>약 30 분 사전에 설정 하 여 워밍업 악기를 허용 합니다. 설정 검출 파장 405 nm이 탁도 랄에 대 한 적절 한입니다.</li>
		<li>컴퓨터 화면에 해당 아이콘을 클릭 하 여 소프트웨어를 엽니다. 사용자 이름 및 암호를 입력 하 여 로그인.</li>
		<li>소프트웨어 홈 화면에 데이터 수집 을 선택 합니다. 일반 탭에서 해당 공간으로 홈 화면에 테스트 ID와 데이터 그룹 정보를 입력 합니다.</li>
		<li>하드웨어 탭을 클릭 하 여 드롭다운 메뉴에서 악기 종류를 선택 합니다. 악기를 선택 하십시오.</li>
		<li>일련 번호, 시스템 ID 및 직렬 포트 정보는 화면에 표시를 확인 합니다. 확인을 클릭 합니다. 확인 한번 더 확인을 클릭 합니다.</li>
		<li>샘플 테스트는 동일한 순서에 샘플 ID를 입력 합니다. 기본 단추 부정적인 제어 입력을 사용 하 여 표준 곡선 및 테스트 샘플.</li>
		<li>각 샘플에 대 한 중복 튜브를 준비 하 고 미리 레이블이 유리 튜브로 200 µ L (테스트 비율 4:1) 또는 부정적인 제어 (물), 교정 표준, 품질 관리, IEC 및 테스트 나노 100 µ L (테스트 비율 1:1)를 추가 합니다.</li>
		<li>첫 번째 테스트 유리병, 그것을 짧게, 그리고 테스트에 삽입 슬롯 악기 회전 목마에 소용돌이를 50 µ L (테스트 비율 4:1) 또는 LAL 시 약의 100 µ L (테스트 비율 1:1)를 추가 합니다. 1:1 비율을 사용 하는 경우 LAL 시 약의 볼륨은 100 µ L입니다.</li>
		<li>다른 샘플에 대 한 위에서 설명한 절차를 반복 합니다. 프로세스는 한 번에 하나씩 샘플링합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 젤-응고 랄
참고:이 분석 결과 시각적 관찰 및 반응 관에 응고의 검출에 따라 샘플에서 독의 존재를 식별 합니다. 아래 실험 단계를 설명 합니다. 벤치 시트를 사용 하 여 결과 기록. 이 벤치 시트는 필수, 그리고 시험 결과 기록 하는 다른 방법을 받아들일 수 있습니다. 같은 벤치 시트의 예로 독자의 편의 위해 보충 자료 제공 됩니다. 람다 (l) 젤 응고 시험의 감도 이며 0.03 EU/mL입니다.
<ol><li>분석 된 테스트 샘플의 수를 수용 하는 데 필요한 많은 반응 튜브 라벨. 1 단계, 2 단계 분석 결과의 3 단계에서 사용 하는 복제의 수에 대 한 자세한 내용은 벤치 시트를 참조 하십시오.</li>
	<li>튜브 당 물, 컨트롤 또는 테스트 샘플의 aliquot 100 μ.</li>
	<li>최종 농도 4λ는 CSE를 준비 합니다.</li>
	<li>2λ의 CSE의 최종 농도 달성 하기 위해 물 또는 테스트 샘플의 100 μ와 위에서 언급 한 기준의 100 μ를 결합 한다. 람다와 반 람다 및 1/4 람다 3 번 이상 반복 합니다.</li>
	<li>물 목욕에서 온도 37 ° c.</li>
	<li>추가 테스트 튜브, 소용돌이 짧게 당 lysate의 100 μ 고 모든 튜브 랙 1 h 물 목욕 합니다.</li>
	<li>부드러운 모션으로 튜브를 반전.</li>
	<li>"+" (상사 병)를 사용 하 여 수동으로 레코드 결과 또는 "-" (응고 또는 느슨한 응고) 벤치 시트에.</li>
	<li>USP 내기 854에 따라 분석 하십시오; 벤치 시트를 사용 하 여 자료를 지원</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

이 프로토콜에서 제공 하는 정보15,26 전에 설명 하고있다 고는 미국 식품 의약품 안전 청은 미국 식약청 (FDA) 및 미국 약전 (USP)4 에 의해 게시 된 여러 규제 문서 , 5 , 6 , 27, 그리고 또한 NCL 웹사이트20 프로토콜 STE1.2 (탁도 랄), STE1.3 (젤 응고 랄)에 사용할 수 및 STE1.4 (비 랄).
테스트-나노 LAL 시 약 물 또는 살 균, pyrogen 무료 PBS에서 준비 된다. 연구 샘플의 산도 낮은 (< 6)와 높은 (> 8) pH는 lysate의 최적의 성...

내 그람 음성 세균 세포 벽1,2의 빌딩 블록 이다. 그것은 매우에 면역 세포를 활성화할 수 있습니다 (picogram) 농도1,2낮은. 셀 한도에 대 한 응답에 의해 생성 된 proinflammatory 중재자 (cytokines, leukotrienes, eicosanoids, 등) 발열, 저 혈압, 고혈압, 그리고 여러 기관 실패를 포함 하 여 더 심각한 건강 문제에 대 한 책임은 1 , 2 , 3. 면역 중재 측면-효과도 의해 실행의 심각도 내 구성과 구조에 의해 결정 고도 국제 단위 (IUs 또는 EUs)3에서 측정 된 힘에 따라 달라 집니다. 이러한 단위 몸 무게의 킬로그램 당 수는 내 화성 복용량을 임계값을 설정 하는 데 사용 됩니다. 이 복용량은 EU/5kg 약 제품에 대 한 관리 를 통해 intrathecal 경로 하지만 모든 노선. 몸 표면, 안구 내부 체액, 방사성 의약품, 및 intrathecal 경로 관리 를 통해 제품의 평방 미터 당 약을 복용 하는 약 있다 다른 임계값 화성 복용량은 100 EU/m2, 0.2 EU/mL, 175 EU/V (V가는 볼륨 관리를 위한 제품의), 그리고 0.2 EU/kg, 각각4. 다양 한 약품 및 장치에 대 한 임계값 화성 복용량에 대 한 자세한 내용은 제공 되 고 다른4,,56논의.
동물도 중재 반응에 그들의 감도에서 넓게 변화 한다. 인간, 비 인간 영장류, 그리고 토끼 독3가장 매우 민감한 종족 중입니다. 환자에도 중재 부작용을 피하기 위해 고의 전 임상 독성 및 효능 연구의 부정확 한 결론을 방지, 정확 하 게 감지 하 고 두 임상 및 전 임상 등급 정립에서 독을 계량 필수적 이다. 현재 사용할 수 있는 여러 가지 방법을이 작업을 달성할 수 있다. 그들 중 하나는 일반적으로 화면 생물 의학 제품에 잠재적인 내 오염 뿐만 아니라 세균 감염7,,89감지로 세계 전반 사용 Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) 분석 결과 이다. 셀 말굽 게 Limulus polyphemus 의 혈액에 존재 하는 lysate amoebocytes에서 준비 북미7대륙의 동쪽 해 안에 거주. 흥미롭게도, 말굽 게의 몇 가지 다른 종이 있다 (Tachypleus gigas 및 Tachypleus tridentatus) 아시아10. Tachypleus Amoebocyte Lysate (탈)도 다른 cuntries10에 랄을 사용 하는 방법을 유사한의 검출에 대 한 여러 아시아 국가에서 사용 됩니다. (랄 및 탈) lysates 포함 단백질 활성화 시 부여 하는 프로 테아 제 활동의 그룹. 이러한 단백질, 소위 요소 C 중 하나 내와 접촉 시 활성화 됩니다. 활성화 인자 C 앞 요소 B는 또한 차례 차례로 되는 효소 응고 효소를 생산 하는 프로 응고 효소를 앞. 반응의이 체인의 결과 젤, 샘플 탁도 하 고, 비 기질, 젤 응고, 탁도, 그리고 비 분석 실험을 위한 기초 역할을, 착 색된 제품의 외관의 존재 증가의 형성 각각. 산업 문서, 다른 랄 포맷 간의 테스트 결과에 주문서, 결정은 한다 젤 응고 분석 결과5 기반은 필수 랄 형식이, 미국 식품 및 의약품 안전 청 (FDA)에 대 한 지침에 설명 합니다. .
일반적으로 사용 되는 많은 실험실 화학 물질 (예., EDTA) 및 제품 (예: 페니실린) 방해 랄 알려진된 마약 분석 실험11. 방해는 일반적으로 테스트 자료를 포함 하는 솔루션으로 알려진된 농도에 아군도 표준의 복구를 평가 하 여 식별 됩니다. 스파이크 복구 50% 미만 또는 200% 이상에 대 한 분석 결과 LAL의 결과 다음 경우 주어진된 시험 체 억제 또는 향상, 각각4유효 하지 않습니다. 나노기술 기반 정립은 종종 복잡 하 고 메커니즘12,,1314의 다양 한 통해 랄을 방해. 많은 접근 방해를 극복 하기 위해 설명 되었습니다: 난방, 난방 및 과잉을 가진 샘플을 보완 하 여 지질 기반 투명 재료의 파괴에 의해 단백질 비활성화 특정 버퍼에 계면 활성 제, 샘플 재구성 divalent 양이온5,12,13,,1415. LAL 방해를 극복할 수 없을 때 상황에 대 한 대체 방법을 또한 설명 되었습니다: ELISA, HEK TLR4 기자 셀 라인 분석 결과, 및 질량 분석16,,1718, 19.
여기, 젤 응고, 탁도, 및 비 랄 분석 실험 수행에 대 한 실험 절차에 설명 되어 있습니다. 이 분석 실험 프로토콜 STE1.2 (탁도 랄), STE1.3 (젤 응고 랄)에 나노기술 특성화 연구소 (NCL) 웹사이트20 에서 사용할 수 있습니다 및 STE1.4 (비 랄). 같은 나노 제제의 특성을 두 개 이상 다른 포맷을 수행 하는 것이 좋습니다. 탁도 및 비 랄의 결과 동의 하지 않을 때 젤 응고 결과5를간주 됩니다. 두 랄 형식의 결과 동의 하는 경우21랄 확인 monocyte 활성화 테스트 (매트) 또는 토끼 pyrogen 테스트 (RPT)을 사용 하 여 연구 결과 추가 실시. 각 방법도 검색에 사용 되 고 pyrogenicity 평가 장점과 한계21,,2223,24에 중요 하다. 주어진된 나노기술 정립 하는 데 사용 하는 프로시저의 한계를 인식 그 나노 제제에 대 한 최적의 절차의 사용에 대 한 과학적 정당성을 얻기 위해 필수적 이다.
이 연구에서는 PEGylated 자주 독 소 루비 모델 나노 배합으로 사용 되었다. 이 1995 년에 미국 FDA에 의해 승인 하 고 암 환자 전세계25치료를 위해 사용.

<table><tbody><tr><td>탁도 LAL Assay</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide</td><td></td><td>Sigma S2770</td><td>필요한 경우 샘플 pH를 6-8</td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Sigma</td><td>H9892</td> 사이로 조정하는 데 사용됩니다. 필요한 <td>경우 샘플 pH를 6-8 LAL 사이로 조정하는 데 사용됩니다</td></tr>. <tr><td>Cape Cod</td><td>T0051</td>의 시<td>약</td><td>Associates 이 시약은 탁도와 함께 사용할 수 있습니다. 분석 전용</td></tr><tr><td>Control Endotoxin Standard</td><td>Associates of Cape Cod</td><td>E0005</td><td>이 시약은 탁도 및 겔 응고 분석과 함께 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>LAL grade water</td><td>Associates of Cape Cod</td><td>WP0501</td><td>이 시약은 모든 LAL 형식과 함께 사용할 수 있습니다</td></tr>. <tr><td>Glucashield Buffer</td><td>Associates of Cape Cod</td><td>GB051-25</td><td>베타 글루칸의 위양성 반응을 방지하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>일회용 내독소가 없는 유리 희석 튜브 12 x 75mm</td><td>Associates of Cape Cod</td><td>TB240</td><td>이 튜브는 세 가지 분석 모두와 함께 사용할 수 있습니다</td></tr>. 일회용 <tr><td>내독소가 없는 유리 반응 튜브 8 x 75mm</td><td>Associates of Cape Cod</td><td>TK100</td><td>이 튜브는 탁도 및 발색 분석과 함께 사용할 수 있습니다</td></tr>. 부피 <tr><td>0.25 및 1.0mL의 Pyrogen-free 팁</td><td>RAININ</td><td>PPT25, PPT10</td><td>팁과 피펫은 내독소를 흡착하고 LAL 분석을 방해하는 침출물을 방출할 수 있습니다. 이 RAININ 팁은 LAL 분석에서 최적의 성능을 발휘하는 것이 검증 및 확인되었기 때문에 사용됩니다</td></tr><tr><td>. Pyrogen-free microcentrifuge tube, 2.0 mL</td><td>Eppendorf</td><td>22600044</td><td>기타 동등한 소모품을 사용할 수 있습니다</td></tr>. <tr><td>Pyrogen-fee combitips, 5mL</td><td>Eppendorf</td><td>30089669</td><td>기타 동등한 소모품을 사용할 수 있습니다</td></tr>. <tr><td>반복 피펫터</td><td>Eppendorf</td><td>4982000020</td><td>다른 동등한 소모품을 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Microcetrifuge</td><td>모든 브랜드</td><td></td><td>모든 브랜드 사용 가능</td></tr><tr><td>냉장고, 2-8 C</td><td>모든 브랜드</td><td>모든 브랜드</td><td></td> 사용 가능</tr><tr><td>Vortex</td><td>모든 브랜드</td><td></td><td>냉</td></tr><tr><td>동고, -20 C</td><td>모든 브랜드</td><td>모든 브랜드</td><td></td> 사용 가능</tr><tr><td>Pyros Kinetix 또는 Pyros Kinetix Flex 리더</td><td>Associates of Cape Cod</td><td>PKF96</td><td>다른 악기를 사용할 수 있습니다. 그러나 이 분석에 사용된 LAL 시약 및 내독소 표준물질은 최적화가 필요할 수 있습니다. 다른 기기를 사용하는 경우 지침에 대해 기기 및 LAL 키트 제조업체에 문의하십시오</td></tr><tr><td>Chromogenic LAL Assay</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pyrochrome LAL Reagent</td><td>Associates of Cape Cod</td><td>CG1500-5</td><td>이 시약은</td></tr><tr><td>Cape Cod</td><td>EC010</td>의 Chromogenic Assay<td>Control Endotoxin Standard</td> Associates에 특이적입니다.<td>이 표준은 탁도 및 겔 응고 LAL에 사용되는 표준과 다릅니다. 발색 분석에서 최적의 성능을 발휘하도록 최적화되어</td></tr> 있습니다 <tr><td>수산화나트륨</td><td>시그마</td><td>S2770</td><td>필요한 경우 샘플 pH를 6-8</td></tr><tr><td>염산</td><td>Sigma</td><td>H9892</td> 사이로 조정하는 데 사용됩니다. 필요한 <td>경우 샘플 pH를 6-8</td></tr><tr><td>LAL 등급의 물로</td> 조정하는 데 사용됩니다. <td>Cape Cod</td><td>WP0501</td>의 동료 <td>이 시약은 모든 LAL 형식의</td></tr><tr><td>Glucashield Buffer와 함께 사용할 수 있습니다.</td><td>Associates of Cape Cod</td><td>GB051-25</td><td>베타글루칸의 위양성 반응을 방지하는 데 사용</td></tr><tr><td>일회용 내독소가 없는 유리 희석 튜브 12 x 75mm</td><td>Cape Cod</td><td>TB240</td>의 Associates <td>이 튜브는 세 가지 분석 모두와 함께 사용할 수 있습니다</td></tr>. 일회용 <tr><td>내독소가 없는 유리 반응 튜브 8 x 75mm</td><td>Cape Cod</td><td>TK100</td>의 Associates <td>이 튜브는 탁도 및 발색 분석과 함께 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>.0.25 및 1.0 ml 용량의 발열원이 없는 팁</td><td>, RAININ</td><td>PPT25, PPT10</td><td>팁 및 피펫은 내독소를 흡착하고 LAL 분석을 방해하는 침출물을 방출할 수 있습니다. 이 RAININ 팁은 LAL 분석에서 최적의 성능을 발휘하는 것이 검증 및 확인되었기 때문에 사용됩니다</td></tr><tr><td>. Pyrogen-free microcentrifuge tube, 2.0 mL</td><td>Eppendorf</td><td>22600044</td><td>기타 동등한 소모품을 사용할 수 있습니다</td></tr>. <tr><td>Pyrogen-fee combitips, 5mL</td><td>Eppendorf</td><td>30089669</td><td>기타 동등한 소모품을 사용할 수 있습니다</td></tr>. <tr><td>반복 피펫터</td><td>Eppendorf</td><td>4982000020</td><td>다른 동등한 소모품을 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Microcetrifuge</td><td>모든 브랜드</td><td></td><td>모든 브랜드 사용 가능</td></tr><tr><td>냉장고, 2-8 C</td><td>모든 브랜드</td><td>모든 브랜드</td><td></td> 사용 가능</tr><tr><td>Vortex</td><td>모든 브랜드</td><td></td><td>냉</td></tr><tr><td>동고, -20 C</td><td>모든 브랜드</td><td>모든 브랜드</td><td></td> 사용 가능</tr><tr><td>Pyros Kinetix 또는 Pyros Kinetix Flex 리더</td><td>Associates of Cape Cod</td><td>PKF96</td><td>다른 악기를 사용할 수 있습니다. 그러나 이 분석에 사용된 LAL 시약 및 내독소 표준물질은 최적화가 필요할 수 있습니다. 다른 기기를 사용하는 경우 지침에 대해 기기 및 LAL 키트 제조업체에 문의하십시오</td></tr><tr><td>Gel-Clot LAL Assay</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LAL Reagent</td><td>Associates of Cape Cod</td><td>G5003</td><td>이 시약은 겔-응고 분석에 특이적입니다.</td></tr><tr>Control<td>Endotoxin Standard</td><td>Associates of Cape Cod</td><td>E0005</td><td>이 시약은 탁도 및 겔-응고 분석과 함께 사용할 수 있습니다</td></tr>.<tr><td>수산화나트륨</td><td>시그마</td><td>S2770</td><td>필요한 경우, 샘플 pH를 6-8</td></tr><tr><td>염산</td><td>시그마</td><td>H9892</td> 사이로 조정하는 데 사용됩니다. 필요한 <td>경우, 샘플 pH를 6-8</td></tr><tr><td>LAL 등급 물</td> 사이로 조정하는 데 사용됩니다. <td>케이프 코드</td><td>WP0501</td>의 동료 <td>이 시약은 모든 LAL 형식</td></tr><tr><td>Glucashield Buffer</td><td>Associates of Cape Cod</td><td>GB051-25</td><td>와 함께 사용할 수 있습니다.베타글루칸의 거짓 양성 반응을 방지하기 위해 사용</td></tr><tr><td>일회용 내독소가 없는 유리 희석 튜브 12 x 75 mm</td><td>Cape Cod</td><td>TB240</td>의 Associates <td>이 튜브는 세 가지 분석 모두와 함께 사용할 수 있습니다</td></tr>. <tr><td>일회용 내독소가 없는 유리 반응 튜브 10 x 75 mm</td><td>Cape Cod</td><td>TS050</td>의 Associates <td>이 튜브는</td></tr><tr><td>0.25 및 1 mL 용량의 젤-응고 분석 Pyrogen-free 팁</td>과 함께 사용하기 위한 것입니다. <td>RAININ</td><td>PPT25, PPT10</td><td>팁 및 피펫은 내독소를 흡착하고 LAL 분석을 방해하는 침출물을 방출할 수 있습니다. 이 RAININ 팁은 LAL 분석에서 최적의 성능을 발휘하는 것이 검증 및 확인되었기 때문에 사용됩니다</td></tr><tr><td>. Pyrogen-free microcentrifuge tube, 2.0 mL</td><td>Eppendorf</td><td>22600044</td><td>기타 동등한 소모품을 사용할 수 있습니다</td></tr>. <tr><td>Pyrogen-fee combitips, 5mL</td><td>Eppendorf</td><td>30089669</td><td>기타 동등한 소모품을 사용할 수 있습니다</td></tr>. <tr><td>반복 피펫터</td><td>Eppendorf</td><td>4982000020</td><td>다른 동등한 소모품을 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Microcetrifuge</td><td>모든 브랜드</td><td></td><td>모든 브랜드 사용 가능</td></tr><tr><td>냉장고, 2-8 C</td><td>모든 브랜드 모든 브랜드</td><td></td><td>사용</td></tr><tr><td>가능 Vortex</td><td>모든 브랜드</td><td>모든 브랜드</td><td></td> 냉</tr><tr><td>동고, -20 C</td><td>모든 브랜드</td><td>모든 브랜드</td><td></td> 사용 가능</tr><tr><td>수조, 37 C</td><td>모든 브랜드</td><td></td><td>모든 브랜드를 사용할 수 있지만 물의 흐름이 응고 형성에 영향을 미치고 위음성 결과를 초래할 수 있으므로 물 순환을 끄거나 비순환 수조를 사용하는 것이 중요합니다</td></tr></tbody></table>

나노 제형에도 limulus amoebocyte lysate (lal) 분석 실험을 사용 하 여

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

제약 제품에 존재 하는 경우 (종종 라고도 lipopolysaccharide) 그람 음성 세균의 세포 벽 구성 요소 내 염증, 발열, 저자 또는 고혈압, 발생할 수 있습니다. 그리고, 극단적인 경우에 수 있습니다. 조직 및 장기 손상으로 이어질 수 있습니다. 치명적 된다. 따라서, 제약 제품에도의 양은 엄격 하 게 통제 된다. 도 탐지 및 정량화에 대 한 사용할 수 있는 방법, 중 Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) 분석 결과 주로 세계적으로 사용 됩니다. 어떤 제약 제품 랄 분석 결과 방해할 수 있습니다, 하는 동안 나노-공식 그들의 복잡으로 인해 특정 도전을 나타냅니다. 이 문서의 목적은 연구 설계 나노 소재 및 나노 공식화 약물 독 추정에 미숙한 실용적인 가이드를 제공 하. 여기, 탁도, 발을 포함 한 세 랄 포맷 응고 젤 분석 실험을 수행 하기 위한 실질적인 권장 사항은 설명 합니다. 이 분석 실험 나노기술 기반 약물 제품, 백신, 그리고 adjuvants 내 오염 확인을 사용할 수 있습니다.

LAL 분석 실험에서이 테스트 한 후 생성 된 데이터의 예는 표 1에 표시 됩니다. PEGylated 자주 독 소 루비 5 희석에서 비 랄와 방해. 그러나,이 간섭 큰 희석에 의해 극복 됐다. 50과 200% 사이 스파이크 복구 때이 희석 탁 랄에에서 5에서 뿐만 아니라 희석 50 및 탁도 및 비 랄, 500에서 테스트 되었습니다. 희석 비율 조정, 결과 두 분석 실험에 희석 사이 일관 했다. 또한, 결과 세 가지 분석 결과 형식 사이 일관 했다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>테스트 샘플</td>
			<td>탁도 랄, EU/mg (스파이크 복구, %)</td>
			<td>비 랄, EU/mg (스파...

조작된 nanomaterials에 독의 검출 nanomedicine 분야에서 대상 과제 중 하나를 나타냅니다. 여기, 우리는 나노 입자에서 잠재적인 내 오염 추정 세 가지 다른 랄 형식으로 구성 된 프레임 워크를 설명 하는 사례 연구를 제시.

나노 제형에도 Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) 분석 실험을 사용 하 여

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

이 방법은 나노 의약품의 안전에 대한 의료 분야에서 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 장점은 표준이며, 나노 의약품에 제품의 평가를 위해 전 세계적으로 사용된다는 것입니다. 절차의 데모, 배리 Neun 될 것입니다, 나노 기술 특성화 연구소에서.교정 표준 준비를 위해 리무저 아메보시테 용액 또는 LAL 급수 의 900 마이크로 리터를 사용하십시오. 그리고 100 마이크로리터의 제어 표준 내독소, 필요에 따라 많은 중간 희석제를 제조하고, 밀리리터당 하나의 내독소 단위의 농도로 교정 표준의 준비를 가능하게 한다. 그런 다음 LAL 급수 900 마이크로리터와 밀리리터 교정 표준당 하나의 내독소 단위의 100 마이크로리터를 사용하여 밀리리터당 0.1 엔도독신 단위의 농도로 두 번째 교정 표준을 준비한다.그런 다음 두 개의 낮은 교정 표준을 준비하기 위해 직렬 열배도 희석을 반복합니다. 밀리리터당 0001에서 1개의 내독소 단위에 이르기까지 총 4개의 교정 표준을 얻으려면. 밀리리터 품질 관리당 05 엔도독신 유닛을 준비하기 위해, 제어 표준 엔도독신 용액의 밀리리터 당 하나의 엔도독소 유닛 의 50 마이크로리터와 LAL 급 수의 950 마이크로리터를 결합합니다.다음으로 소프트웨어에서 계측기 설정을 선택하고 템플릿을 만듭니다. 데이터 수집을 선택하고 일반 탭에서 테스트 ID 및 데이터 그룹을 입력합니다. 하드웨어 탭에서 계측기 유형 및 LAL 메서드를 선택하고 일련 번호, 시스템 ID 및 직렬 포트 정보가 화면에 나타나는지 확인합니다.기기 선택 및 계측기와의 통신을 확인하기 위해 두 번 확인을 클릭하고 샘플 ID를 테스트하는 것과 동일한 순서로 샘플 ID를 입력합니다. 그런 다음 기본 단추를 사용하여 음수 제어 표준 곡선을 입력하고 샘플을 테스트합니다. 음의 제어 교정 표준의 적절한 볼륨을 추가하고 품질 관리를 중복 사전 표지 유리 튜브에 추가합니다.그리고 첫 번째 테스트 사악한에 LAL의 적절한 볼륨을 추가합니다. 사악한 것을 간략하게 소용돌이치게 하고, 유리병을 악기 회전 목마의 적절한 테스트 슬롯에 넣습니다. 시료를 적재하기 전에 입증된 바와 같이 최대 유효 희석 내에서 테스트 나노 물질의 여러 희석을 수행합니다.억제 강화 제어의 밀리리터 당 05 엔도독신 유닛을 제조하려면, 주어진 희석에서 테스트 나노 물질의 475 마이크로리터와 대조표준 엔도독신 용액의 밀리리터 당 하나의 엔도독소 단위의 25 마이크로리터를 결합한다. 소용돌이 후 적절한 혁신 향상 컨트롤과 비스파이크 스터디 샘플을 계측기에 적재합니다. 그런 다음 알리쿼트 가시가 없는 나노 물질을 특정 희석에서 미리 표지된 튜브로 분리합니다.소용돌이하기 전에 계측기 회전 목마에 적재하십시오. Gel-Clot LAL을 수행하기 위해 제어 표준 내독소를 4개의 람다의 최종 농도로 준비하고 100마이크로리터의 물 또는 테스트 샘플을 결합하여 제어 표준 내독신 2개의 람다의 최종 농도를 달성한다. 각 람다 희석에 100 마이크로리터의 리신을 추가합니다.튜브를 잠시 소용돌이쳐 튜브 랙을 섭씨 37도의 수조에 1시간 동안 넣습니다. 인큐베이션의 끝에서, 부드러운 움직임으로 튜브를 반전하고, 수동으로 단단한 응고에 대한 플러스를 사용하여 결과를 기록하고, 응고, 또는 느슨한 응고에 대한 마이너스. 본 대표적인 분석에서, PEGylated 리포소루비신은 희석 5에서 염색체 LAL을 방해했지만, 그러나 이 간섭은 더 높은 희석에서 극복되었다.스파이크 회수는 식도 및 염색체 LAL에서 50 및 500의 희석성 및 희석 5에서, 그리고 탁도 LAL에서 제형이 시험되었을 때 50과 200% 사이였다. 희석 계수에 의해 조정될 때, 결과는 두 에세이의 망상 사이에서 일치했습니다. 또한, 결과는 세 가지 에세이 형식 사이에 일치했다.각 샘플에는 자체 희석 범위가 있으며, 각 LAL 형식은 독신및 용해에서 제어 표준을 사용하고, 희석을 준비하고 각 LAL 에세이마다 다른 반응을 수행하는 데 사용되는 튜브를 사용한다는 것을 기억하십시오. 이 절차의 경우 그 개발 후 물질에 대한 추가 질문에 답하기 위해 수행 될 수 있으며,이 기술은 인간에서 제조 된 나노 기술의 의료 응용 프로그램을 탐구하고, 비 인간 영장류, 토끼, 개 및 쥐를 포함하되 이에 국한되지 않는 임상 모델을 모색하기 위해 봉합사 및 나노 의학 분야에 대한 길을 열어주었습니다. 독신을 다루는 것은 매우 위험할 수 있으며 개인 보호 장비를 착용하는 것과 같은 예방 조치는 항상이 절차를 수행하는 동안 취해야한다는 것을 잊지 마십시오.

detection-endotoxin-nano-formulations-using-limulus-amoebocyte-lysate

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

이 비디오는 PEGylated 리포솜 독소루비신 나노 제형에서 내독소 오염을 추정하기 위한 Limulus amoebocyte lysate(LAL) 분석의 탁도 측정 형식을 설명합니다. 내독소와 LAL 시약의 반응에 따른 용액의 탁도는 샘플의 내독소를 추정하는 데 도움이 됩니다.

탁도 측정 Limulus Amoebocyte 용해물 분석: 나노 제형 약물에서 내독소 오염을 검출하고 정량화하는 기술

이 비디오는 투구게의 혈액 세포에서 유래한 Limulus Amoebocyte Lysate를 사용하여 나노 제형에서 박테리아 내독소의 존재를 결정하기 위한 겔 응고 분석에 대해 설명합니다. 이 분석은 나노 기반 제형을 포함한 의약품의 내독소 오염을 테스트하는 데 도움이 됩니다.

Gel-Clot Limulus Amoebocyte Lysate Assay: 나노 입자 제형에서 박테리아 내독소 검출 방법

이 비디오는 대식세포에서 전사 인자인 핵인자-카파-B(NF-κB) 및 활성인자 단백질-1(AP-1)의 톨-유사 수용체(TLR) 의존적 활성을 조사하는 분석을 보여줍니다. TLR은 손상 관련 분자 패턴(DAMP)을 인식하면 전염증 신호 연쇄 반응을 유발하여 NF-κB 및 AP-1을 활성화합니다. 공학적 리포터 대식세포는 NF-κB 및 AP-1 활성화 시 분비 배아 알칼리 인산가수분해효소(SEAP)를 생성하며, 이는 발색 반응을 통해 검출됩니다.

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이 비디오는 TLR(Toll-like receptor) 신호 전달을 억제하는 잠재적인 생체 활성 나노 입자를 스크리닝하기 위한 리포터 세포 기반 분석을 보여줍니다. 이 분석은 펩타이드-금 나노입자 하이브리드와 혼합된 지질다당류(LPS)를 리포터 단백질인 분비 배아 알칼리 인산가수분해효소(SEAP) 및 루시페라아제(luciferase)를 발현하는 리포터 대식세포에 도입하는 것을 포함합니다. 하이브리드에 의해 매개되는 LPS 유도 TLR 신호의 감소는 리포터 신호를 측정하여 결정됩니다.

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우리는 인간 전혈 샘플의 내독소 활성을 침대 옆에서 측정하는 프로토콜을 제시한다. 내독소 활성 분석실험은 수행하기 위한 간단한 검사이며 패혈증을 가진 중증 환자에서 유용한 바이오마커일 수 있다.

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