Name: 인간 다능성 줄기 세포를 간 세포로 효율적으로 분화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-11T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: 배우세요 인간 다능성 줄기 세포에서 18일 만에 고순도 간세포 유도 분화 기술을. 혈청 없는 배지와 발달 신호 경로 제어를 통해 재생의학 연구에 활용 가능한 간 전구세포와 간세포 유사세포를 효율적으로 생성하는 방법입니다.

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우리는 토론과 줄기 세포 생물학 & 인프라 지원을위한 재생 의학에 대한 스탠포드 연구소 빙 림 에게 감사드립니다. 이 작품은 재생 의학에 대한 캘리포니아 연구소에 의해 지원되었다 (DISC2-10679) 스탠포드 - UC 버클리 시벨 줄기 세포 연구소 (L.T.A. 및 K.M.L.에) 분자 및 유전 의학뿐만 아니라 익명에 대한 스탠포드 베크만 센터, 박스터와 디제노바 가족 (K.M.L.에).

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저자는 공개 할 것이 없다.

이 방법은 hPSCs에서 간 꽃 봉오리 선조, 그리고 이후에 간세포 와 같은 세포의 농축 된 집단의 생성을 가능하게합니다. 인간 간 세포의 풍부한 인구를 생성 하는 능력은 이러한 세포의 실제적인 활용에 대 한 중요 하다. hPSCs로부터 간세포를 생성하는 이전 방법은 설치류로 이식시, 간 조직15이외에 뼈와 연골을 산출하는 간 및 비간 세포를 모두 포함하는 불순한 세포 집단을 산출하였다. 따라서 비 간 분화의 명시적 억제는 다양한 응용 프로그램에 적합 할 수있는 풍부한 간 인구를 생성하는 것이 중요합니다.
특히, 첫 번째 단계에서 hPSCs의 제어된 도금은 효율적인 다운스트림 분화를 위해 필수적입니다. 분화를 위해 특정 밀도로 hPSC를 정확하게 플레이트하고 도금 공정 중에 이러한 hPSCs를 웰 또는 플레이트에 고르게 분배하는 것이 중요합니다. 예를 들어, 12웰 플레이트의 각 웰에 대해, 웰당 160,000~ 250,000 hPSCs...

이 프로토콜의 목적은 인간 다능성 줄기 세포(hPSCs)를 간 싹 선조 및 간세포 유사 세포의 농축된 집단으로 효율적으로 분화하는 것입니다 2. 인간의 간 전구체와 간세포 같은 세포의 준비 공급에 대한 액세스는 간 기능 과 질병을 조사하기위한 노력을 가속화하고 간부전을위한 새로운 세포 이식 치료를 가능하게 할 수 3,4, 5. 이것은 hPSCs (배아 및 유도 만능 줄기 세포를 포함하는)가 인체의 모든 세포 유형으로 분화 할 수 있기 때문에 과거에 도전적인 것으로 입증되었습니다. 결과적으로, 간세포6과같은 단일 세포형의 순수한 집단으로 이들을 독점적으로 분화하는 것이 어려웠다.
hPSCs를 간 세포로 정확하게 분화하려면 먼저 간 세포가 지정되는 방법뿐만 아니라 비 간 세포 유형이 어떻게 발달하는지 이해하는 것이 중요합니다. 비간 세포가 어떻게 발달하는지에 대한 지식은 분화 동안 비 간 혈통의 형성을 논리적으로 억제하는 것이중요하며, 따라서 독점적으로 간 운명을 향한 hPSCs를 유도2. 둘째, hPSC가 간 운명을 향해 차별화되는 다중 발달 단계를 묘사하는 것이 필수적입니다. hPSC는 간세포 유사 세포(HEP)를 형성하기 전에 원시적 줄무늬(APS), 최종 내배엽(DE), 후방 포구트(PFG) 및 간 꽃봉오리 전구(LB)로 알려진 여러 세포 유형으로 순차적으로 분화하는 것으로 알려져 있습니다. 이전 작품은 각 발달 혈통 선택 2에서 간 운명을 지정하는 신호와 대체 비 간 세포 유형 (위, 췌장 및 장 전구체 포함)의 형성을 억제한 신호를 밝혀냈습니다2. 7명 , 8.
전체적으로, 이러한 통찰력은 원시적 인 줄무늬, 최종 내배엽, 후방 포레트, 간 싹 선조 및 마지막으로, 간 세포형 세포2를 향해 hPSCs를분화하는 무혈청, 단층 방법을 초래하였다. 전반적으로 방법은 적절한 밀도에서 단층에서 hPSCs의 시드를 포함, 분화 매체의 여섯 칵테일을 준비 (다양한 발달 신호 경로를 조절 성장 인자와 작은 분자를 포함), 순차적으로 이들 매체를 첨가하여 18일의 과정을 통해 분화를 유도한다. 이 과정에서 세포를 통과하지 못했습니다. 참고로, 이 방법은 비간 세포 유형의 형성을 억제하는 신호를 명시적으로 포함하기 때문에, 이 분화 접근법1은 현존하는 세포에 비해 간 전구체및 간세포 유사 세포를 보다 효율적으로 생성합니다. 차별화 방법2,9,10,11,12. 더욱이, 이 본문에 기술된 프로토콜은 궁극적으로 다른 프로토콜 9,10에 의해 생성된 것보다 더 높은 수준의 간 전사 인자와 효소를 발현하는 간세포의 빠른 생성을 가능하게한다. , 11세 , 12.
여기에 설명된 프로토콜은 현재 의분화 프로토콜에 비해 특정 한 장점이 있습니다. 첫째, hPSCs의 단층 분화는 배아체(13)에 의존하는 것과 같은 3차원 분화 방법에 비해 기술적으로더 간단하다. 둘째, 이 방법은 최근 진행된 사전을 통해 최종 내배엽 세포(간 세포의 초기 전구체)가 hPSC 분화2,7일이내에 효율적이고 빠르게 생성될 수 있어 후속 세포가 가능하도록 한다. 순도가 증가한 간세포 의 생산. 셋째, 나란히 비교에서, 이 방법에 의해 생성된 간세포형 세포2는 다른 방법에서 생성된 간세포에 비해 더 많은 ALBUMIN을 생성하고 더 높은 수준의 간 전사 인자와 효소를 발현한다10, 11,12.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; Geltrex</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>A1569601</td><td></td></tr><tr><td>1:1 DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>0.2&nbsp; &뮤; m pore membrane filter</td><td>Millipore</td><td>GTTP02500</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>Thiazovivin</td><td>Tocris Bioscience</td><td>3845</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Accutase</td><td>Gibco 또는 Millipore&nbsp;</td><td>Gibco A11105, 밀리포어&nbsp; SCR005</td><td></td></tr><tr><td>IMDM, 글루타맥스&트레이드; Thermofisher</td><td>Scientific</td><td>31980030</td><td></td></tr><tr><td>Ham's F-12 영양 혼합물, GlutaMAX&trade; 보충제</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>31765035</td><td></td></tr><tr><td>KOSR, 녹아웃 세럼 대체품</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>Poly(비닐 알코올)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp; &nbsp;</td><td>P8136</td><td></td></tr><tr><td>트랜스퍼린&nbsp;</td><td>시그마-알드리치&nbsp; &nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10652202001 화학적으로 정의된 지질 농축액</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>11905031</td><td></td></tr><tr><td>Human Activin</td><td>R& D</td><td>338-AC</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99201</td><td>토크리스</td><td>4423</td><td></td></tr><tr><td>PI103</td><td>토크리스</td><td>2930/1</td><td></td></tr><tr><td>인간 FGF2</td><td>R& D</td><td>233-FB</td><td></td></tr><tr><td>DM3189</td><td>토크리스</td><td>6053/10</td><td></td></tr><tr><td>A83-01</td><td>토크리스</td><td>2939/10</td><td></td></tr><tr><td>인간 BMP4</td><td>R& D</td><td>314-BP</td><td></td></tr><tr><td>C59</td><td>토크리스</td><td>5148</td><td></td></tr><tr><td>TTNPB</td><td>토크리스</td><td>0761/10</td><td></td></tr><tr><td>포스콜린</td><td>토크리스</td><td>1099/10</td><td></td></tr><tr><td>온코스타틴 M</td><td>R& D</td><td>295-OM</td><td></td></tr><tr><td>덱사메타손</td><td>토크리스</td><td>1126</td><td></td></tr><tr><td>Ro4929097</td><td>Selleck Chem</td><td>S1575</td><td></td></tr><tr><td>AA2P</td><td>케이맨 화학물질</td><td>16457</td><td></td></tr><tr><td>인간 재조합 인슐린</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp; &nbsp;</td><td>11061-68-0</td><td></td></tr></tbody></table> 년

인간 다능성 줄기 세포를 간 세포로 효율적으로 분화

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

간은 유해 물질을 해독하고, 중요한 단백질을 분비하며, 주요 대사 활동을 실행하여 생명을 유지합니다. 따라서 만성 알코올 섭취, 간염, 급성 중독 또는 기타 모욕으로 인해 발생할 수 있는 간 부전은 출혈, 황달, 혼수 상태 및 결국 사망에 이르는 심각한 상태입니다. 그러나, 간 기능 및 질병의 연구 뿐만 아니라 간 부전을 치료 하는 접근, 인간의 간 세포의 풍부한 공급의 부족에 의해 부분적으로 stymied 되었습니다. 이를 위해 이 프로토콜은 인간 다능성 줄기 세포(hPSCs)를 간세포와 같은 세포로 효율적으로 분화하는 것을 상세히 설명하며, 6개의 연속적인 분화 단계에 걸쳐 간 운명이 어떻게 지정되는지를 설명하는 개발 로드맵에 의해 안내된다. 간 분화를 촉진하고 원치 않는 세포 운명의 형성을 명시적으로 억제하기 위해 발달 신호 경로를 조작함으로써,이 방법은 효율적으로 일 6에 의해 인간의 간 꽃 봉오리 선조와 간세포 같은 세포의 인구를 생성 PSC 차별화의 18. 이것은 혈청이 없는 배양 매체에 있는 작은 분자 그리고 성장 인자에 의해 발휘된 발달 신호 통로의 시간적으로 정확한 통제를 통해 달성됩니다. 이 시스템의 분화는 단층에서 발생하고 특징적인 간세포 효소를 발현하고 만성 간 기능 부전의 마우스 모델을 생착시키는 능력을 가진 간세포와 같은 세포를 산출합니다. 효율적으로 생체 외에서 인간의 간 세포의 큰 숫자를 생성 하는 능력은 간 부전의 치료에 대 한 파급 효과, 약물 검사에 대 한, 그리고 간 질환의 기계론 연구에 대 한.

APS 분화의 24 시간 후에, 식민지는 일반적으로 hPSC 식민지를 할례하는 밝은 경계의 손실과 수반되는 미분화 콜로니와는 다른 형태를 채택할 것입니다. 형태학적으로, 원시 줄무늬 세포는 일반적으로 비정형 테두리를 가지고 있으며 hPSCs보다 더 많이 퍼지고 덜 컴팩트합니다 -이것은 다능성 epiblast 세포가 원형으로 분화하고 침투함에 따라 상피 - 중간엽 전이를 연상시킵니다. 생체 내에서 줄무늬. 분화 전에 hPSCs의 콜로니 크기가 너무 크면, 미분화 세포를 포함하는 과도하게 제기된 중심이 있을 것이다. 이러한 큰 덩어리를 포함하는 배양은 버려야 하며, 이 미분화된 식민지 중심은 후속의 분화를 혼동할 것이다. 정확한 크기 및 밀도의 덩어리가 도금된 경우, APS 분화는 매우 재현성이 높고 균일하며, 99.3±0.1% MIXL1-Gfp+ 원시 줄무늬 집단(MIXL1은 원시 줄무늬 마커)을 생성한다. 일부 ...

이 프로토콜은 18일 만에 인간 만능 줄기 세포(hPSCs)로부터 간세포 유사 세포를 효율적으로 생성하는 단층, 무혈청 방법을 상세히 기술한다. 이것은 hPSCs가 간세포 같이 세포를 형성하기 전에 원시적인 선미, 결정적인 내배엽, 후방 포인및 간 싹 선조와 같은 중간 세포 모형으로 순차적으로 분화하는 것과 같이 6단계를 수반합니다.

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

이 방법은 높은 순도인간 간싹 선조및 간세포 같이 세포의 다수의 생성을 가능하게 합니다. 이 간 세포를 생성하는 기능은 재생 의학 및 그밖 필드에 중요할 수 있었습니다. 간 분화를 촉진하고 원치 않는 세포 유형의 형성을 억제하기 위해 발달 신호 경로를 제어함으로써,이 방법은 각각 분화의 6 및 18 일에 의해 인간 간 새싹 선조및 간세포 와 같은 세포의 효율적인 생성을 가능하게한다.이 기술의 주요 장점은 생성 된 인간 간 세포의 높은 순도이다. 이 절차이기 위해 교반 바가 들어 있는 원추형 플라스크에 50밀리리터의 IMDM을 추가합니다. 중간 을 섭씨 50도까지 가열하고 0.5 그램의 PVA를 추가하면서 지속적으로 교반하여 밀리리터 당 10 밀리그램의 농도로 PVA 스톡을 준비합니다.그런 다음 가열 패드에서 PVA 용액을 제거하고 실온으로 냉각할 수 있습니다. 용액이 냉각되면 멸균, 0.2 마이크로미터 필터를 통해 필터링합니다. 텍스처 프로토콜 중 하나에 설명된 대로 필터링된 PVA와 다른 시약을 결합하여 CDM2 및 CDM3를 준비합니다.멸균, 0.2 마이크로미터 필터를 사용하여 모든 미디어를 필터링합니다. 그런 다음 표에 설명된 대로 나머지 기본 미디어인 CDM4 및 CDM5를 텍스트 프로토콜 중 하나에 준비합니다. 분화 매체를 준비하려면 먼저 실온에서 냉동 된 작은 분자 및 / 또는 성장 인자를 해동하십시오.Aliquot는 필요한 양의 염기 배지를 내분하고 지정된 소분자 및 성장 인자를 적절한 농도에서 기저 배지에 첨가한다. 사용하기 전날, 섭씨 4도에서 매트릭스를 해동하십시오. 다음 날, 500 마이크로리터의 매트릭스를 콜드 DMEM 50 밀리리터에 추가하여 1대 100의 비율로 매트릭스를 희석시하십시오.희석된 매트릭스를 우물 표면을 덮기 위해 충분한 양의 용액을 사용하여 필요한 수의 우물로 파이펫을 넣습니다. 매트릭스 코팅 플레이트를 섭씨 37도에서 인큐베이터로 최소 60분간 옮김합니다. 파종 직전에 코팅된 우물에서 나머지 매트릭스 용액을 흡인합니다.그런 다음, 크게 수렴 hPSC 배양 플레이트에서 배지를 흡인하고 상업적으로 구입 한 해리제를 추가하여 세포가 성장하는 표면을 덮기 위해 충분히 사용해야합니다. 해리 에이전트에서 hPSC를 5분 동안 섭씨 37도에서 또는 일부 식민지가 분리되기 시작할 때까지 hPSC를 배양합니다. 다음으로 DMEM 및 F-12를 추가하여 해리제를 희석시합니다.5 밀리리터

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 문서는 인간의 배아 줄기 세포 집단에서 인간 간장 endoderm의 생성에 초점을 맞출 것이다.

인간 배아 줄기 세포 인구에서 Hepatocyte 같은 전지의 강력한 생성

여기에 제시된 방법은 다 능성 줄기 세포로부터 인간 간세포 - 유사 세포를 생성하기 위해 확장 및 우수 제조 기준 (GMP) 레디 분화 시스템을 설명한다. 이것은 기초 및 응용 연구 인간 간 인간 간세포 - 유사 세포를 생성하기위한 비용 효과적이고 표준화 된 시스템으로서 작용한다.

정의 및 간세포와 같은 세포의 확장 성 생성 인간 다 능성 줄기 세포에서

여기에 제시 된 프로토콜 간 질환의 치료에 대 한 작은 분자를 식별 하기 위한 플랫폼을 설명 합니다. 단계별 설명 Ipsc 96 잘 접시에서 hepatocyte 특성을 가진 세포로 분화 하 고 작은 분자에 대 한 잠재적인 치료 활동 화면 셀을 사용 하는 방법을 자세히 제시 합니다.

약물 발견에 대 한 만능 줄기 세포 유래 Hepatocyte 같은 세포를 유도 하는 인간을 사용 하 여

여기, 우리 현재 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 hepatocytes를 사용 하 여 가족성 콜레스테롤 혈 증의 인간 간 공상 마우스 모델을 생성 하는 프로토콜. 콜레스테롤 혈 증에 대 한 새로운 치료법을 테스트 하기 위한 유용한 모델입니다.

가족성 콜레스테롤 혈 증 인간의 간 공상 마우스 모델을 사용 하 여 유도 만능 줄기 세포 유래 Hepatocytes

이 프로토콜에는 hepatocyte 같은 셀 96 잘 접시 형태로 인간의 pluripotent 줄기 세포에서 생산 하는 반자동된 접근 방식을 설명 합니다. 이 프로세스는 신속 하 고 비용 효율적인, 품질의 생산 기초 및 응용 연구를 인간의 hepatocyte 같은 셀 배치를 안심 수 있도록 합니다.

만능 줄기 세포에서 세포 처럼 Hepatocyte의 반자동된 생산

이 프로토콜은 정의된 배양 시스템 및 세포 자가 조립을 사용하여 인간 다능성 줄기 세포로부터 간구를 생성하는 접근법을 기술한다. 이 프로토콜은 다수의 세포주에서 재현가능하고 비용 효율적이며 생체 의학 적용을 위한 안정적인 인간 간구의 생산을 허용합니다.

다능성 줄기 세포에서 3차원 인간 간구의 혈청 무료 생산

이 문서의 목표는 만능 줄기 세포로부터 인간 간 선구분화를 유도하는 표준화된 접근법을 제공하는 것입니다. 즉시 사용 가능한 미디어 제형이 있는 이 절차의 개발은 사용자에게 생체 의학 연구 및 번역을 위한 인간 간 세포를 생성하는 촉진 시스템을 제공합니다.

정의된 분화 시스템을 사용하여 만능 줄기 세포에서 간 선조 사양

이 원고는 hESC 분화 시 활성A및 CHIR99021을 최종 엔도덤(DE)으로 분화하여 인간 배아 줄기 세포(hESC)를 기능성 간세포와 같은 세포(HLC)로 분화하기 위한 상세한 프로토콜을 설명합니다.

인간 배아 줄기 세포에서 헤파토세포와 같은 세포 유도를 위한 효율적인 방법

여기에서 우리는 정상 상태 말초 혈액에서 분리된 단핵 세포를 사용하여 인간 자가 간 스페로이드를 생성하는 비유전적 방법을 제시합니다.

간 질환 연구를 위한 말초 혈액의 인간 간 스페로이드

만능 줄기 세포에서 유래한 간세포는 미토콘드리아 및 활성 백혈구 세포 접착 분자(ALCAM, CD166이라고도 함) 염색을 사용하여 세포 분류를 통해 정제할 수 있습니다.

인간 유도 만능 줄기 세포에서 유래한 간세포를 정제하기 위한 세포 분류에 살아있는 미토콘드리아 염색 적용

사용 가능한 만능줄기세포(PSC)-기능성 세포 분화 시스템은 현재 심각한 line-to-line 및 batch-to-batch 변동성 문제로 인해 어려움을 겪고 있습니다. 여기에서는 심장 분화를 주요 예로 사용하여 이미지 기반 기계 학습을 기반으로 PSC 분화 과정을 지능적으로 모니터링하고 조절하는 프로토콜을 제시합니다.

만능줄기세포 분화를 모니터링하기 위한 살아있는 세포 이미지 기반 기계 학습 전략

배우세요 인간 다능성 줄기 세포에서 18일 만에 고순도 간세포 유도 분화 기술을. 혈청 없는 배지와 발달 신호 경로 제어를 통해 재생의학 연구에 활용 가능한 간 전구세포와 간세포 유사세포를 효율적으로 생성하는 방법입니다.

인간 다능성 줄기 세포를 간 세포로 효율적으로 분화

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