인간 배아 줄기 세포에서 헤파토세포와 같은 세포 유도를 위한 효율적인 방법

이 원고는 hESC 분화 시 활성A및 CHIR99021을 최종 엔도덤(DE)으로 분화하여 인간 배아 줄기 세포(hESC)를 기능성 간세포와 같은 세포(HLC)로 분화하기 위한 상세한 프로토콜을 설명합니다.

인간 배아 줄기 세포 유래 간세포와 같은 세포는 질병 모델링 및 약물 선별에 유용하다. 이것은 인간 배아 줄기 세포의 분화를 기능성 간세포와 같은 세포로 효과적으로 유도하기 위한 효율적이고 재현 가능한 방법입니다. 인간 배아 줄기 세포의 미분화 상태와 적절한 결합은 간세포와 같은 세포에 성공적인 분화에 매우 중요합니다.

줄기 세포 유지를 위해, 외투 멸균 6 웰 조직 배양 플레이트 1 밀리리터1x 인간 배아 줄기 세포 자격을 갖춘 Matrigel 잘, 하룻밤 4섭씨에 저장. 사용 전에 플레이트를 실온에서 30분 동안 그대로 둡니다. 저온 보존 HESEs를 37도의 수조에서 3분간 흔들어주지 않고 해동한 다음, 미리 데워진 섭씨 37도의 4밀리리터를 포함하는 15밀리리터 원심분리기 튜브로 즉시 줄기세포를 이송합니다.

HESEs를 원심분리하고 상퍼를 흡인한 다음, mTESR 배지의 1밀리리터에서 세포를 부드럽게 다시 중단합니다. 플레이트에서 DMEM F-12 배지를 흡인한다. mTESR의 2밀리리터에서 5세포에 1 x 10의 밀도로 세포를 6웰 플레이트로 시드하고, 5%의 이산화탄소 인큐베이터에서 배양한다.

배지를 예열된 mTESR 배지로 매일 교체하여 세포를 유지한다. 약 70~80%의 합류또는 세포 식민지가 접촉하기 시작할 때 세포를 통과한다. 세포 통과의 경우, 배지를 흡인하고 37°C에서 5분 동안 효소 용액 당 1밀리리터로 세포를 배양합니다.

DMEM F-12의 4밀리리터를 포함하는 15밀리리터 원심분리기 튜브로 피펫팅하여 세포를 37°C까지 미리 데워집니다. 1X hESC 인증 된 Matrigel 배지의 250 마이크로 리터로 코팅하여 24 웰 플레이트를 준비하십시오. 종자 hESC는 mTESR 배지의 500 마이크로리터에서 잘 당 5 세포당 1~1.5배 10배 10배이다.

활성 A를 밀리리터당 100 나노그램과 CHIR99021의 최종 농도에 모두 추가하여 예열된 단계 1분분화 기본 배지의 적절한 부피에 3개의 마이크로몰러의 최종 농도를 가집니다. 분화 3 일 후, 분화 된 세포는 FOXA2, SOX17, GATA4, CXCR4 및 FOXA1과 같은 최종 엔도름 세포의 마커를 발현해야합니다. 분화 의 셋째 날에, 매체를 흡인, 단계 2 매체로 교체하고, 24 시간 동안 배양.

4일부터 8일까지 매일 매체를 변경합니다. 분화 8 일 후, 분화 된 세포는 HNF4 알파, AFP, TBX3, TTR, ALB, NTCP, CEBPA와 같은 간 선조 세포의 적절한 마커를 표현해야합니다. 8일째에, 세포로부터 2단계 배지를 흡인시키고, 3단계 배지로 대체한다.

세포가 이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 10일 동안 배양하고, 갓 추가된 분화 요인으로 매일 미디어를 변경할 수 있습니다. 분화 18일 후, 분화세포는 AAT, ALB, TTR, HNF4 알파, NTCP, ASGR1, CYP3A4와 같은 간세포의 특징적인 마커를 발현해야 한다. hESC에서 간세포와 같은 세포의 회로도 및 각 분화 단계의 밝은 필드 이미지가 표시됩니다.

1단계에서, 활성A와 CHIR99021은 줄기세포를 유도하여 내분세포를 형성하도록 유도하기 위해 3일 동안 첨가되었다. 2단계에서, 엔도름 세포는 5일 동안 분화 배지로 치료된 후 간 전구 세포로 분화하였다. 3 단계에서, 10 일 후에, 초기 간세포는 성숙하고 간구 세포 성장 인자와 온코타틴에 있는 간세포 같이 세포로 분화했습니다.

분화의 마지막 단계에서, 세포는 전형적인 간세포 표현형을 보였다. RT-PCR, 면역 형광 염색 및 서양 블로팅은 엔도름 세포, 간 전구체 세포 및 성숙한 간세포의 마커를 검출하는 데 사용되었습니다. 분화세포는 3일째엔엔도름 마커 SOX17, 8일째에 는 간전구체 마커 HNF4 알파, 14일째AFP, 성숙한 간세포 마커 ALB 등 각 단계에서 분화 관련 유전자 및 단백질의 높은 발현 수준을 보였다.

HLC는 녹색 염색과 광범위한 세포질 산 시프트 염색을 전시했습니다. 간세포는 전형적인 이중 핵 형태를 보였다. CYP3A4의 효소 활성, HLCs에서 간에서 필수적인 대사 CYP, 효소 분석으로 확인 되었다.

적절한 밀도로 인간 배아 줄기 세포를 앉히고 다음 날짜에 분화를 시작하는 것이 중요합니다. 1 단계에서 세포가 떠오르기 쉽기 때문에 미디어를 부드럽게 만지십시오. 액티비틴 A와 다른 작은 분자의 조합은 분화 효율성을 더욱 향상시키고,이 절차에서 보다 성숙한 간세포와 같은 세포를 생성할 수 있다.

이 기술은 간세포 이식, 간 조직 공학, 생체 인공 간 및 질병 모델링을 탐구하는 플랫폼을 제공 할 수 있습니다.