Name: Keratinocyte 확산에 2-및 3 차원의 평가 유형 I 교원 질 기판 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: 학습하세요 I형 교원질을 이용한 2차원 및 3차원 세포 배양 기판 제조 방법을 통해 각각의 세포 행동 차이를 분석하는 기술입니다. 이 프로토콜은 생물학적 환경을 모사하는 연구에 활용됩니다.

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우리는 감사 닥터 K. 구치 (단백질 연구소, 오사카 대학), 박사 M. 야마다 (단백질 연구소, 오사카 대학), 박사 T. Ikejima (중국-일본 연구 연구소의 의학 및 약 학, Wuya의 대학 혁신, 심 양 약과 대학)와 토니 하 야 시 (중국-일본 연구 연구소의 의료 및 약 제 과학, Wuya를 대학 혁신의 심 양 약과 대학) 도움이 의견에 대 한.

1입니다. 준비 keratinocyte 문화 매체의
참고: 무 균 조건 하에서 모든 절차를 수행 합니다.
<ol><li>페니실린-스와는 피 펫을 사용 하 여 첨가제 K110 유형-II 매체 (K110)의 500 mL를 보충 K-1의 10 mL 5 mL를 추가 합니다.</li>
</ol>2. 준비의 fibril 형태의 유형 I 교원 질
참고: 무 균 조건 하에서 2.6 단계까지 절차를 수행 합니다.
<ol><li>인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS (-)), 이온된 수, 콜라겐, 96 잘 문화 플레이트, 그리고 얼음에 빈 2 mL 튜브 x 10을 유지. 참고: fibril 비 섬유 형태를 준비 하는 같은 접시를 사용 하지 마십시오.</li>
	<li>피 펫을 사용 하 여 빈 2 mL 튜브에 이온된 수의 1.12 mL를 추가 합니다. 10 x PBS (-)의 200 µ L를 피 펫을 사용 하 여 2 mL 튜브에 이온된 수를 추가 합니다. 부드럽게 튜브 여러 번 흔들어.</li>
	<li>피 펫을 사용 하 여 2 mL 튜브에 콜라겐의 0.66 mL를 추가 합니다. 빠르고 부드럽게 흔들어 튜브 여러 번. 참고: 가능한 솔루션에 거품 형성을 피하십시오. 즉시 사용 하기 전에 콜라겐 솔루션을 준비 합니다.</li>
	<li>96 잘 문화 접시의 각 음에 2.3 단계에서 콜라겐 솔루션의 100 µ L를 붓는 다. 부드럽게 오른쪽 모션을 왼쪽에 문화 접시를 흔들. 참고: 콜라겐 솔루션 우물의 전체 표면을 커버. 솔루션 전체 표면을 커버 하지 않는, 피 펫 팁을 사용 하 여 솔루션을 전파. 가능한 솔루션에 거품 형성을 하지 마십시오.</li>
	<li>장소 문화와 CO2 인큐베이터에 접시 1 h. 위해 37 ° C에서 품 어 콜라겐 겔 화를 확인 하 고 깨끗 한 벤치에 문화 접시를 이동. 참고: 문화 접시를 기울이기로 겔 화를 확인 합니다.</li>
	<li>부드럽게 잘, 장소 문화와 CO2 인큐베이터에 접시 1 h. 이동 문화 접시 깨끗 한 벤치를 37 ° C에서 품 어의 벽을 따라 피 펫을 사용 하 여 젤에 K110의 150 µ L를 붓는 다. 세포 배양 전에 부드럽게는 K110 삭제는 피 펫을 사용 하 여. 참고:는 젤을 보호 하는 피 펫의 끝 우물의 벽을 터치 한다.</li>
</ol>3. 준비의 비 섬유 형태의 유형 I 교원 질
참고: 무 균 조건 하에서 모든 절차를 수행 합니다.
<ol><li>1.5 mL 튜브에 1 m m 염 산 (HCl)의 1.2 mL에 콜라겐의 4 µ L을 추가 하 고 부드럽게 혼합 한 피 펫을 사용 하 여. 참고: 콜라겐 즉시 사용 하기 전에 준비. 콜라겐과 HCl 사용의 시간까지 냉장 하십시오.</li>
	<li>피 펫을 사용 하 여 96 잘 문화 판의 각 우물에 콜라겐 100 µ L를 붓으십시오. 부드럽게 1 시간 실 온에서 품 어 모션 마우스 오른쪽 왼쪽에 문화 접시를 흔들. 주: 확인 우물의 전체 표면 솔루션으로 덮여 있다.</li>
	<li>부 화 후 콜라겐 솔루션을 삭제 하 고 PBS (-)를 피 펫을 사용 하 여 두 번으로 우물을 씻어.</li>
	<li>1% 소 혈 청 알 부 민/PBS (-) (1 %BSA) 96 잘 문화 접시의 우물을의 150 µ L를 부 어 1 헤 셀 문화 이전에 대 한 실 온에서 품 어, 1 %BSA 삭제. 주: 확인 우물의 전체 표면 솔루션으로 덮여 있다.</li>
</ol>4입니다. FEPE1L-8 세포의 문화
참고: 무 균 조건 하에서 모든 절차를 수행 합니다.
<ol><li>K110 100 m m에서 FEPE1L-8 셀 문화 공동2 인큐베이터에 접시와 37 ° C, 5% CO2, 반 confluency에서 incubated 유지 합니다.</li>
	<li>K110, 트립 신, 트립 신 억제제 37 ° c.에 물 욕조에 준비</li>
	<li>조심 스럽게 문화 접시에서 매체를 제거, 추가 피 펫을 사용 하 여 0.05 %trypsin 3 mL, CO2 인큐베이터에 접시를 놓고 하 고 5 분 동안 37 ° C에서 품 어. 부 화, 후 10 배 확대에 단계 대조 현미경 검사 법을 사용 하 여 문화 접시의 표면에서 셀 분리를 확인 합니다. 참고: 분리 된 세포의 형태는 라운드 됩니다. 만약 셀 확산, 5 분의 추가 기간 동안 품 어.</li>
	<li>트립 신 억제 물 3 mL를 추가 하 고는 피 펫을 사용 하 여 15 mL 원심 분리기 튜브에서 분리 된 세포를 수집 합니다. 5 분 동안 200 x g에서 15 mL 원심 분리기 튜브에 세포 원심</li>
	<li>상쾌한 삭제 하 고 다시는 피 펫을 사용 하 여 K110 10 mL에 펠 릿을 일시 중단. 10 배 확대에 단계 대조 현미경 검사 법을 사용 하 여 셀을 계산 하 고 셀 농도 104 셀/mL x 5.0에 K110와 적절 한 희석에 의해 준비.</li>
	<li>부드럽게 셀에 우물의 벽을 따라 피 펫을 사용 하 여 문화 판의 각 잘 K110의 0.1 mL 씨. CO2 배양 기에서 문화 접시를 놓고 지정된 시간 (2 시간, 1 일, 3 일)에 대 한 37 ° C에서 품 어. 참고:는 젤을 보호 하는 피 펫의 끝 우물의 벽을 터치 한다.</li>
</ol>5. 가능한 셀 수의 추정
<ol><li>K110 37 ° c.에 물 목욕에 품 어 Tetrazolium 소금, 2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H tetrazolium, 글루타민 (서 부 표준시-8), 소금과 피 펫을 사용 하 여 2 mL 튜브에 K110의 1.3 mL의 믹스 130 µ L.</li>
	<li>클린 벤치를 문화 접시를 이동 하 고 부드럽게는 K110 삭제는 피 펫을 사용 하 여. 부드럽게 멀리 세척 K110와 비 부착 한 세포를 피 펫을 사용 하 여</li>
	<li>K110의 110 µ L 혼합 서 부 표준시-8 잘 사용 하 여 각는 피 펫에 추가, 문화 접시 CO2 배양 기에 놓고 2 h 37 ° C에서 품 어.</li>
	<li>깨끗 한 벤치에 문화 접시를 이동, 각 우물에서 조절된 하는 매체의 100 µ L를 수집 하 고 다른 96 잘 문화 격판덮개의 우물으로 이동. 450의 파장에서 흡 광도 측정 nm (OD450) microplate 리더와 예상 가능한 셀 수를 사용 하 여.</li>
</ol>

<ol><li>Kanta, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+as+a+tool+in+studying+fibroblastic+cell+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adhesion+%26+Migration%22%5BJournal%5D)">Collagen as a tool in studying fibroblastic cell behavior.</a> Cell Adhesion & Migration. 9 (4), 308-316 (2015).</li>
<li>Kleinman, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+adhesion+to+collagen+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+of+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Fibroblast adhesion to collagen substrates.</a> Methods of Enzymology. 82, 503-508 (1982).</li>
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<li>Suzuki, Y., Someki, I., Adachi, E., Irie, S., Hattori, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+collagen+molecules+from+the+aspect+of+fibril+formation%3A+Acid-soluble%2C+alkali-treated+and+MMP1-digested+fragments+of+type+I+collagen%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Interaction of collagen molecules from the aspect of fibril formation: Acid-soluble, alkali-treated and MMP1-digested fragments of type I collagen.</a> Journal of Biochemistry. 126, 54-67 (1999).</li>
<li>Fujisaki, H., Hattori, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratinocyte+apoptosis+on+type+I+collagen+gel+caused+by+lack+of+laminin+5%2F10%2F11+deposition+and+Akt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Keratinocyte apoptosis on type I collagen gel caused by lack of laminin 5/10/11 deposition and Akt signaling.</a> Experimental Cell Research. 280, 255-269 (2002).</li>
<li>Sasaki, J., Fujisaki, H., Adachi, E., Irie, S., Hattori, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delay+of+cell+cycle+progression+and+induction+of+death+of+cancer+cells+on+type+I+collagen+fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22Connective+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Delay of cell cycle progression and induction of death of cancer cells on type I collagen fibrils.</a> Connective Tissue Research. 52 (3), 167-177 (2011).</li>
<li>Wang, Z., Li, R., Zhong, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+promotes+proliferation%2C+migration+and+airway+smooth+muscle+cells+in+a+rat+model+of+chronic+obstructive+pulmonary+disease+via+upregulation+of+the+PI3K%2FAKT+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Medicine+Reports%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix promotes proliferation, migration and airway smooth muscle cells in a rat model of chronic obstructive pulmonary disease via upregulation of the PI3K/AKT signaling pathway.</a> Molecular Medicine Reports. 18, 3143-3152 (2018).</li>
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<li>Fujisaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respective+optimal+calcium+concentrations+for+proliferation+on+type+I+collagen+fibrils+in+two+keratinocyte+line+cells%2C+HaCaT+and+FEPE1L-8%5BTitle%5D)+AND+%22Regenerative+Therapy%22%5BJournal%5D)">Respective optimal calcium concentrations for proliferation on type I collagen fibrils in two keratinocyte line cells, HaCaT and FEPE1L-8.</a> Regenerative Therapy. 8, 73-79 (2018).</li>
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<li>Kaur, P., Carter, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin+expression+and+differentiation+in+transformed+human+epidermal+cells+is+regulated+by+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Integrin expression and differentiation in transformed human epidermal cells is regulated by fibroblasts.</a> Journal of Cell Science. 103, 755-763 (1992).</li>
<li>Fujisaki, H., Adachi, E., Hattori, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratinocyte+differentiation+and+proliferation+are+regulated+by+adhesion+to+the+three-dimensional+meshwork+structure+of+type+IV+collagen%5BTitle%5D)+AND+%22Connective+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Keratinocyte differentiation and proliferation are regulated by adhesion to the three-dimensional meshwork structure of type IV collagen.</a> Connective Tissue Research. 49 (6), 426-436 (2008).</li>
<li>Hirose, M., Kosugi, H., Nakazato, K., Hayashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+to+a+quiescent+and+contractile+phenotype+from+a+proliferative+phenotype+of+myofibroblast-like+human+aortic+smooth+muscle+cells+by+culture+on+type+IV+collagen+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Restoration to a quiescent and contractile phenotype from a proliferative phenotype of myofibroblast-like human aortic smooth muscle cells by culture on type IV collagen gels.</a> Journal of Biochemistry. 125, 991-1000 (1999).</li>
<li>Yonemura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Sensitivity+of+Epithelial+Cells+to+Extracellular+Matrix+in+Polarity+Establishment%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Differential Sensitivity of Epithelial Cells to Extracellular Matrix in Polarity Establishment.</a> Plos One. 9, 112922(2014).</li>
<li>Sato, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Possible+Involvement+of+Aminotelopeptide+in+Self-assembly+and+Thermal+Stability+of+Collagen+I+as+Revealed+by+Its+Removal+with+Proteases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Possible Involvement of Aminotelopeptide in Self-assembly and Thermal Stability of Collagen I as Revealed by Its Removal with Proteases.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (33), 25870-25875 (2000).</li>
<li>Nakazato, K., Muraoka, M., Adachi, E., Hayashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gelation+of+lens+capsule+type+IV+collagen+solution+at+a+neutral+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Gelation of lens capsule type IV collagen solution at a neutral pH.</a> Journal of Biochemistry. 120, 889-894 (1996).</li>
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<li>Henriet, P., Zhong, Z. D., Brooks, P. C., Weinberg, K. I., DeClerck, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contact+with+fibrillar+collagen+inhibits+melanoma+cell+proliferation+by+up-regulating+p27KIP1%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Contact with fibrillar collagen inhibits melanoma cell proliferation by up-regulating p27KIP1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (18), 10026-10031 (2000).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+levels+of+reactive+oxygen+species+in+murine+preadipocyte+3T3-L1+cells+cultured+on+type+I+collagen+molecule-coated+and+gel-covered+dishes+exert+opposite+effects+on+NF-%CE%BAB-mediated+proliferation+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Research%22%5BJournal%5D)">Differential levels of reactive oxygen species in murine preadipocyte 3T3-L1 cells cultured on type I collagen molecule-coated and gel-covered dishes exert opposite effects on NF-κB-mediated proliferation and migration.</a> Free Radical Research. 28, 1-16 (2018).</li>
</ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

포함 한 일부 ECM 구성 요소 유형 I 교원 질, 양식 3 차원 구조 생체 조건1. 에 같은 3 차원 배양, 젤 기판 2 차원, 플라스틱 표면에 더 많은 생리 적 조건 보다 vitro 제공1,2,,34. 젤 문화 방법에 관한 수많은 프로토콜 보고 되었습니다, 그리고 유형 I 교원 질1,2,,34,6,7, 사용 하 여 11,15, 유형 IV의 콜라겐14,및 Matrigel16. 유형 I 그것의 풍부 및 취급의 용이성 때문에 콜라겐은 잘 정의 되 고 널리 사용 소재. 정제 타입의 특징 나 콜라겐 동물 종, 나이, 및 정화 방법5,17에 따라 달라 집니다. 유형 I 콜라겐 아세트산 및 프로 테아 제, 펩 신, papain, 및 proctase5,17등을 사용 하 여 순화 될 수 있다. 산-수용 성 콜라겐 아미노 telopeptides 및 프로 테아 제-수용 성 콜라겐은 쪼개진된 아미노 telopeptides5,17유지 합니다. 아미노-telopeptides 예약된 기간 프로 테아 제, 종류에 따라 다릅니다 및 telopeptides의 존재 fibril 형태에 영향을 미치는 젤 힘5,17. 산-수용 성 콜라겐 소의 점도 효소 처리 collagens17의 그것 보다 큽니다. 이 연구에서 우리는 산 성 사용 소 유형 I 교원 질. 펩 신 solubilized 콜라겐이 젤 문화 프로토콜;에서 사용할 수 있습니다. 그러나, 젤 강도가 약한17입니다. 재료에 이러한 차이 셀 행동 차이 발생할 수 있습니다 하지만 그들은 현재 잘 이해 되지.
이 연구에서 설명 젤 문화 프로토콜은 매우 간단 합니다. 이 방법의 많은 수정 보고 되었습니다. Keratinocytes의 문화에 대 한 한 가지 가능한 수정 지하실 멤브레인을 모방 하는 것입니다. 유형 IV 교원 질 젤 시험관15,18에 지하실 막 같은 기판 구조를 유지 하는 수 있습니다. 그러나, 긴 잠복기는 종류 IV 콜라겐 젤14,,1518의 준비를 위해 필요 합니다. 대신, 유형 IV 교원 질과 혼합 유형 I 교원 질 젤 소설 문화 기판 생성할 수 있다 (유형 I / IV 콜라겐 하이브리드 젤 타입)19. 이러한 하이브리드 젤 쉽게 처리, 겔 화, 짧은 시간 필요 하 고 항복 keratinocytes에 대 한 더 많은 지하실 막 같은 조건. 에 유형 I/유형 IV 교원 질 하이브리드 젤, keratinocytes 생존, 식민지, 양식과 터미널 차별화19유도. 이 하이브리드 메서드는 다양 한 응용 프로그램.
젤에 문화를 사용 하 여 유형 I 교원 질에 영향을 미치는 암 세포. fibril 형태에서 유형 I 교원 질, Akt 활성화 및 Caco-2 셀 (결 장 암 세포 선)의 성장을 억제7. 또한, fibril 형태에 인간 흑색 종 세포 (M24met)의 성장은 G1/S 검사점20에서 체포 됩니다. 또한, 반응성 산소 종의 현저 하 게 증가 시킨된 수준 murine 3T3-L1 preadipocytes fibril 양식에 양식에서 관찰 된다. 또한, 세포 증식 및 비-섬유에 의해 반대 방향으로 자극 하 고 fibril 형태의 유형 I 교원 질21.

중간 결합 조직을 구성 하는 3 차원 단백질 채널 이기종 구성의 주로 구성 된 형식의 나 콜라겐 소1. 교원 질 소 셀1,2,3 에 대 한 비 계 서 핵심 역할을 하 고 다른 세포 외 기질 (ECM) 단백질3와 상호 작용. 생체 외에서, 다른 형태의 유형 I 교원 질 처리에 따라 세포 배양에 대 한 기판으로 사용할 수 있습니다1,2,,3방법4. 산 성 조건 하에서 유형 I 콜라겐 유지 비-섬유 양식5. 코팅 비 섬유 형태와 문화 요리 표면 세포 접착 및 확산6,7촉진 합니다. 유형 I 교원 질 분자 생리 적 pH와 온도, 3 차원 구조1,2,,34, 를 가진 젤을 형성 하는 소에 재조립 5,6,,78. 몇 가지 중요 한 차이점 fibril 비 섬유 형태의 유형 사이 나 콜라겐 매트릭스 강성과 문화1동안 ECM 구성 요소 셀으로의 개조의 효율성을 포함 하 여 있다. 매트릭스 강성 셀 문화1, 9의 가장 공부 규제 요인 중 하나입니다. 그러나, 기질과 세포 사이 복잡 한 상호 작용을 명확히 해야 남아 있다. 셀과 환경 요인 간의 복잡 한 상호 작용을 검사 하는 간단한 시스템이 유용 합니다. 콜라겐의 두 가지 형태에 세포 행동의 비교는 환경 요인의 영향을 단순화 하는 데 도움이 있습니다. 내가 다른 형태의 유형, 그들의 사용의 목적에 따라 콜라겐 선택적으로 사용할 수 있습니다. 일반적으로, keratinocytes 지하실 멤브레인와 접촉 하지만 유형 I 교원 질 하지. 그러나, 상처 치유, 동안 keratinocytes 피부 결합 조직으로 이동, 확산, 그리고10의 상처 치유.
최근에, 우리는 세포 외 칼슘의 농도 keratinocyte의 확산에 대 한 중요 한 증명 fibril 형태의에 문화 시스템을 사용 하 여 라인 셀 유형 I 교원 질 피부 결합 조직11을 흉내 낸. FEPE1L-8의 fibril 형태에 경작 되었다 keratinocyte 셀 라인 유형 I 교원 질 때 셀의 모양을 라운드 되었고 그들의 proliferations는 30 μ M11의 세포 외 칼슘 농도에서 중단 했다. 1.8 m m 칼슘 농도 증가, 세포 성장을 복구 된11했다. 셀 두 칼슘 농도 (30 μ M, 1.8 m m)에서 성장 했다 그들이 때 fibril 양식에 양식 exogenous 칼슘 농도에 더 민감한 반면 비-섬유 양식11, 경작 하는 경우. FEPE1L-8 papillomavirus 유형 16 변형 유전자 E6 transfection을 통해 생성 된 및 E7 인간의 자 궁 경부 암, tumorigenic에서 정상적인 keratinocytes 같은 잠재적인 제한 된 차별화 된 무제한 확산을 억제 12,13. FEPE1L-8 셀 K110 유형-II를 포함 하 여 추가 보완 K-1 (K110)6keratinocyte 특정 매체의 어떤 종류를 사용 하 여 유지할 수 있습니다. 여기, 우리는 비-섬유에 인간의 keratinocyte 셀 라인의 문화 프로토콜을 설명 하 고 fibril 형태의 유형 I 교원 질.

<table><tbody><tr><td>소 혈청 (BSA)에서 추출한 알부민</td><td>Merck KGaA</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>1 % BSA&nbsp;</td><td>Merck KGaA</td><td>A4503</td><td>100 mL의 PBS (-)에 BSA 분말 1 g을 용해시키고 여과액을 선택하십시오.</td></tr><tr><td>세포 계수 키트 -8</td><td>Dojindo Molecular Technologies, Inc.</td><td>347-07621</td><td>테트라졸륨 염, 2-(2-메톡시-4-니트로페닐)-3-(4-니트로페닐)-5-(2,4-디설포페닐)-2H&nbsp; 테트라 졸륨, 일 나트륨 염 (WST-8)&nbsp;</td></tr><tr><td>콜라겐 I형(수용성 콜라겐)</td><td>Nippi Inc.</td>소에서 추출한 <td>ASC-1-100-20</td><td>(다른 모든 종 사용 가능, 농도는 3.0mg/mL</td></tr><tr><td>일회용 멤브레인 필터 장치 DISMIC 셀룰로오스 아세테이트</td><td>ADVANTEC Co., LTD.</td><td>25CS020AS</td><td>0.2 &마이크로; M 모공 크기</td></tr><tr><td>인간 각질 세포 라인 세포&nbsp; 페페1L-8</td><td></td><td></td><td>&nbsp; W.G. Carter 박사 기증 (Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, WA)&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>K-1</td><td>쿄쿠토 제약 주식회사</td><td></td><td>BSA 500 mg, 소 뇌하수체 추출물 500 mg, 인슐린 2.5 mg, 0.05 &micro가 함유 된 28204 첨가제 보충제; h-EGF g, 헤파린 5 mg</td></tr>, <tr><td>K110 II형 매체</td><td>교쿠토 제약 제약</td><td>28204</td><td>각질세포 기저배양액&nbsp;</td></tr><tr><td>K110 Type-II 매체 K-1 및 페니실린 스트렙토 마이신 (K110)</td><td>Kyokuto Seiyaku Inc.</td><td>28204</td><td>K110 type-II 각질세포 기저 배양 배지 500mL에 페니실린-스트렙토마이신 5mL와 첨가제 보충제(K-1) 10mL를 추가합니다.</td></tr><tr><td>PBS (-)&nbsp;</td><td>Merck KGaA</td><td>P-5368</td><td>PBS (-) 분말 1 파우치를 탈이온수 1000 mL에 녹이고 여과액;</td></tr><tr><td>10x PBS (-)</td><td>Merck KGaA</td><td>P-5368</td><td>PBS (-) 분말 1 파우치를 탈이온수 100 mL에 용해시키고 여과액;</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>MP Biomedicals, LLC</td><td>는</td><td>페니실린 G 10,000 단위/mL와 10,000&mu를 1670049; 생리학적 식염수에 스트렙트마이신 황산염의 g/mL</td></tr> 인<tr><td>산염 완충 식염수 BioPerformance CertiCertified, pH 7.4</td><td>Merck KGaA</td><td>P-5368-10 팩</td><td></td></tr><tr><td>돼지 췌장에서 추출한 트립</td>신 <td>Merck KGaA</td><td>T4799</td><td></td></tr><tr><td>0.05 % 트립신&nbsp;</td><td>Merck KGaA</td><td>T4799</td><td>500 mL의 PBS (-)&nbsp; 및 여과액&nbsp; 0.25 g&nbsp; 트립신 0.25 g 및&nbsp; EDTA.2Na 0.186 g을 용해&nbsp;</td></tr><tr><td>대두에서 나온 트립신 억제제</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical corporation</td><td>202-20123</td><td></td></tr><tr><td>트립신 억제제&nbsp;</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical corporation</td><td>202-20123</td><td>50 mg의 트립신 억제제와 500 mg의 BSA를 500 mL의 PBS (-)와 여과액에 용해;</td></tr></tbody></table>

keratinocyte 확산에 2-및 3 차원의 평가 유형 i 교원 질 기판

Evaluation of Keratinocyte Proliferation on Two- and Three-dimensional Type I Collagen Substrates

유형 I 교원 질, 두 가지 형태로 존재 하는 세포 배양을 위한 기질으로 유용: 2 차원, 비-섬유 형태와 3 차원, fibril 형태. 두 폼 같은 준비 될 수 있다 유형 I 교원 질. 일반적으로, 비-섬유 양식 세포 접착 및 확산을 촉진합니다. Fibril 형태 (젤) 셀;의 많은 종류에서 더 많은 생리 적 조건 제공 따라서, 젤 문화 셀, 약물 효능 등의 생리 적 행동을 조사 하기 위한 유용 합니다.
연구원은 그것의 사용의 목적에 따라 적절 한 형태를 선택할 수 있습니다. 예를 들어 keratinocytes의 경우에 젤 문화 모델을 치유 하는 상처로 사용 되었습니다. FEPE1L-8, keratinocyte 셀 라인 교양 형식의 비 섬유 형태에 나 콜라겐, 세포 접착을 촉진. 특히, keratinocyte 확산이 느립니다 fibril 형태에 비 섬유질 형태 보다. 준비에 대 한 프로토콜 유형 I 교원 질 세포 배양은 간단 하 고 실험적인 요구에 따라 다양 한 응용 프로그램.

문화 요리를 사용 하 여 표면 처리의 도식 표현 유형 I 콜라겐은 그림 1에 표시 된. 비 섬유 및 fibril 양식에 관찰 세포 형태학 각각 그림 2의 왼쪽 및 오른쪽 패널에 표시 됩니다. 2 h (상위 패널)과 3 일 (낮은 패널) FEPE1L-8 세포 배양 했다. 경작의 초기 2 h, 셀 준수 하 고 콜라겐 (그림 2, 상단 패널)의 두 형태에 확산. 시드, 후 3 일 비 섬유 형태에 셀 확산과 세포 수 증가 (그림 2, 하단 왼쪽된 패널)을 계속 했다. 반면, fibril 형태에 셀 제한 확산 (그림 2, 낮은 오른쪽 패널) 보여주었다. FEPE1L-8 세포 나 콜라겐 (그림 3, 검은 실선, 폐쇄 검은 동그라미) 타입의 비 섬유 형태에 증식을 계속 고 치료 접시에 표면 (그림 3, 회색 선, 닫힌된 회색 원이 점선). 반면, 셀 fibril 형태 (그림 3, 점선, 오픈 서클)에 확산 되지 않았다. 그림 2 및 그림 3 후지사키 외11에서 수정 되었습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59339/59339fig1v2.jpg"> 그림 1 : 문화 요리 표면의 도식 표현 치료 유형 나 콜라겐. 산 성 조건 입력 난 콜라겐 분자 흡착 비 섬유 형태로 (왼쪽된 패널) 접시의 표면에. 37 ° C에서 중립 조건 입력 난 콜라겐 분자는 소로 재조 립 하 고 흡착 젤 형태로 (오른쪽 패널)의 표면에. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59339/59339fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59339/59339fig2.jpg"> 그림 2 : FEPE1L-8 셀의 형태. FEPE1L-8 셀 K110 비 섬유 형태를 사용 하 여 경작 했다 (10 µ g/mL; 왼쪽된 패널) 또는 fibril 양식 (1 mg/mL; 오른쪽 패널)의 유형 I 교원 질 2 h (상위 패널) 또는 3 일 (낮은 패널). 흰색 막대 표시 100 µ m. 그림 2 수정 되었습니다 후지사키 외에서 그림 1E-H11에. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59339/59339fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59339/59339fig3v3.jpg"> 그림 3 : FEPE1L-8 셀의 확산. 실행 가능한 세포의 수 비-섬유 양식 (검은 실선, 채워진된 검은 동그라미)에 견적 되었다 또는 fibril의 형태 (점선, 오픈 원) 나 콜라겐, 또는 입력 치료 접시 표면 (회색 점선, 회색 채워진된 동그라미) 2 h, 1 일, 그리고 3 일. Triplicates에서 실험 수행 및 값 의미 + sd.로 표시 됩니다. 이 그림은 그림 1J11에 후지사키 외에서 수정 되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59339/59339fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

여기, 우리는 두 가지 다른 형태의 문화 기판의 준비에 대 한 프로토콜 제시 활용 유형 I 교원 질. 콜라겐, 처리 하는 방법을 따라 콜라겐 분자 2 차원, 비-섬유 형태를 유지 하거나 3 차원, fibril 형태로 재조립 합니다. 세포 증식에 유형 I 교원 질 크게 fibril 형성에 의해 영향을.

Keratinocyte 확산에 2-및 3 차원의 평가 유형 I 교원 질 기판

Type I collagen, useful as a substrate for cell culture, exists in two forms: the two-dimensional, non-fibrous form and three-dimensional, fibril form. ...

본 비디오는 타입 I 콜라겐과 2차원 및 3차원 배양 방법을 사용하여 두 가지 유형의 세포 배양 기판을 준비하는 방법을 보여줍니다. 3차원 배양 방법은 생물학적 환경으로 간주되며, 3차원 배양 기판을 쉽게 제조하는 방법을 보여주는 연구가 유용하다. 수많은 세포 유형에서 동일한 콜라겐을 사용했음에도 불구하고 세포 동작은 2차원 및 3차원 기질 마다 상당히 다릅니다.3차원 배양기판을 사용하면 살아있는 유기체와 더 유사한 세포 행동을 쉽게 검사할 수 있습니다. 이 방법은 매우 간단하며 최소한의 특수 시약이 필요합니다. 이 방법을 쉽게 시도하고, 3차원 젤이 깨지기 쉽고 제대로 취급하는 것이 매우 중요하기 때문에 시각적 데모는 매우 중요합니다.시작하려면 적절한 배양 매체를 준비하십시오. 콜라겐 준비를 시작하려면 10x PBS, 탈이온수, 콜라겐, 96웰 컬쳐 플레이트, 빈 2밀리리터 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 파이펫을 사용하여 1.12 밀리리터의 탈온화된 물을 빈 2밀리리터 튜브에 넣습니다.10x PBS의 마이크로리터 200개를 탈온화물에 넣고 튜브를 여러 번 부드럽게 흔들어 줍니다. 사용하기 직전에 0.66 밀리리터의 콜라겐을 2밀리리터 튜브에 추가하십시오. 튜브를 여러 번 부드럽고 빠르게 흔들어 줍니다.이 콜라겐 용액 100마이크로리터를 96웰 배양판의 각 웰에 부어 우물의 전체 표면을 덮습니다. 왼쪽에서 오른쪽 동작으로 접시를 부드럽게 흔들어 줍니다. 이산화탄소 인큐베이터에서 1시간 동안 섭씨 37도의 배양판을 배양한다.그런 다음 접시를 기울여 콜라겐의 겔화를 확인하고 배양판을 깨끗한 벤치로 옮습니다. K110의 마이크로리터 150마이크로리터를 젤에 부드럽게 붓고 우물의 벽을 따라 파이펫을 넣습니다. 이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다.그 후 문화판을 깨끗한 벤치로 옮는다. 세포 배양 직전에 파이펫을 사용하여 K110을 부드럽게 폐기하십시오. 먼저 파이펫을 사용하여 1.5 밀리리터 튜브에 1밀리머 염산 1.2 밀리리터에 콜라겐 4 마이크로리터를 추가하고 부드럽게 혼합합니다.이 콜라겐 혼합물 100마이크로리터를 새로운 96웰 배양판의 각 웰에 붓습니다. 접시를 왼쪽에서 오른쪽으로 부드럽게 흔들고 실온에서 1 시간 동안 배양합니다. 그 후 콜라겐 용액을 폐기하십시오.파이펫을 사용하여 PBS로 각 것을 잘 씻으시면 됩니다. 배양판의 각 웰에 1%BSA 및 PBS의 150 마이크로리터를 추가하고 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 세포 배양 이전에는 1%BSA 용액을 폐기하십시오.시작하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 FEPE1L-8 세포와 K110, 트립신 및 트립신 억제제를 준비한다. 배양 접시에서 배지를 조심스럽게 제거하고 파이펫을 사용하여 0.05 %의 트립신3 밀리리터를 추가하십시오. 접시를 다시 이산화탄소 인큐베이터에 넣고 섭씨 37도에서 5분간 배양합니다.그런 다음 10배율로 위상 조영 현미경을 사용하여 배양 접시 표면에서 세포 분리를 확인합니다. 트립신 억제제의 3 밀리 리터를 추가하고, 15 밀리리터 원심 분리기 튜브에서 분리 된 세포를 수집하는 파이펫을 사용합니다. 원심 분리기는 5 분 동안 200 배 g에서.그 후, 상체를 버리고, K110의 10 밀리리터에서 펠릿을 다시 놓습니다. 10배율의 상 대비 현미경검사를 사용하여 세포를 계산하고, K110을 사용하여 세포를 밀리리터당 50, 000 세포의 세포 밀도로 희석한다. 부드럽게 우물의 벽을 따라 파이펫하여 배양 판의 각 우물에 셀 서스펜션의 0.1 밀리리터를 시드.적절한 시간 동안 37도의 이산화탄소 인큐베이터에서 배양하십시오. 먼저 테트라졸륨 소금130마이크로리터와 WST-8을 예열된 K110 1.3밀리리터와 2밀리리터 튜브에 섞는다. 배양판을 깨끗한 벤치로 옮기고 파이펫을 사용하여 우물에서 K110을 부드럽게 버립니다.K110으로 부드럽게 씻어 내고 참신하지 않은 세포를 씻으십시오. 그런 다음 각각의 우물에 WST-8과 혼합 된 K110의 110 마이크로 리터를 추가합니다. 이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 2시간 동안 배양합니다.그 후 문화판을 깨끗한 벤치로 옮는다. 각 우물에서 조건된 배지의 100 마이크로리터를 수집하고 새로운 96웰 배양판의 우물로 옮습니다. 마이크로 플레이트 판독기를 사용하여 450 나노미터의 흡광도를 측정하고 실행 가능한 셀수를 추정합니다.세포 형태는 비 섬유종 및 피브릴 형태에서 관찰되며 여기에 표시됩니다. 배양의 처음 2 시간에서, 세포는 콜라겐의 두 형태에 부착하고 퍼짐. 파종 후 3일 후, 비섬유질 형태의 세포가 계속 퍼지고 세포 수가 증가하고, 피브릴 형태의 세포는 제한된 확산을 보여준다.FEPE1L-8 세포는 I 형 콜라겐의 비 섬유형태와 처리되지 않은 접시 표면에 계속 증식하고 있습니다. 대조적으로, 세포는 피브릴 양식에 증식하지 않습니다. 이 절차를 시도할 때, 3차원 젤이 매우 연약하다는 것을 기억하는 것이 중요합니다.하나는 솔루션 이나 팁 젤과 직접 접촉 하지 않도록 주의 해야 합니다. 이 메서드는 여러 가지 방법으로 수정할 수 있습니다. 예를 들어, 표본의 멤브레인 성분을 혼합하기 위해 지하 멤브레인을 모방한 세포 배양 기판을 만들 수 있다.수많은 경우에, 살아있는 바디에 있는 세포외 매트릭스의 기능은 불명합니다. 3차원 배양에 세포를 배양하기 위해, 살아있는 몸과 더 유사한 세포외 매트릭스 성분의 기능을 검사할 수 있다. 3차원 겔 배양 기술을 적용함으로써 세포내 약물의 농도를 효과적으로 테스트할 수 있다.이 프로토콜은 자신의 목적에 따라 겔화 중에 다른 EGM 구성 요소 또는 성장 인자를 혼합하여 복잡한 3 차원 배양 기판을 개발하는 데 사용될 수 있습니다.

evaluation-keratinocyte-proliferation-on-two-three-dimensional-type-i

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

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