세포 외 매트릭스 내에서 임베디드 공학 3 차원 상피 조직

본 절차의 목적은 분지 형태 형성(branching morphogenesis)에 미치는 기계적 응력의 영향 등을 결정하는 것과 같은 다양한 실험적 상황에서 사용할 수 있도록, 콜라겐 젤에 내장된 동일한 3차원 조직 배양 체계를 구축하는 것입니다. 이 방법은 집단 세포 행동의 근본적인 메커니즘을 규명하는 등 조직 형태 형성과 관련된 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 공학적으로 설계된 조직의 기하학적 구조를 제어하고 재현할 수 있어, 물리적 및 생화학적 요인을 정밀하게 조작하고 측정할 수 있다는 점입니다.

따라서 표본 크기가 충분히 커서 높은 통계적 신뢰도로 결론을 도출할 수 있습니다. 먼저 표준 포토리소그래피 기술을 사용하여 원하는 어레이가 포토패턴된 실리콘 마스터를 준비하십시오. 이 비디오에서 사용된 패턴은 200 µm 간격으로 배치된 직사각형 구조로 이루어져 있습니다.

다음으로, 일회용 접시에 프리폴리머와 경화제를 10:1 비율로 혼합하여 PDMS 50 grams를 섞습니다. 그 다음, 혼합 과정에서 유입된 기포를 제거하기 위해 혼합물을 15~30분 동안 진공 상태에 둡니다. 실리콘 마스터의 텍스처 면이 위로 오도록 플라스틱 웨잉 보트에 놓고, 탈기된 PDMS 용액을 몰드 위에 붓습니다.

그 다음, 디쉬를 오븐에 넣고 PDMS를 60 °C에서 12시간 동안 경화시킵니다. 경화가 완료되면 플라스틱 용기에서 PDMS와 마스터를 꺼냅니다. 실리콘 웨이퍼에서 PDMS를 조심스럽게 분리합니다.

그런 다음, 깨끗한 면도날을 사용하여 각인된 패턴 주변의 과잉 PDMS를 제거합니다. 이제 면도날을 사용하여 패턴이 형성된 PDMS를 개별 직사각형 스탬프로 절단합니다. 이 스탬프들을 깨끗한 100 millimeter 직경의 페트리 접시에 패턴 면이 위로 향하게 하여 보관합니다.

다음으로, 프리폴리머와 경화제의 비율을 동일하게 10:1로 하여 탈기된 PDMS 용액을 새로 준비합니다. 이 용액 2~3g을 직경 100mm의 페트리 접시에 스핀 코팅한 후, 60°C에서 12시간 동안 PDMS를 경화시킵니다. 그 다음, 면도날을 사용하여 얇은 PDMS 층을 직사각형 모양으로 잘라 스탬프의 지지대로 사용합니다.

각 스탬프당 두 개의 지지대가 필요합니다. 모든 지지대를 절단한 후, PDMS 스탬프와 지지대를 70% ethanol에 담가 멸균하고 생물안전작업대 내에서 흡입기로 건조시킵니다. 생물안전작업대에서 각 스탬프 상단에 PBS에 희석한 1% BSA 50 µL를 첨가합니다.

BSA가 스탬프 표면에 흡착되도록 드롭렛으로 덮인 스탬프를 4 °C에서 최소 4시간 동안 보관하십시오. 그 다음, 스탬프를 생물안전작업대(biosafety cabinet)로 옮겨 PDMS 스탬프에서 BSA 용액을 흡입하여 제거하십시오. 이어서, 50 µL의 세포 배양 배지로 스탬프 표면을 2회 세척하십시오.

각 세척 단계 후에 배지를 흡입하여 제거하십시오. 각 PDMS 스탬프당 하나씩 35 mm 직경의 조직 배양 접시를 준비하십시오. 각 접시에 두 개의 PDMS 지지대를 PDMS 스탬프의 길이보다 약간 짧은 간격으로 배치하십시오.

그 다음, 핀셋을 사용하여 직경 15 millimeter 유리 커버슬립을 집어 70% ethanol로 멸균합니다. 핀셋으로 커버슬립을 잡은 상태에서 과잉 액체를 흡입하여 제거한 후, 별도의 페트리 접시에 보관합니다. 이어서, PDMS 스탬프의 표면을 고르게 코팅하기 위해 각 스탬프 위에 4 mg/mL 콜라겐 혼합물 50 µL를 직접 분주합니다.

핀셋을 사용하여 콜라겐이 코팅된 PDMS 스탬프를 각각 집어 조심스럽게 뒤집습니다. 뒤집힌 스탬프의 콜라겐 면이 아래로 향하게 하여 조직 배양 접시 내의 PDMS 지지대 위에 놓습니다. 그런 다음, 접시를 37 °C에서 30분 동안 배양합니다.

다음으로, 남은 콜라겐 혼합물 50 µL를 각각의 원형 커버슬립 위에 분주하고 37 °C에서 30분 동안 배양합니다. 이 시점에서 분석하고자 하는 세포 유형을 수확합니다. 여기서는 1~10 million cells/mL 농도로 부유시킨 EpH4 마우스 유선 상피 세포를 사용하였습니다.

이제 인큐베이터에서 젤화된 콜라겐 샘플을 꺼냅니다. 핀셋을 사용하여 PDMS 스탬프를 수직으로 조심스럽게 들어 올려 성형된 콜라겐에서 분리한 후 폐기합니다. 콜라겐 젤의 구조가 변형되지 않도록 스탬프를 반드시 수직으로 들어 올려야 합니다.

원하는 기하학적 구조로 성형된 공동(cavity)이 포함된 각 콜라겐 겔 표면에 농축된 세포 현탁액 30 microliters를 분주합니다. 디쉬를 좌우로 부드럽게 흔들어 세포가 공동 내로 가라앉도록 유도하며 명시야 현미경으로 세포를 관찰합니다. 공동은 5분 이내에 채워져야 합니다.

공동 주변의 과잉 세포를 제거하려면, 각 조직 배양 접시를 옆으로 기울인 후 400 µL의 세포 배양액을 콜라겐 겔 표면에 조심스럽게 분사합니다. 겔 표면의 과잉 세포는 제거하되 겔 공동 내의 세포가 밀려나지 않도록, 접시를 기울인 상태에서 배양액을 천천히 분사하여 부드럽게 세척하는 것이 중요합니다. 액체를 흡입하여 제거하고 세척 과정을 두 번 더 반복합니다.

각 세척 단계 사이에 현미경으로 콜라겐 겔을 확인하여 과잉 세포가 모두 씻겨 나갔는지 관찰하십시오. 세포가 채워진 공동 주변의 과잉 세포가 제거되면, 조직 배양 접시를 37 °C의 배양기에 넣고 15분 동안 유지합니다. 그런 다음, 핀셋을 사용하여 콜라겐이 코팅된 유리 커버슬립을 조심스럽게 뒤집어 세포가 채워진 콜라겐 몰드 위에 올려놓아, 커버슬립의 콜라겐이 세포가 채워진 공동의 덮개 역할을 하도록 합니다.

샘플을 37 °C에서 15분 동안 배양합니다. 콜라겐 캡이 세포가 채워진 콜라겐 몰드에 부착되면, 겔 상단의 유리 커버슬립 위로 세포 배양액 2~2.5 mL를 천천히 분주하고 샘플을 37 °C에서 1~3일 동안 배양합니다. 이 이미지들은 세포 파종 전 제1형 콜라겐 겔로 성형된 어레이의 저배율 및 고배율 확대 뷰입니다.

웰의 모양은 실리콘 마스터 상의 피처 모양에 의해 결정됩니다. 여기서는 직사각형 웰에 유선 상피 세포를 채웠습니다. 이 예시에서 200 by 50 micron 크기의 각 직사각형 웰에는 약 80~100개의 세포가 포함되어 있습니다.

세포 파종 24시간 후, 세포들이 웰 내에서 서로 부착되어 조직을 형성하는 것이 관찰되었습니다. 배양액에 성장 인자인 HGF를 첨가하고 24시간이 지나자, 조직에서 분지 형태 형성(branching morphogenesis)이 일어나는 것이 보입니다. 세포 이동에 관여하는 단백질 중 하나는 focal adhesion kinase이며, 이 합성 이미지에서 볼 수 있듯이 분지가 일반적으로 발생하는 웰의 끝부분에서 발현이 증가합니다.

이 기술을 숙달하면 적절히 수행했을 때 2시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차 이후에 traction force microscopy, 실시간 RT-PCR 및 Western Blotting과 같은 다른 방법들을 수행하여 세포가 이동할 때 가하는 힘과 관심 유전자의 전사체 및 단백질 수준의 변화를 결정할 수 있습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 정의된 초기 기하학적 구조를 가진 조직이 콜라겐 겔 내에 내장된 3D 세포 배양 모델을 설정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

시청해 주셔서 감사하며, 귀하의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.