Name: 인간 배아 줄기 세포에서 헤파토세포와 같은 세포 유도를 위한 효율적인 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: 배우세요 인간 배아 줄기 세포에서 Activin A와 CHIR99021을 사용하여 기능성 헤파토세포 유도하는 효율적인 방법. 이 프로토콜은 질병 모델링과 약물 스크리닝에 활용됩니다.

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이 작품은 중국 국립 자연과학 재단(X.L.Z.에 81870432 및 81570567)에 의해 지원되었다(81571994 P.N.S.; 중국 광동성 자연과학재단(2020A1515010054호P.N.S.), 리카싱산투대학 재단(No. L1111 2008 - P.N.S.). 샨투 대학 의과 대학의 스탠리 린 교수에게 유용한 조언을 구해 주셔서 감사합니다.

1. 줄기 세포 유지 보수
참고: 아래에 설명된 세포 유지 보수 프로토콜은 부착된 단층에서 유지되는 hES03 세포주에 적용됩니다. 이 원고의 모든 다음 프로토콜에 대해 세포는 생물학적 안전 캐비닛에서 처리되어야합니다.
<ol><li>mTesR 기본 배지에 5배 보충 배지를 희석하여 1배 mTesR 줄기 세포 배양 배지를 준비한다.</li>
	<li>얼음 에 DMEM / F12의 5 mLhESC 자격을 갖춘 5 mL을 희석하여 30 배 hESC 자격을 갖춘 Matrigel 배지를 준비하십시오. -20 °C에 보관하십시오.</li>
	<li>DMEM/F12의 1mL로 30x hESC 인증 된 Matrigel의 33.3 μL을 희석하여 1 x hESC 자격을 갖춘 마모젤 배지를 준비하십시오.</li>
	<li>코팅 멸균 6 잘, 조직 배양 처리 플레이트 1 x hESC 자격을 갖춘 Matrigel의 1 mL을 사전에 저장하고 하룻밤 4 °C에 저장합니다. 사용하기 전에 실온(RT)에서 최소 30분 동안 그대로 둡니다.</li>
	<li>37°C 수조에서 저온 보존 된 hESC를 흔들어서 3 분 동안 해동하십시오. 그런 다음 즉시 4mL 을 포함하는 15 mL 원심분리기 튜브로 피펫팅하여 세포를 37°C mTesR 배지로 이송하고, 2회 위아래로 부드럽게 피펫을 한다.</li>
	<li>RT에서 2 분 동안 200 x g에서 hESC원심분리합니다.</li>
	<li>수퍼내트를 흡인하고 mTesR 배지의 1mL에서 세포를 부드럽게 재보종한다.</li>
	<li>플레이트에서 DMEM/F12 배지를 흡인하고 2mL의 mTesR에서 1 x 105 세포의 밀도로 세포를 6웰 플레이트의 우물로 시드한다.</li>
	<li>5% CO2 인큐베이터에서 배양하고 매일 예열된 mTesR 배지로 교체하여 세포를 유지한다. 약 70-80%의 합류 또는 세포 식민지가 접촉하기 시작할 때 세포를 통과합니다.</li>
</ol>2. 줄기 세포 통로 및 분화
<ol><li>세포 전달의 경우, 배지를 흡인하고 효소 용액당 1mL로 세포를 배양한다(예를 들어, 37°C에서 5분 동안 Accutase) 그런 다음 37°C로 예온된 DMEM/F12의 4mL을 포함하는 15mL 원심분리기 튜브로 피펫팅하여 세포를 이송한다.</li>
	<li>2 분 동안 RT에서 200 x g에서 세포를 원심 분리합니다.</li>
	<li>매체를 흡인시키고 mTesR 배지의 1mL에서 세포 펠릿을 부드럽게 재봉보냅니다.</li>
	<li>1x hESC 자격을 갖춘 55gel 배지의 250 μL로 코팅하여 24웰 플레이트를 미리 준비합니다. 상술한 바와 같이 종자 hESC는 mTesR 배지의 500 μL에서 웰당 1- 1.5 x 105 세포의 밀도로 한다.</li>
	<li>CO2 인큐베이터에서 세포가 37°C에서 24시간 동안 배양하도록 허용합니다.</li>
</ol>3. DE 형성
<ol><li>DMSO를 사용하여 0.2% BSA 및 3mM CHIR99021을 포함하는 DPBS로 100 μg/mL 액티빈 A의 스톡 솔루션을 준비합니다.</li>
	<li>1x B27로 RPMI 매체를 보충하여 단계 I 차별화 기본 매체를 준비합니다.</li>
	<li>액티빈 A를 100 ng/mL 및 CHIR99021의 최종 농도에 예열된 단계 I 분화 기본 배지의 적절한 부피에 3 μM의 최종 농도에 추가합니다.</li>
	<li>세포로부터 mTesR 배지를 흡인하고 추가 분화 인자를 포함하는 단계 I 분화 매체로 대체한다(예를 들어, 24웰 플레이트의 웰당 0.5mL).</li>
	<li>CO2 인큐베이터에서 37°C에서 3일 동안 세포를 배양할 수 있도록 하여, 매일 스테이지 I 미디어를 갓 추가된 분화 인자(일 0-2)로 대체한다. 참고: 3일간의 분화 후, 분화세포는 FOXA2, SOX17, GATA4, CRCR4 및 FOXA1(진행에 필요한 SOX17의 최소 80%)과 같은 DE 세포의 마커를 발현해야 합니다.</li>
</ol>4. 간 선조 세포의 분화
<ol><li>녹아웃 세럼 교체(KOSR)를 녹아웃 DMEM에서 20%의 최종 농도로 용해하여 스테이지 II 차별화 기본 미디어를 준비하십시오.</li>
	<li>1% DMSO, 1x 글루타맥스, 1x 비필수 아미노산(NEAA) 용액, 100μM 2-메르카포에탄올 및 1x 페니실린/연쇄절제술(P/S)을 함유한 단계 II 분화 배지를 코스피/녹아웃 DMEM의 적절한 부피에 준비한다.</li>
	<li>차별화 3일째에, 매체를 흡기하고 스테이지 II 배지(예: 24웰 플레이트의 웰당 0.5mL)로 교체한다. 그런 다음 24 시간 동안 배양하십시오.</li>
	<li>차별화의 4 일째에, 매체를 흡인하고 스테이지 II 매체로 대체하십시오(예: 24웰 플레이트의 웰당 1mL).</li>
	<li>격일로 배지를 변경합니다(6일째에 매체를 교체). 참고: 8일간의 분화 후, 분화세포는 HNF4α, AFP, TBX3, TTR, ALB, NTCP, CEBPA(진행에 필요한 HNF4α의 최소 80%)와 같은 간 전구 세포의 적절한 마커를 발현해야 한다.</li>
</ol>5. 간구 분화
<ol><li>DBPS(0.2% BSA 포함) 및 0.22 μm 필터 멤브레인을 사용하여 10 μg/mL 간세포 성장 인자(HGF), 20 μg/mL 온코스타틴(OSM) 스톡 솔루션을 준비합니다.</li>
	<li>스테이지 III 분화 기본 매체(HepatoZYME-SFM(HZM) 배지를 10μM 하이드로코르티손-21-헤미쿠치네이트 및 1x P/S로 보충한다.</li>
	<li>예열된 단계 III 분화 배지의 적절한 부피에 20 ng/mL의 최종 농도에 10 ng/mL 및 OSM의 최종 농도에 HGF를 추가합니다.</li>
	<li>분화의 8 일째에, 세포로부터 의흡 단계 II 배지및 스테이지 III 배지로 대체 (예를 들어, 24 웰 플레이트의 웰 당 1 mL).</li>
	<li>CO2 인큐베이터에서 37°C에서 10일 동안 세포를 배양할 수 있게 하고, 갓 추가된 분화 인자(일 8-18일)로 격일마다 Stage III 미디어를 변경합니다. 참고: 18일간의 분화 후, 분화세포는 AAT, ALB, TTR, HNF4α, NTCP, ASGR1, CYP3A4와 같은 간세포의 특징적인 마커를 발현해야 한다. 알부민 양성 세포의 백분율은 일반적으로 90% 이상입니다.</li>
</ol>6. RNA 절연, cDNA 합성 및 RT-qPCR 분석
<ol><li>세포로부터 배지를 흡인하고 적절한 양의 RNAiso Plus 시약(예를 들어, 24웰 플레이트의 웰당 0.3mL)을 추가한다. 1.5 mL 튜브에서 상체를 수집하고 5 분 동안 RT에 서보자.</li>
	<li>클로로폼 시약 60μL을 추가하고 5분 동안 RT에 둡니다. 그런 다음 12,000 x g에서 15 분 동안 원심 분리기.</li>
	<li>125 μL 상체를 수집하고 다른 원심 분리 튜브로 전송합니다. 160 μL의 이소프로판올을 넣고 잘 섞은 후 RT에서 10분 간 서 있습니다.</li>
	<li>12,000 x g에서 10 분 동안 원심 분리기.</li>
	<li>상체를 제거하고 침전된 에탄올에 75% 에탄올을 넣고 7,500 x g에서 5분 동안 원심분리기를 추가합니다.</li>
	<li>RT에서 건조한 후 DEPC 처리된 물 40μL을 추가하여 용해합니다. qPCR의 경우 제조업체의 프로토콜에 따라 역전사 키트를 사용하여 총 RNA의 2 μg를 역전사한다.</li>
	<li>제조업체의 프로토콜에 따라 상용 키트를 사용하여 RT-qPCR을 수행합니다.</li>
	<li>비유도 줄기 세포에 비해 유전자 발현을 정상화하고 GAPDH로의 정상화에 따라 접이식 변이를 결정한다.</li>
</ol>7. 분화의 면역형광 검증
<ol><li>PBS에 0.1% Tween-20을 추가하여 1배 PBST 세척 버퍼를 준비합니다.</li>
	<li>부착 된 세포에서 배지를 흡인하고 셰이커에 RT에서 PBS로 간단히 씻어.</li>
	<li>PBS를 흡인하고 24웰 플레이트당 500μL의 얼음-차가운 메탄올로 세포를 배양하여 하룻밤 사이에 -20°C에서 세포를 고정시한다.</li>
	<li>메탄올을 제거하고 RT에서 매번 10 분 동안 셰이커에 PBS로 세포를 3 번 씻으시다.</li>
	<li>5% BSA의 500 μL를 가진 블록 셀은 셰이커에 RT에서 1-2 시간 PBS에서 제조.</li>
	<li>1에서 1: 200에서 차단에 사용되는 동일한 용액에 희석하십시오.</li>
	<li>300 μL 1차 항체 용액에서 셰이커에 4°C에서 하룻밤 사이에 고정 된 세포를 배양한다.</li>
	<li>하룻밤 잠복 후, 셰이커에 RT에서 매번 10 분 동안 PBST와 함께 3 번 셀을 씻으라.</li>
	<li>1:1000에서 차단 용액에 이차 항체 용액을 준비합니다.</li>
	<li>셰이커에서 RT에서 1h에 대한 빛으로부터 보호되는 이차 항체 용액의 300 μL에서 배양합니다.</li>
	<li>이차 항체 용액을 흡기하고 셰이커에 RT에서 매번 10 분 동안 PBST로 세포를 3 번 세척합니다.</li>
	<li>3-5 분 동안 1 μg / mL DAPI의 300 μL로 세포를 배양 한 다음 PBST로 두 번 세척하십시오.</li>
	<li>PBST를 심은 후 형광 현미경으로 사진을 찍기 위해 적절한 양의 PBS를 추가하십시오.</li>
</ol>8. 웨스턴 블롯 분석
<ol><li>트리스 버퍼식염수(TBS)에 0.1% Tween-20을 추가하여 1배 TBST 세척 버퍼를 준비합니다.</li>
	<li>제조업체의 프로토콜에 따라 상용 키트를 사용하여 SDS-PAGE 전기 전도 버퍼 및 서부 전달 버퍼를 준비합니다.</li>
	<li>총 세포 단백질(40 μg)을 10% 나트륨 도데실 황산 폴리아크라이아미드 젤에 분해하고 SDS-PAGE 전기포고리 완충에서 약 2시간 동안 일정한 전류로 실행한다.</li>
	<li>젤을 300mA상수 전류에서 300mA상수전류로 2시간 동안 저온에서 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 멤브레인으로 이송한다. 참고: 사용 장비및 젤의 종류 및 비율에 따라 실행 시간 및 전송 시간이 달라질 수 있습니다.</li>
	<li>셰이커에서 RT에서 1 시간 동안 TBST에서 3 % BSA로 멤브레인을 차단하십시오.</li>
	<li>1차 항체 용액(1:1000 희석)에서 하룻밤 사이에 4°C에서 셰이커에 배양한다.</li>
	<li>하룻밤 잠복 후, 셰이커에 RT에서 시간 당 15 분 동안 TBST와 블로팅 멤브레인을 3 번 세척합니다.</li>
	<li>이차 항체 용액 (1:2000 희석)에서 셰이커에 RT에서 2 시간 동안 배양하십시오.</li>
	<li>이차 항체 용액을 버리고 TBST로 멤브레인을 3 번 세척하여 매번 15 분 동안, 쉐이커의 RT에서 세척하십시오.</li>
	<li>화학 발광 시약을 사용하여 면역 반응성 밴드를 시각화한 다음 사인 방사선 촬영이 뒤따릅니다. β 액틴을 로딩 컨트롤로 사용합니다.</li>
</ol>9. 인도시아닌 그린 섭취
<ol><li>DMSO에서 200 mg/mL indocyanine 녹색 재고 솔루션을 준비하십시오.</li>
	<li>1 mg/mL의 최종 농도에 indocyanine 녹색 용액단계 III 분화 매체를 보충 하 여 작업 솔루션을 준비.</li>
	<li>37°C,1-2h용 5% CO 2 인큐베이터에서 인큐베이터.</li>
	<li>PBS로 세포를 3번 흡입하여 세척합니다.</li>
	<li>현미경으로 사진.</li>
</ol>10. 주기적인 산성 쉬프 (PAS) 염색 및 헤마톡실린 -Eosin (H&E) 염색
<ol><li>부착 된 세포에서 배지를 흡인하고 PBS로 두 번 간략하게 씻으세요.</li>
	<li>세포 고정을 위해 PBS를 흡인하고 하룻밤 동안 -20 °C에서 얼음 차가운 메탄올로 세포를 배양하십시오.</li>
	<li>PAS 염색에 의한 글리코겐 저장을 시각화하고 제조업체의 지시에 따라 키트를 사용하여 H & E 염색에 의해 이중 핵세포를 관찰합니다.</li>
	<li>형광 현미경으로 이미지를 가져 가라.</li>
</ol>11. CYP 활동을 위한 분석
<ol><li>제조업체의 지침에 따라 시판되는 세포 기반 어약(P450-Glo Assays)을 사용하여 CYP450 활성을 측정합니다.</li>
	<li>테스트에 세 개의 독립적인 반복을 사용합니다. 데이터는 SD에 ± 평균으로 표시됩니다.</li>
</ol>

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<li>Kim, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+drug-induced+immune-mediated+hepatotoxicity+using+hepatocyte-like+cells+derived+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Prediction of drug-induced immune-mediated hepatotoxicity using hepatocyte-like cells derived from human embryonic stem cells.</a> Toxicology. 387, 1-9 (2017).</li>
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여기서는 hESC에서 HLC를 3단계로 유도하는 단계적 방법을 제시합니다. 첫 번째 단계에서액티빈 A와 CHIR99021은 hESC를 DE로 차별화하는 데 사용되었습니다. 두 번째 단계에서, KO-DMEM 및 DMSO는 간 선조 세포로 DE를 분화하기 위하여 이용되었습니다. 제 3 단계에서, HZM 플러스 HGF, OSM 및 하이드로 코르티손 21-hemisuccinate 나트륨 소금은 HLC로 간 선조 세포를 계속 분화하는 데 사용되었다.
프로토콜을 사용하는 동안 다음과 같은 중요한 단계를 고려해야 합니다. 세포의 초기 분화 밀도와 중간 변화의 정확한 타이밍은 성공적인 분화를 위한 중요한 요소입니다. 분화하기 시작할 때, 우리는 세포가 막 서로 접촉하기 시작할 때, 그리고 세포 간 공간이 비전의 필드 아래 네트워크에 균등하게 배열될 때, 대략 30-40%의 합류에서, 초기 파종 밀도가 적당하다는 것을 확인해야 합니다. 분화 하는 동안, 해당 분화 매체는 각 대체 단계의 첫 번째...

간은 탈산화, 글리코겐 저장, 단백질1의분비 및 합성을 포함하여 여러 가지 역할을 하는 매우 신진 대사 기관이다. 각종 병원균, 약물 및 항종은 간에서 병리학적 변화를 일으킬 수 있으며 그 기능에 영향을 미칠 수있습니다2,3. 간장의 주요 기능 단위인 간세포는 인공 간 지원 시스템 및 약물 독성 제거에 중요한 역할을 합니다. 그러나, 1 차적인 인간 간세포의 자원은 간 질병 연구에서 뿐만 아니라 세포 기지를 둔 치료에서 제한됩니다. 따라서 기능성 인간 간세포의 새로운 소스를 개발하는 것은 재생 의학 분야에서 중요한 연구 방향입니다. 1998년 hESC가 설립된 이래4년이래, hESC는 우수한 분화 잠재력(적절한 환경에서 다양한 조직으로 분화할 수 있음) 및 높은 수준의 자기 갱신성 으로 인해 연구자들이 널리 고려해 왔으며, 따라서 생체인공간, 간세포 이식, 심지어 간 조직 공학5에이상적인 공급세포를 제공한다.
현재, 간 분화 효율은 엔도름6을농축함으로써 크게 증가할 수 있다. 줄기 세포의 혈통 분화에서 엔데담으로, β 변형 성장 인자 (TGF-β) 신호 및 WNT 신호 경로의 수준은 엔도름 형성 단계의 노드의 핵심 요소입니다. 높은 수준의 TGF-β 및 WNT 시그널링의 활성화는 엔도름7,8의개발을 촉진할 수 있다. 액티빈 A는 TGF-β 슈퍼 패밀리에 속하는 사이토카인입니다. 따라서, 액티빈 A는 인간 유도만능 줄기세포(hiPSC) 및 hESC9,10의엔도름유도에널리 사용된다. GSK3는 세린-토닌 단백질 키나아제입니다. 연구원은 CHIR99021, GSK3β의 특정 억제제, 전형적인 WNT 신호를 자극할 수 있고, 특정 조건하에서 줄기 세포 분화를 촉진할 수 있다는 것을 것을을 발견했습니다, CHIR99021는 endoderm 11,12,13로줄기 세포 분화를 유도하기위한 잠재력을 가지고 있음을 시사.
여기서 는 hESC를 기능형 HLC로 효과적으로 차별화하는 효율적이고 재현 가능한 방법을 보고합니다. 액티빈 A와 CHIR99021의 순차적 첨가는 약 89.7±0.8% SOX17(DE 마커)-양성 세포를 생산하였다. 시험관에서추가 로 소화 된 후, 이들 세포는 간 특이적 마커를 발현하고 간세포와 같은 형태 (헤마톡시린 -eosin 염색 (H & E)에 기초하여) 및 기능, 인도시아닌 녹색 (ICG), 글리코겐 저장 및 CYP3 활성등의 섭취와 같은 기능. 결과는 hESC가 이 방법에 의해 성숙한 기능적인 HLC로 성공적으로 분화될 수 있고 간 질병 관련 연구 및 체외약 검열을 위한 기초를 제공할 수 있다는 것을 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>2-메르캅토에탄올</td><td>시그마</td><td>M7522</td> 마우스 IgG ZSGB-BIO ZF-0512에 대한 <td>간 전구 세포 분화</td></tr><tr><td>488 표지 염소</td><td></td><td></td> IF, 토끼 IgG <td></td></tr><tr><td>ZSGB-BIO</td><td>ZF-0516</td>에 대한 두 번째 항체<td>488 표지 염소</td> IF<td>, 두 번째 항체</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>7920</td><td>세포 통로</td></tr><tr><td>Activin A</td><td>peproTech</td><td>120-14E</td><td>확정적인 내배엽 형성</td></tr><tr><td>안티-알부민 (ALB)</td><td>시그마-알드리치</td><td>A6684</td><td>IF와 WB의 경우 1 차 항체</td></tr><tr><td>안티-인간 Oct4</td><td>Abcam</td><td>Ab19587</td><td>IF, 1 차 항체</td></tr><tr><td>안티-&알파; -태아 단백질 (AFP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8452</td><td>IF 및 WB의 경우 1 차 항체</td></tr><tr><td>안티-SOX17</td><td>Abcam</td><td>ab224637</td><td>IF의 경우, 1차 항체</td></tr><tr><td>Anti-Hepatocyte Nuclear Factor 4 alpha (HNF4&alpha;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SAB1412164</td><td>IF의 경우, 1차 항체</td></tr><tr><td>B-27 보충제</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td>최종 내배엽 형성</td></tr>용 <tr><td>BSA</td><td>Beyotime</td><td>ST023-200g</td><td>세포 차단용</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML1046</td><td>최종 내배엽 형성용</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Beyotime</td><td>C1006</td><td>핵 염색용</td></tr><tr><td>DEPC-water</td><td>Beyotime</td><td>R0021</td><td>RNA 용해용</td></tr><tr><td>DM3189</td><td>MCE</td><td>HY-12071</td><td>최종 내배엽 형성용</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11320-033</td><td>세포 배양용</td></tr><tr><td></td><td>DMSO Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td>간 전구 세포 분화용</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>세포 배양용</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>간 전구 세포 분화</td></tr><tr><td>H& </td> H&를 위한 E 염색 장비 <td>Beyotime</td><td>C0105S</td><td>; E 염색</td></tr><tr><td>간세포 성장 인자 (HGF)</td> <td>peproTech</td><td>100-39</td><td>간세포 분화를 위해</td></tr><tr><td>HepatoZYME-SFM (HZM)</td> <td>Gibco</td><td>17705-021</td><td>간세포 분화를 위해</td></tr><tr><td>Hydrocortisone-21-hemisuccinate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4881</td><td>간세포 분화를 위해</td></tr><tr><td>Indocyanine</td><td>Sangon Biotech</td><td>A606326</td><td>Indocyanine 염색을 위해</td></tr><tr><td>Knock Out DMEM</td><td>Gibco</td><td>10829-018</td><td>간전구세포 분화용</td></tr><tr><td>Knock Out SR Multi-Species</td><td>Gibco</td><td>A31815-02</td><td>간전구세포 분화용</td></tr><tr><td>Matrigel hESC 인증</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>세포 배양용</td></tr><tr><td>MEM NeAA</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td>간전구세포 분화용</td></tr><tr><td>mTesR 5X 보충</td><td>줄기 세포 기술</td><td>85852</td><td>세포 배양</td></tr><tr><td>mTesR 기초 매체</td><td>줄기 세포 기술</td><td>85851</td><td>세포 배양</td></tr><tr><td>용 종양스타틴 (OSM)</td><td>peproTech</td><td>300-10</td><td>간세포 분화</td></tr><tr><td>P450 - CYP3A4 (루시페린 - PFBE)</td><td>Promega</td><td>V8901</td><td>CYP450 활성</td></tr><tr><td>PAS 염색 키트</td><td>Solarbio</td><td>G1281</td><td>PAS 염색용</td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>세포 분화를 위한</td></tr><tr><td>Peroxidase-Conjugated Goat anti-Mouse IgG</td><td>ZSGB-BIO</td><td>ZB-2305</td><td>WB용, 두 번째 항체</td></tr><tr><td>기본 항체 희석 완충액 for&nbsp; 웨스턴 블롯</td><td>Beyotime</td><td>P0256</td><td>1차 항체 희석용</td></tr><tr><td>ReverTraAce qPCR RT 키트</td><td>TOYOBO</td><td>FSQ-101</td><td>cDNA 합성용</td></tr><tr><td>RNAiso Plus</td><td>TaKaRa</td><td>9109</td><td>RNA 분리용</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td>최종 내배엽 형성용</td></tr><tr><td>탈지 우유</td><td>Sangon Biotech</td><td>A600669</td><td>두 번째 항체 제제용</td></tr><tr><td>SYBR Green Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A25742</td><td>RT-PCR 분석용</td></tr><tr><td>Torin2</td><td>MCE</td><td>HY-13002</td><td>확정적인 내배엽 형성용</td></tr><tr><td>Tween</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WXBB7485V</td><td>세척 완충액 준비용</td></tr></tbody></table>

인간 배아 줄기 세포에서 헤파토세포와 같은 세포 유도를 위한 효율적인 방법

An Efficient Method for Directed Hepatocyte-Like Cell Induction from Human Embryonic Stem Cells

인간 배아 줄기 세포 (hESC)에서 파생 된 간세포와 같은 세포 (HLC)의 잠재적 인 기능은 질병 모델링 및 약물 선별 응용 프로그램에 대한 큰 약속을 보유하고 있습니다. 여기에 제공 기능 용 HLC로 hESC의 분화를위한 효율적이고 재현 가능한 방법이 있습니다. 엔도름 혈통의 확립은 HLC와 차별화의 핵심 단계입니다. 우리의 방법에 의해, 우리는 지속적으로 최종 엔도담 (DE)로 hESC 분화 하는 동안 Activin A와 CHIR99021을 보충 하 여 주요 신호 경로를 조절 하 고, 간 선조 세포의 생성 에 이어, 그리고 마지막으로 완전히 정의 된 시약을 가진 단계 별 방법으로 전형적인 간세포 형태와 HLCs. 이 방법에 의해 생성된 hESC 유래 HLC는 단계별 마커(알부민 포함) 및 HNF4α 핵수용체 및 타우로콜레이트 응수송 폴리펩티드(NTCP)는 성숙하고 기능적인 간세포(인도시아닌 그린 염색, 글리코겐 저장, 헤마톡시린-에신 염색 및 CYP3 활성 포함)와 관련된 특별한 특성을 나타내며, HLC 기반의 응용 분야의 개발을 위한 플랫폼을 제공할 수 있다.

각 분화 단계의 HESC 유도 및 대표 밝은 필드 이미지의 HLC 유도의 회로도는 도 1에표시됩니다. 1단계에서, 액티빈 A와 CHIR99021은 줄기 세포를 형성하여 엔도름 세포를 형성하도록 유도하기 위해 3일 동안 첨가되었다. 단계 II에서, 엔데담 세포는 5 일 동안 분화 배지로 처리 된 후 간 선조 세포로 분화. 스테이지 III에서는 HGF 및 OSM(그림1A)에서10일 만에 초기 간세포가 성숙해 HLC로 분화되었습니다. 분화의 마지막 단계에서, 세포는 전형적인 간세포 표현형(세포는 다각형이고 고르고 정기적으로 분포됨)(도 1B)를보였다.
간 분화를 더욱 확인하기 위해 RT-qPCR, 면역형광 염색 및 서부 블로팅이 엔도름 세포, 간 선조 세포 및 성숙한 간세포(도2)의</st...

이 원고는 hESC 분화 시 활성A및 CHIR99021을 최종 엔도덤(DE)으로 분화하여 인간 배아 줄기 세포(hESC)를 기능성 간세포와 같은 세포(HLC)로 분화하기 위한 상세한 프로토콜을 설명합니다.

The potential functions of hepatocyte-like cells (HLCs) derived from human embryonic stem cells (hESCs) hold great promise for disease modeling and drug ...

인간 배아 줄기 세포 유래 간세포와 같은 세포는 질병 모델링 및 약물 선별에 유용하다. 이것은 인간 배아 줄기 세포의 분화를 기능성 간세포와 같은 세포로 효과적으로 유도하기 위한 효율적이고 재현 가능한 방법입니다. 인간 배아 줄기 세포의 미분화 상태와 적절한 결합은 간세포와 같은 세포에 성공적인 분화에 매우 중요합니다.줄기 세포 유지를 위해, 외투 멸균 6 웰 조직 배양 플레이트 1 밀리리터1x 인간 배아 줄기 세포 자격을 갖춘 Matrigel 잘, 하룻밤 4섭씨에 저장. 사용 전에 플레이트를 실온에서 30분 동안 그대로 둡니다. 저온 보존 HESEs를 37도의 수조에서 3분간 흔들어주지 않고 해동한 다음, 미리 데워진 섭씨 37도의 4밀리리터를 포함하는 15밀리리터 원심분리기 튜브로 즉시 줄기세포를 이송합니다.HESEs를 원심분리하고 상퍼를 흡인한 다음, mTESR 배지의 1밀리리터에서 세포를 부드럽게 다시 중단합니다. 플레이트에서 DMEM F-12 배지를 흡인한다. mTESR의 2밀리리터에서 5세포에 1 x 10의 밀도로 세포를 6웰 플레이트로 시드하고, 5%의 이산화탄소 인큐베이터에서 배양한다.배지를 예열된 mTESR 배지로 매일 교체하여 세포를 유지한다. 약 70~80%의 합류또는 세포 식민지가 접촉하기 시작할 때 세포를 통과한다. 세포 통과의 경우, 배지를 흡인하고 37°C에서 5분 동안 효소 용액 당 1밀리리터로 세포를 배양합니다.DMEM F-12의 4밀리리터를 포함하는 15밀리리터 원심분리기 튜브로 피펫팅하여 세포를 37°C까지 미리 데워집니다. 1X hESC 인증 된 Matrigel 배지의 250 마이크로 리터로 코팅하여 24 웰 플레이트를 준비하십시오. 종자 hESC는 mTESR 배지의 500 마이크로리터에서 잘 당 5 세포당 1~1.5배 10배 10배이다.활성 A를 밀리리터당 100 나노그램과 CHIR99021의 최종 농도에 모두 추가하여 예열된 단계 1분분화 기본 배지의 적절한 부피에 3개의 마이크로몰러의 최종 농도를 가집니다. 분화 3 일 후, 분화 된 세포는 FOXA2, SOX17, GATA4, CXCR4 및 FOXA1과 같은 최종 엔도름 세포의 마커를 발현해야합니다. 분화 의 셋째 날에, 매체를 흡인, 단계 2 매체로 교체하고, 24 시간 동안 배양.4일부터 8일까지 매일 매체를 변경합니다. 분화 8 일 후, 분화 된 세포는 HNF4 알파, AFP, TBX3, TTR, ALB, NTCP, CEBPA와 같은 간 선조 세포의 적절한 마커를 표현해야합니다. 8일째에, 세포로부터 2단계 배지를 흡인시키고, 3단계 배지로 대체한다.세포가 이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 10일 동안 배양하고, 갓 추가된 분화 요인으로 매일 미디어를 변경할 수 있습니다. 분화 18일 후, 분화세포는 AAT, ALB, TTR, HNF4 알파, NTCP, ASGR1, CYP3A4와 같은 간세포의 특징적인 마커를 발현해야 한다. hESC에서 간세포와 같은 세포의 회로도 및 각 분화 단계의 밝은 필드 이미지가 표시됩니다.1단계에서, 활성A와 CHIR99021은 줄기세포를 유도하여 내분세포를 형성하도록 유도하기 위해 3일 동안 첨가되었다. 2단계에서, 엔도름 세포는 5일 동안 분화 배지로 치료된 후 간 전구 세포로 분화하였다. 3 단계에서, 10 일 후에, 초기 간세포는 성숙하고 간구 세포 성장 인자와 온코타틴에 있는 간세포 같이 세포로 분화했습니다.분화의 마지막 단계에서, 세포는 전형적인 간세포 표현형을 보였다. RT-PCR, 면역 형광 염색 및 서양 블로팅은 엔도름 세포, 간 전구체 세포 및 성숙한 간세포의 마커를 검출하는 데 사용되었습니다. 분화세포는 3일째엔엔도름 마커 SOX17, 8일째에 는 간전구체 마커 HNF4 알파, 14일째AFP, 성숙한 간세포 마커 ALB 등 각 단계에서 분화 관련 유전자 및 단백질의 높은 발현 수준을 보였다.HLC는 녹색 염색과 광범위한 세포질 산 시프트 염색을 전시했습니다. 간세포는 전형적인 이중 핵 형태를 보였다. CYP3A4의 효소 활성, HLCs에서 간에서 필수적인 대사 CYP, 효소 분석으로 확인 되었다.적절한 밀도로 인간 배아 줄기 세포를 앉히고 다음 날짜에 분화를 시작하는 것이 중요합니다. 1 단계에서 세포가 떠오르기 쉽기 때문에 미디어를 부드럽게 만지십시오. 액티비틴 A와 다른 작은 분자의 조합은 분화 효율성을 더욱 향상시키고,이 절차에서 보다 성숙한 간세포와 같은 세포를 생성할 수 있다.이 기술은 간세포 이식, 간 조직 공학, 생체 인공 간 및 질병 모델링을 탐구하는 플랫폼을 제공 할 수 있습니다.

an-efficient-method-for-directed-hepatocyte-like-cell-induction-from

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 문서는 인간의 배아 줄기 세포 집단에서 인간 간장 endoderm의 생성에 초점을 맞출 것이다.

인간 배아 줄기 세포 인구에서 Hepatocyte 같은 전지의 강력한 생성

이 프로토콜은 전사 인자의 강제 발현을 통해 인간 만능 줄기 세포에서 혈구 내피 및 다중전위 조혈 전구 세포의 효율적인 유도를 설명합니다.

인간 만능 줄기 세포에서 전사 인자의 과발현에 의해 직접 Hemogenic 내피 세포의 유도 및 혈액

여기에 제시된 방법은 다 능성 줄기 세포로부터 인간 간세포 - 유사 세포를 생성하기 위해 확장 및 우수 제조 기준 (GMP) 레디 분화 시스템을 설명한다. 이것은 기초 및 응용 연구 인간 간 인간 간세포 - 유사 세포를 생성하기위한 비용 효과적이고 표준화 된 시스템으로서 작용한다.

정의 및 간세포와 같은 세포의 확장 성 생성 인간 다 능성 줄기 세포에서

여기에 제시 된 프로토콜 간 질환의 치료에 대 한 작은 분자를 식별 하기 위한 플랫폼을 설명 합니다. 단계별 설명 Ipsc 96 잘 접시에서 hepatocyte 특성을 가진 세포로 분화 하 고 작은 분자에 대 한 잠재적인 치료 활동 화면 셀을 사용 하는 방법을 자세히 제시 합니다.

약물 발견에 대 한 만능 줄기 세포 유래 Hepatocyte 같은 세포를 유도 하는 인간을 사용 하 여

이 프로토콜에는 hepatocyte 같은 셀 96 잘 접시 형태로 인간의 pluripotent 줄기 세포에서 생산 하는 반자동된 접근 방식을 설명 합니다. 이 프로세스는 신속 하 고 비용 효율적인, 품질의 생산 기초 및 응용 연구를 인간의 hepatocyte 같은 셀 배치를 안심 수 있도록 합니다.

만능 줄기 세포에서 세포 처럼 Hepatocyte의 반자동된 생산

이 프로토콜은 18일 만에 인간 만능 줄기 세포(hPSCs)로부터 간세포 유사 세포를 효율적으로 생성하는 단층, 무혈청 방법을 상세히 기술한다. 이것은 hPSCs가 간세포 같이 세포를 형성하기 전에 원시적인 선미, 결정적인 내배엽, 후방 포인및 간 싹 선조와 같은 중간 세포 모형으로 순차적으로 분화하는 것과 같이 6단계를 수반합니다.

인간 다능성 줄기 세포를 간 세포로 효율적으로 분화

여기서, 우리는 피더-및 제노프리 조건에서 인간 다능성 줄기 세포로부터 혈생 내피를 정밀하게 형성하는 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 치료 화합물에 대한 질병 모델링 및 스크리닝에 광범위한 응용 프로그램을 가질 것이다.

피더 및 제노 프리 정의 상태에서 인간 다능성 줄기 세포에서 혈생 내피 분화

이 문서의 목표는 만능 줄기 세포로부터 인간 간 선구분화를 유도하는 표준화된 접근법을 제공하는 것입니다. 즉시 사용 가능한 미디어 제형이 있는 이 절차의 개발은 사용자에게 생체 의학 연구 및 번역을 위한 인간 간 세포를 생성하는 촉진 시스템을 제공합니다.

정의된 분화 시스템을 사용하여 만능 줄기 세포에서 간 선조 사양

여기에 제시된 것은 약 1 주일 내에 인간 다 능성 줄기 세포로부터 혈구 내피 세포의 유도 분화를위한 간단한 프로토콜이다.

인간 만능 줄기 세포로부터 혈구 내피 세포의 유도 분화

만능 줄기 세포에서 유래한 간세포는 미토콘드리아 및 활성 백혈구 세포 접착 분자(ALCAM, CD166이라고도 함) 염색을 사용하여 세포 분류를 통해 정제할 수 있습니다.

인간 유도 만능 줄기 세포에서 유래한 간세포를 정제하기 위한 세포 분류에 살아있는 미토콘드리아 염색 적용

배우세요 인간 배아 줄기 세포에서 Activin A와 CHIR99021을 사용하여 기능성 헤파토세포 유도하는 효율적인 방법. 이 프로토콜은 질병 모델링과 약물 스크리닝에 활용됩니다.

인간 배아 줄기 세포에서 헤파토세포와 같은 세포 유도를 위한 효율적인 방법

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