Name: 세포 외 매트릭스 내에서 임베디드 공학 3 차원 상피 조직 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: 배우세요 조직 공학을 통해 콜라겐 겔에 임베디드된 균일한 3차원 상피 조직을 제작하는 방법을. 이 기술은 기계적 응력이 세포 행동에 미치는 영향을 정밀하게 연구할 수 있게 합니다.

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이 작품은 NIH (HL118532, HL120142, CA187692), 데이비드 &amp; 루실 패커드 재단, 카밀 &amp; 헨리 드레퓌스 재단과 버로우즈에서 교부금에 의해 부분적으로 지원되었다 기금에 오신 것을 환영합니다. ASP는 샬롯 엘리자베스 프록터 경어 원정대에 의해 부분적으로 지원되었다.

솔루션 1. 준비 <ol><li> 인슐린의 5 ㎎ / ㎖ 용액을 제조 하였다 (용매 100 ㎖에 500 mg의 인슐린) O DH이 5mm의 염산 (HCL)과 분말 인슐린 스톡을 희석. 증류수 100 ㎖로 농축 염산 50 μl를 첨가하여 용매 100 ㎖ (DH 2 O)를 준비한다. </li><li> PBS의 1X 용액을 제조하기 위해, 멸균 조건 하에서 DH 2 O로 배일 10 배 인산 완충 용액 (PBS) 원액을 희석. </li><li> 다음으로, 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 탄성 중합체 용액을 제조 하였다 : 1 (w : w)의 비율로 10의 경화제와 함께 PDMS의 예비 중합체를 혼합한다. </li><li> 다음과 같이 세포 배양 배지를 준비 : 재고 둘 베코의 변형 이글 중간의 500 ml의 : 식품 혼합물이 F-12 (DMEM는 / F-12), (10) 살균 소 태아 혈청의 ㎖ (FBS), 겐타 마이신 시약 500 μL 및 추가 5 ㎎ / ㎖의 인슐린 500 μL. </li><li> W (1 % 추가 1X PBS 용액에서 1 % 소 혈청 알부민 (BSA)을 제조: BSA 분말 V) 솔루션은 PBS를 1 배에서 철저하게 혼합합니다. </li><li> 추가 I 콜라겐 중화 소 타입의 4 ㎎ / ㎖ 용액을 제조 50 μL 배 행크의 균형 잡힌 염 용액 (HBSS) 완충액, 30 ㎕의 0.1 N 수산화 나트륨 (NaOH) 30 ㎕의 세포 배양 배지, 주식 콜라겐 400 μL 냉장 1.5 ML의 microcentrifuge 관에. 위아래로 피펫 팅에 의해 천천히 섞는다; 거품을 도입하지 마십시오. 모든 거품을 제거하려면, 간단히 4 ℃에서 혼합물을 원심 분리기. </li><li> 4 (V : V) 1X PBS에서 16 % 파라 포름 알데히드 1을 희석하여 정착 솔루션을 준비합니다. </li><li> 1,000 (절 : v)의 주식 핵 라벨링 솔루션 1을 희석하여 핵 라벨링 솔루션을 준비 1X PBS에서. </li><li> 세제 : 0.3 % (V V)와 1X PBS를 혼합하여 0.3 %의 인산 완충 생리 식염수 및 세제 (PBST) 솔루션을 준비합니다. </li><li> 에서 0.3 % PBST : 염소 혈청을 1시 10분 (절 V)를 희석하여 버퍼를 차단 준비합니다. </li><li> PRI 희석하여 관심있는 특정 단백질에 대한 일차 항체 용액을 준비(예를 들어, 토끼 항 초점​​ 부착 키나아제 (FAK)) 메리 항체 1 : 200 (V : V) 버퍼를 차단한다. </li><li> (: V V)를 차단 완충액에서 1000 (예를 들어, 염소 항 - 토끼 1) 형광 프로브 컨쥬 게이트 항체를 희석하여 차 항체 용액을 제조 하였다. </li></ol> 3D의 미세화에 대한 탄성 스탬프 2. 준비 참고 : 탄성 스탬프는 PDMS로 만들어집니다. <ol><li> 단계 1.3에 기재된 바와 같이 동일한 비율로 PDMS 용액을 철저히 혼합한다. 혼합 과정 중에 도입 된 공기 방울을 제거하기 위해 15 ~ 30 분 동안 진공 챔버에서 혼합물을 놓는다. </li><li> 보트 또는 리소그래피 원하는 형상의 기능을 패턴 화 실리콘 마스터를 포함하는 페트리 접시의 무게를 플라스틱으로 탈기 솔루션을 붓는다. 최상의 결과를 위해 12 시간 ~ 60 ° C에서 PDMS 용액을 경화. 참고 : 실리콘 마스터가 매우 사용자 정의 할 수 있습니다; 이 프로토콜은 50의 크기로 직사각형 구조를 사용μm의 X 200 μm의 × 50 μm의 200 μm의 이격. 실리콘 마스터는 표준 포토 리소그래피 기술을 이용하여 제조 될 수있다. 간단히, 에폭시 계 포토 레지스트를 실리콘 웨이퍼의 상부에 스핀 코팅된다. 원하는 스탬프 기능을 상세히 마스크 후 UV 광에 노출 된 포토 레지스트 - 코팅 된 웨이퍼의 상부에 배치된다. 마스크에 의해 차단되지 바람직한 특징은 광에 노출되며, 포토 레지스트 코팅의 나머지 가용이며 씻겨 수 있지만 이러한 위치에서의 포토 레지스트는 가교 결합된다. </li><li> PDMS가 실리콘 마스터에서 원하는 기능 주위 경화 후, 플라스틱 컨테이너에서 PDMS 마스터를 제거한다. 조심스럽게 실리콘 웨이퍼에서 PDMS를 분리하고 깨끗한 면도날을 사용하여 인쇄 된 기능 주위에서 초과 PDMS를 제거합니다. </li><li> 지금 면도날 개별 사각형 우표에 각인 기능 (~ 8 mm × 5-mm)로 패턴 화 PDMS를 잘라. CLE 이러한 기능 측면까지 보관100 mm 직경의 페트리 접시. </li><li> 또한, 직사각형 스탬프 받침을 단계 1.3에 기재된 PDMS 용액을 사용한다. </li><li> 스핀 코터를 사용하여 100 mm 직경의 페트리 접시에 균일하게 PDMS 용액 ~ 2-3g 확산 단계 2.1에서와 같이 60 ℃에서 ~ 12 시간에 대한 PDMS 치료. 그리고, 면도날을 사용하여, 사각형으로 PDMS의 얇은 레이어 (~ 5mm × 2 mm)를 자른다. 참고 : 두 지원 단계 2.3에서 만든 각 PDMS 스탬프 필요합니다. 지지체는 PDMS 스탬프를 들어 100 mm 직경의 배양 접시에 저장 될 수있다. </li><li> PDMS 스탬프와 지지체는 세포 배양에 사용되기 전에하는 바이오 캐비닛 흡입기 (세포 배양 후드)를 이용하여 70 % 에탄올에 침지하고 건조하여 멸균. </li></ol> 3D 상피 조직 3. 준비 <ol><li> 바이오 안전성 캐비닛에서 각 우표의 상단에 PBS에 1 % BSA의 약 50 μl를 한 방울을 추가합니다. 미니 4 ° C에서 우표 덮여 방울을 배치4 시간의 엄마는 BSA가 도장의 표면에 흡착되도록합니다. </li><li> PDMS의 우표에서 대기음 BSA 솔루션입니다. </li><li> 각 세척 후 흡입, 세포 배양 배지 (스탬프 당 세척 당 50 μL가 충분합니다)로 두 번 우표의 표면을 세척 할 것. </li><li> 곡선 스테인레스 스틸 핀셋을 사용하여 멸균 PDMS 스탬프와 지원을 처리합니다. 각각 스탬프를 PDMS의 바이오 안전성 캐비닛에서 한 35 mm 직경의 조직 배양 접시를 배치. 각각의 접시에서 PDMS 스탬프의 길이보다 약간 작은 거리에 의해 분리 된 두 개의 PDMS 지원을 누워. </li><li> 핀셋을 사용하여, 많은 원형 유리 커버 슬립 살균 (직경 15mm를, # 1) 70 % 에탄올을 이용하여 PDMS 스탬프가 같다. 핀셋으로 그들을 누른 상태에서 커버 슬립에서 초과 액체를 기음. 별도의 100 mm 직경의 페트리 접시에 세척 된 커버를 저장합니다. </li><li> ~ 콜라겐 액 50 μL 균일 코팅의 표면은 PDMS 스탬프 디스펜스. </li><li> 픽업각 콜라겐 코팅 PDMS는 핀셋 스탬프와 부드럽게 반전. PDMS의 상단의 반전 스탬프를 낮추하는 35 mm 직경의 조직 배양에 배치 지지체 콜라겐은 스탬프와 조직 배양 접시의 바닥 사이되도록 걸려. 30 분 동안 37 ° C에서 요리를 품어. </li><li> 원형 커버 슬립 각각에 ~ 나머지 콜라겐 혼합물을 50 μL 분주하고 30 분 동안 37 ° C에서 그들을 부화 (이후,이 완전히 콜라겐을 캡슐화 설계 조직 위에 배치 될 것이다). </li><li> 40 % 컨 플루 ~에서 상피 세포 (예. EpH4 마우스 유선 상피 세포)를 포함하는 100-mm 직경의 조직 배양 접시를 가져옵니다. 세포 배양 배지를 흡인하고 1X PBS 10 ㎖로 한번 세척 하였다. 세포에 트립신 2 ML을 추가하고 5 ~ 10 분 동안 37 ° C에서 품어. </li><li> 조직 배양 접시 트립신으로 세포를 포함하는 접시에서 나머지 부착 세포를 분리 신선한 배지 8 ㎖에 추가. 피펫으로 부드럽게 혼합하고 5 분 동안 100 × g에서 15 ML 원뿔 튜브와 원심 분리기에 세포 혼합물을 이동합니다. </li><li> 원추형 튜브의 상등액을 흡인하고 세포 배양 배지에서 세포 펠렛을 재현 탁. 세포, 혈구 계산을 사용하여 상기 현탁액의 농도를 결정한다. 106 -10 107 세포 / ㎖ ~ 최종 농도를 얻기 위해 현탁액 볼륨을 조정한다. </li><li> 인큐베이터에서 겔화 콜라겐 샘플을 제거합니다. 핀셋 사용하여 부드럽게 성형 콜라겐에서 그들을 분리하고이를 폐기 똑바로 위로 PDMS 스탬프를 들어 올립니다. </li><li> 원하는 형상의 몰드 공동을 포함하는 각 콜라겐 겔의 표면 상 ~ 농축 세포 현탁액 30 μL 분주. 부드럽게 요리의 측면을 흔들면서하는 공동 내에 정착 셀을 촉진하는쪽으로 동안 10X / 0.25 NA 목표와 시야 현미경으로 세포를 관찰한다. 공동는 ~ 5 분 이내에 작성해야한다. </li><li> 연구에, 공동 각국에서 초과 세포를 가져 가십시오 옆으로 각 조직 배양 접시를 기울여 부드럽게 콜라겐 겔의 표면에 세포 배양 배지 μL 400 ~ 분배. 각 세척 사이에 현미경 콜라겐 젤을 확인 액체를 대기음 및 세척을 1-2 번 더 반복한다. </li><li> 과량의 세포가 콜라겐 주형의 셀 채워진 공동 주위에서 삭제 한 후, 15 분 동안 37 ℃에서 세포 배양 용 인큐베이터에 조직 배양 접시를 배치했다. 그런 다음 핀셋을 사용하여 부드럽게 콜라겐 코팅 클래스 커버 슬립을 반전하고, 커버 슬립의 콜라겐이 세포 채워진 캐비티 위에 캡을 형성하도록 셀 가득 콜라겐 금형의 상단에 배치합니다. 15 분 동안 37 ° C에서 샘플을 인큐베이션. </li><li> 콜라겐 뚜껑이 셀 채워진 콜라겐 금형에 부착 한 후, 겔 위에 유리 커버 슬립 위에 천천히 ~ 2-2.5 ㎖의 세포 배양 배지를 분배. 문화 1~3일 37 ° C에서 샘플. 노트:24 시간 후 초기 시드, 상피 조직은 예컨대 상피 성장 인자 (EGF) 또는 분지를 유도하는 간세포 성장 인자 (HGF)와 같은 성장 인자로 처리 될 수있다. </li></ol> 4. 면역 형광 및 이미지 분석 <ol><li> 조직 배양 접시에서 세포 배양 배지를 흡인하고, 세포 - 함유 겔을 커버하기에 충분한 고정 제 용액을 추가한다. 200 rpm에서 진탕 기에서 15 분간 실온에서 인큐베이션 요리. </li><li> 상기 고정 제를 흡인 1X PBS로 조직 배양 접시를 채우고, 200 rpm에서 진탕 기에서 실온에서 15 분 동안 배양한다. 세 총 세척 두 번 반복합니다. </li><li> 조직 배양 접시에서 대기음 PBS와 훽스트 솔루션으로 대체 : 핵 레이블을합니다. 15-20 분 동안 실온에서 인큐베이션. FAK 또는 항체 검출 또 다른 마커 얼룩, 4.5 단계로 건너 뜁니다. </li><li> 핵 라벨 솔루션을 기음과 세포 함유 g을 씻어단계 4.2에서와 같이 1X PBS로 3 회 ELS. 스테인드 샘플을 더 사용할 때까지 4 ℃에서 1X PBS에 저장 될 수있다. </li><li> , 대기음 PBS 조직 배양 접시에서 0.3 % PBST 300 ㎕를 추가하고 실온에서 15 분 동안 샘플을 부화 : 목적 단백질에 대해 염색한다. </li><li> 상기 PBS를 흡인 블로킹 완충액과 겔을 포함하고, ~ 실온에서 4 시간 동안 진탕 (200 RPM)에서 배양한다. </li><li> 대기음 블로킹 완충액 차 항체 용액과 겔을 포함하고, 4 ℃에서 하룻밤 동안 200 rpm에서 진탕 배양한다. </li><li> 일차 항체 용액을 흡인 0.3 % PBST 용액을 추가하고, 실온에서 30 분 동안 200 rpm에서 진탕 배양한다. PBST를 기음과 3-4 시간 동안 매 30 분을 반복합니다. </li><li> 반복 4.7 및 4.8, 이차 항체 용액으로 배양이 시간 단계를 반복합니다. 이차 항체 광표백을 방지하기 위해 알루미늄 호일로 조직 배양 접시를 감싸. FINA 후리터의 세척, 염색 샘플을 추가로 사용할 때까지 4 ° C에서 1X PBS에 저장할 수 있습니다. </li><li> 샘플을 시각화하기 위해, 상피 조직의 중간면에 초점을 맞춘 10X / 0.30 NA 목표를 사용합니다. </li><li> 세포 핵, UV 조명 아래 10X / 0.30 NA 목표를 사용하여 핵 마커로 표지 이미지 고정 샘플을 시각화합니다. </li><li> 거꾸로 형광 현미경에 10X / 0.30 NA 목표를 사용하여 관심의 단백질, 이미지 스테인드 샘플을 시각화합니다. </li><li> 동일한 초기 형상의 다수의 조직 (보통 50 개 이상)의 단백질 염색 빈도 맵을 작성하려면, 먼저 반입 표준 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 이미지들의 각각은 (재료 참조), 8 비트 그레이 스케일로 변환한다. </li><li> 이러한 이미지 임계 값, 그레이 스케일 컷오프 지점을 정의하여 바이너리 (즉, 하프 톤 / 흑백)로 변환; 임계 값 아래 그레이 스케일 값은 검정색되고, 임계 값 위의 사람들은 흰색이된다. 그런 다음, 결합하나의 이미지 스택에 각 이진 이미지의 각. </li><li> 다음에, 적층 된 이미지를 등록 (즉, 일치하거나 일치) 분석 소프트웨어. 많은 이미지 분석 소프트웨어 패키지를 무료로 사용할 수 등록 플러그인이 함께 제공됩니다. <ol><li> 다음 이미지의 정렬을위한 템플릿으로 스택 각 이미지를 사용하여, 전체 스택의 이미지는 전파에 의해 정렬되도록. 마지막으로, 오버레이 (프로젝트) 평균 강도에 기초하여 상기 화상 정렬 스택의 이미지는 픽셀 주파수지도와 단일 이미지를 형성한다. 이 이미지는 색으로 구분 선택 10, 11의 이미지 편집 소프트웨어를 사용 할 수 있습니다. </li></ol></li></ol>

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</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

위에서 설명한 프로토콜은 미리 정의된 모양의 동일한 상피 조직을 생성하는 방법을 간략하게 설명하여 조직의 세포가 경험하는 기계적 응력의 공간적 제어를 가능하게 합니다. 엘라스토머 몰드는 I형 콜라겐에 공동을 만든 다음 상피 세포로 채우고 추가 콜라겐 층으로 덮어 세포가 3D 콜라겐 매트릭스 환경에 완전히 캡슐화되는 데 사용됩니다. 이러한 조직의 추가 배양과 초기 구조에서 분지를 유도하기 위한 성장 인자로 처리하면 이 시스템은 상피 세포의 분지 형태 형성 연구에 적합하게 됩니다. 프로토콜에는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫 번째는 세포 파종 전에 PDMS 몰드를 겔화된 콜라겐에서 똑바로 위쪽으로 들어 올리는 것입니다. 이 단계에서 수평으로 이동하면 캐비티가 왜곡되고 더 이상 원하는 형상을 유지하지 않습니다. 그런 다음 구멍에 세포를 파종한 후 표면에 남아 있는 과도한 세포는 특히 조직에 매우 가까운 경우 패턴 조직의 거동을 방해할 수 있으므로 조심스럽게 씻어내는 것이 중요합니다. 그러나 너무 엄격하게 세척하면 세포가 충치에서...

분지 형태 형성으로 알려진 분 지형 상피 조직의 발달이 세포 유래 물리적 및 환경 인자에 의해 조절된다. 유선에서, 형태 형성을 분기하는 집단 세포 이동이 나무와 같은 구조를 작성하는 가이드를 통해 반복적 인 과정이다. 첫 번째 단계는 분기 개시 신도 1,2- 다음 유관에서 기본 봉오리 형성된다. 주변의 기질에 분기의 침략은 사춘기에서 스테로이드 호르몬의 전신 릴리스에 의해 유도된다. 새 차 싹은 기존 지점의 끝에서 시작하고,이 프로세스는 상피 나무 (3)를 작성하고 있습니다. 많은 중요한 생화학 적 신호가 확인되었지만, 이러한 복잡한 발육 과정은 부족 안내 세포 생물학적 메커니즘의 포괄적 이해. 또한, 특정 단서의 영향에 대한 역학적 연구 체험관에서 해체하기가 어렵습니다생체 내에서 사항은, 같은 정확한 시공간 섭동과 측정은 자주 할 수 없습니다. 이러한 전체 기관 배양 차 organoids 및 세포 배양 모델로서 3 차원 배양 기술은, 체계적 조직 형태 형성 4-6 기본 메커니즘을 연구에 유용한 도구이다. 이러한 이동, 증식 및 분화를 비롯한 세포 다양한 행동에 기계적 힘 생화학 적 신호로서, 각각의 특정 요인의 영향을 결정하는데 특히 유용 할 수있다. 6 설계된 세포 배양 모델 특히 용이 섭동을 사용 각 셀 자신의 미세. 그러한 배양 모델은 A로 유도 할 때 일관성과 재현성 총칭 이전 브랜치를 형성 제어 3D 구조 모델 유방 상피 조직을 설계하는 미세 - 기반 접근 방식을 사용ppropriate 성장 인자. 모델의 주요 이점은 정확하게 조작하고 높은 통계적 신뢰도 기계적 응력 패턴, 물리적 및 생화학 적 요인의 효과를 측정 할 수있다. 이 기술은 함께 전산 모델링 이미 유선 상피 조직 및 다른 지형 7-11 상피의 정상적인 발전이 지침 물리적 및 생화학 적 신호의 상대적 기여도를 결정하는데 사용되었다. 여기서 설명하는 것은 용이 세포 외 기질 (ECM) 겔의 다른 형태로 확장 될 수있는 이러한 모델 조직을 만들기위한 구체적인 프로토콜 및 치료제의 시험을위한 잠재적 수단으로 작용한다.

<table><tbody><tr><td>폴리디메틸실록산(PDMS)</td><td>Ellsworth 접착제</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>PDMS 경화제</td><td>Ellsworth 접착제</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>리소그래피 패턴 실리콘 마스터</td><td>자체 제작</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 계량 보트</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-732-115</td><td></td></tr><tr><td>100mm 직경 페트리 접시</td><td>BioExpress</td><td>D-2550-2</td><td></td></tr><tr><td>에틸 알코올 200 프루프</td><td>Pharmco-Aaper</td><td>111000200</td> dH2O 면도날 American Safety Razor 620179 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1:1 Dulbecco'와 혼합하여 70% EtOH(v:v) 용액을 만듭니다. 의 변형된 독수리' s 미디엄 : 햄' s F12 영양 혼합물 (DMEM/F12) (1:1)</td><td>Hyclone</td><td>SH30023FS</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150H</td><td></td></tr><tr><td>10x Hank' s 평형 염 용액 (HBSS)</td><td>Life Technologies</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>인슐린</td><td>시그마 Aldrich</td><td>I6634-500MG</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Life Technologies</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>10x 인산염 완충 식염수 (PBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP399-500</td><td></td></tr><tr><td>수산화나트륨 (NaOH)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>221465-500G</td><td></td></tr><tr><td>소 유형 I 콜라겐 (펩신화되지 않음)</td><td>소</td> 혈청 (BSA)에서 추출한 Koken <td>IAC-50</td><td></td></tr><tr><td>알부민Sigma</td> <td>Aldrich</td><td>A-7906</td><td></td></tr><tr><td>곡선 스테인리스 스틸 핀셋</td><td>Dumont</td><td>7</td><td></td></tr><tr><td>직경 35mm 조직 배양 접시</td><td>BioExpress</td><td>T-2881-6</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 원뿔형 튜브</td><td>BioExpress</td><td>C-3394-2</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml Eppendorf Safe-Lock Tube</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>원형 #1 유리 커버슬립, 직경 15mm</td><td>Bellco Glass Inc.</td><td>특별 주문</td><td></td></tr><tr><td>0.05% 1x Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>VWR</td><td>100503-916</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Perkin Elmer</td><td>N9300260</td><td>세제</td></tr><tr><td>HGF</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H 9661</td><td>50 mg/ml에서 dH2O에 재현탁</td></tr><tr><td>토끼 안티 마우스 FAK 항체</td><td>생명 기술</td><td>AMO0672</td><td></td></tr><tr><td>염소 안티 토끼 Alexa 488 항체</td><td>Life Technologies</td><td>A-11034</td><td></td></tr><tr><td>Adobe Photoshop</td><td>Adobe</td><td>N/A</td><td>픽셀 주파수 맵의 색상 코딩에 사용됩니다.</td></tr><tr><td>FIJI (ImageJ)</td><td>NIH</td><td>N/A</td><td>픽셀 주파수 맵을 생성하기 위해 이미지를 임계값, 등록 및 오버레이하는 데 사용되는 무료 이미지 분석 소프트웨어입니다. StackReg 플러그인은 바이너리 이미지를 등록하는 데 사용되었습니다.</td></tr></tbody></table>

세포 외 매트릭스 내에서 임베디드 공학 3 차원 상피 조직

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

폐, 신장, 유선과 같은 분지 기관의 구조는 미세 환경에서 다양한 용해성 및 물리적 신호에 의해 조절되는 분지 형태 형성의 발달 과정을 통해 발생합니다. 여기에서는 세포외 기질(ECM) 내에 완전히 내장된 정의된 모양과 크기의 엔지니어링된 3차원(3D) 상피 조직을 형성하여 형태 형성 과정을 분기하는 과정을 연구하기 위해 만들어진 방법을 설명합니다. 이 방법을 사용하면 동일한 조직의 배열을 형성할 수 있으며 조직 기하학, 간격 및 ECM 구성을 포함한 다양한 환경 요인을 제어할 수 있습니다. 이 방법은 또한 견인력 현미경(TFM)과 같이 널리 사용되는 기술과 결합하여 세포와 주변 ECM 간의 상호 작용에 대한 더 많은 정보를 얻을 수 있습니다. 이 프로토콜은 암 침습을 포함하여 형태형성 분지를 넘어 다양한 세포 및 조직 과정을 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

유방 상피 조직의 미세 일반 회로도 실험적인 작업 흐름을 요약 한 미세 가공 절차의 일반 개략도가도 1에 도시되어있다. 결과적으로 완전히 ECM 겔에 포함되는 동일 형상 및 간격의 상피 조직의 배열이다. 대표적인 실험 I가 4 ㎎ / ㎖의 농도로 소 콜라겐 겔 타입의 배양 EpH4 마우스 유방 상피 세포를 사용한다. 설계 조직의 최고 품질을 보장하기 위해, 프로토콜에 설명 된 기술은 밀접하게 따라야한다. 유형으로 성형 된 사각형 우물의 배열도 2A와 2B 쇼 낮은 높은 배율의 뷰 내가 세포 파종하기 전에 젤 콜라겐. 웰의 형상은 실리콘 마스터 기능의 형상에 의해 결정된다. 이 일을 들어하는 것이 중요하다똑바로 콜라겐의 전자 PDMS 몰드 캐비티의 형상이 왜곡되지 않도록.도 2c는</s...

이 원고는 3 차원 (3D)의 균일 한 배열 세포 외 기질에 둘러싸여 정의 형상의 상피 조직을 설계 할 수있는 소프트 리소그래피 기반 기술을 설명합니다. 이 방법은 세포 형태 및 실험 문맥 다양한 의무가 있고 동일한 복제의 높은 처리량의 선별을 허용한다.

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

본 절차의 목적은 분지 형태 형성(branching morphogenesis)에 미치는 기계적 응력의 영향 등을 결정하는 것과 같은 다양한 실험적 상황에서 사용할 수 있도록, 콜라겐 젤에 내장된 동일한 3차원 조직 배양 체계를 구축하는 것입니다. 이 방법은 집단 세포 행동의 근본적인 메커니즘을 규명하는 등 조직 형태 형성과 관련된 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 공학적으로 설계된 조직의 기하학적 구조를 제어하고 재현할 수 있어, 물리적 및 생화학적 요인을 정밀하게 조작하고 측정할 수 있다는 점입니다.따라서 표본 크기가 충분히 커서 높은 통계적 신뢰도로 결론을 도출할 수 있습니다. 먼저 표준 포토리소그래피 기술을 사용하여 원하는 어레이가 포토패턴된 실리콘 마스터를 준비하십시오. 이 비디오에서 사용된 패턴은 200 µm 간격으로 배치된 직사각형 구조로 이루어져 있습니다.다음으로, 일회용 접시에 프리폴리머와 경화제를 10:1 비율로 혼합하여 PDMS 50 grams를 섞습니다. 그 다음, 혼합 과정에서 유입된 기포를 제거하기 위해 혼합물을 15~30분 동안 진공 상태에 둡니다. 실리콘 마스터의 텍스처 면이 위로 오도록 플라스틱 웨잉 보트에 놓고, 탈기된 PDMS 용액을 몰드 위에 붓습니다.그 다음, 디쉬를 오븐에 넣고 PDMS를 60 °C에서 12시간 동안 경화시킵니다. 경화가 완료되면 플라스틱 용기에서 PDMS와 마스터를 꺼냅니다. 실리콘 웨이퍼에서 PDMS를 조심스럽게 분리합니다.그런 다음, 깨끗한 면도날을 사용하여 각인된 패턴 주변의 과잉 PDMS를 제거합니다. 이제 면도날을 사용하여 패턴이 형성된 PDMS를 개별 직사각형 스탬프로 절단합니다. 이 스탬프들을 깨끗한 100 millimeter 직경의 페트리 접시에 패턴 면이 위로 향하게 하여 보관합니다.다음으로, 프리폴리머와 경화제의 비율을 동일하게 10:1로 하여 탈기된 PDMS 용액을 새로 준비합니다. 이 용액 2~3g을 직경 100mm의 페트리 접시에 스핀 코팅한 후, 60°C에서 12시간 동안 PDMS를 경화시킵니다. 그 다음, 면도날을 사용하여 얇은 PDMS 층을 직사각형 모양으로 잘라 스탬프의 지지대로 사용합니다.각 스탬프당 두 개의 지지대가 필요합니다. 모든 지지대를 절단한 후, PDMS 스탬프와 지지대를 70% ethanol에 담가 멸균하고 생물안전작업대 내에서 흡입기로 건조시킵니다. 생물안전작업대에서 각 스탬프 상단에 PBS에 희석한 1% BSA 50 µL를 첨가합니다.BSA가 스탬프 표면에 흡착되도록 드롭렛으로 덮인 스탬프를 4 °C에서 최소 4시간 동안 보관하십시오. 그 다음, 스탬프를 생물안전작업대(biosafety cabinet)로 옮겨 PDMS 스탬프에서 BSA 용액을 흡입하여 제거하십시오. 이어서, 50 µL의 세포 배양 배지로 스탬프 표면을 2회 세척하십시오.각 세척 단계 후에 배지를 흡입하여 제거하십시오. 각 PDMS 스탬프당 하나씩 35 mm 직경의 조직 배양 접시를 준비하십시오. 각 접시에 두 개의 PDMS 지지대를 PDMS 스탬프의 길이보다 약간 짧은 간격으로 배치하십시오.그 다음, 핀셋을 사용하여 직경 15 millimeter 유리 커버슬립을 집어 70% ethanol로 멸균합니다. 핀셋으로 커버슬립을 잡은 상태에서 과잉 액체를 흡입하여 제거한 후, 별도의 페트리 접시에 보관합니다. 이어서, PDMS 스탬프의 표면을 고르게 코팅하기 위해 각 스탬프 위에 4 mg/mL 콜라겐 혼합물 50 µL를 직접 분주합니다.핀셋을 사용하여 콜라겐이 코팅된 PDMS 스탬프를 각각 집어 조심스럽게 뒤집습니다. 뒤집힌 스탬프의 콜라겐 면이 아래로 향하게 하여 조직 배양 접시 내의 PDMS 지지대 위에 놓습니다. 그런 다음, 접시를 37 °C에서 30분 동안 배양합니다.다음으로, 남은 콜라겐 혼합물 50 µL를 각각의 원형 커버슬립 위에 분주하고 37 °C에서 30분 동안 배양합니다. 이 시점에서 분석하고자 하는 세포 유형을 수확합니다. 여기서는 1~10 million cells/mL 농도로 부유시킨 EpH4 마우스 유선 상피 세포를 사용하였습니다.이제 인큐베이터에서 젤화된 콜라겐 샘플을 꺼냅니다. 핀셋을 사용하여 PDMS 스탬프를 수직으로 조심스럽게 들어 올려 성형된 콜라겐에서 분리한 후 폐기합니다. 콜라겐 젤의 구조가 변형되지 않도록 스탬프를 반드시 수직으로 들어 올려야 합니다.원하는 기하학적 구조로 성형된 공동(cavity)이 포함된 각 콜라겐 겔 표면에 농축된 세포 현탁액 30 microliters를 분주합니다. 디쉬를 좌우로 부드럽게 흔들어 세포가 공동 내로 가라앉도록 유도하며 명시야 현미경으로 세포를 관찰합니다. 공동은 5분 이내에 채워져야 합니다.공동 주변의 과잉 세포를 제거하려면, 각 조직 배양 접시를 옆으로 기울인 후 400 µL의 세포 배양액을 콜라겐 겔 표면에 조심스럽게 분사합니다. 겔 표면의 과잉 세포는 제거하되 겔 공동 내의 세포가 밀려나지 않도록, 접시를 기울인 상태에서 배양액을 천천히 분사하여 부드럽게 세척하는 것이 중요합니다. 액체를 흡입하여 제거하고 세척 과정을 두 번 더 반복합니다.각 세척 단계 사이에 현미경으로 콜라겐 겔을 확인하여 과잉 세포가 모두 씻겨 나갔는지 관찰하십시오. 세포가 채워진 공동 주변의 과잉 세포가 제거되면, 조직 배양 접시를 37 °C의 배양기에 넣고 15분 동안 유지합니다. 그런 다음, 핀셋을 사용하여 콜라겐이 코팅된 유리 커버슬립을 조심스럽게 뒤집어 세포가 채워진 콜라겐 몰드 위에 올려놓아, 커버슬립의 콜라겐이 세포가 채워진 공동의 덮개 역할을 하도록 합니다.샘플을 37 °C에서 15분 동안 배양합니다. 콜라겐 캡이 세포가 채워진 콜라겐 몰드에 부착되면, 겔 상단의 유리 커버슬립 위로 세포 배양액 2~2.5 mL를 천천히 분주하고 샘플을 37 °C에서 1~3일 동안 배양합니다. 이 이미지들은 세포 파종 전 제1형 콜라겐 겔로 성형된 어레이의 저배율 및 고배율 확대 뷰입니다.웰의 모양은 실리콘 마스터 상의 피처 모양에 의해 결정됩니다. 여기서는 직사각형 웰에 유선 상피 세포를 채웠습니다. 이 예시에서 200 by 50 micron 크기의 각 직사각형 웰에는 약 80~100개의 세포가 포함되어 있습니다.세포 파종 24시간 후, 세포들이 웰 내에서 서로 부착되어 조직을 형성하는 것이 관찰되었습니다. 배양액에 성장 인자인 HGF를 첨가하고 24시간이 지나자, 조직에서 분지 형태 형성(branching morphogenesis)이 일어나는 것이 보입니다. 세포 이동에 관여하는 단백질 중 하나는 focal adhesion kinase이며, 이 합성 이미지에서 볼 수 있듯이 분지가 일반적으로 발생하는 웰의 끝부분에서 발현이 증가합니다.이 기술을 숙달하면 적절히 수행했을 때 2시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차 이후에 traction force microscopy, 실시간 RT-PCR 및 Western Blotting과 같은 다른 방법들을 수행하여 세포가 이동할 때 가하는 힘과 관심 유전자의 전사체 및 단백질 수준의 변화를 결정할 수 있습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 정의된 초기 기하학적 구조를 가진 조직이 콜라겐 겔 내에 내장된 3D 세포 배양 모델을 설정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.시청해 주셔서 감사하며, 귀하의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

간단한 방법은 관련 상피 세포에서 조직 섬유아 세포의 효과를 분석하는 설명되어 있습니다. 이 방법과 3 차원 조직 배양의 결합 차원에서 고립 후 세포의 분석을 용이하게하실 수 있습니다. 기술은 종양 세포에서 종양 - 관련 기질의 효과를 체계적으로 연구를 허용, 악성 잠재력을 변화의 세포에 적용됩니다.

세 가지 차원 혼합 셀 회전 타원체 공동 문화에서 Mammary 상피 세포의 분리

복잡한 조직의 고도로 조직화된 구조를 만들려면 여러 재료 및 세포 유형을 통합된 복합체로 조립해야 합니다.  이 조합 설계는 강력한 섬유질 기질 염기를 포함하는 두 가지 별개의 생물학적으로 파생된 물질과 새로운 혈관 형성을 향상시키기 위한 내피 세포와 장기 특이적 층상 세포 시트를 통합합니다.

조직 공학 : 계층화 된 세포 시트의 전달을위한 다세포 3D 비계 건설

조직 공학 섬유 아세포 유래 기본 행렬은 상피 세포의 증식과 분화를 지원하는 기질 기판을 생성하는 새로운 도구입니다. 이곳에서 종양 세포 생물학에 다른 간질 세포 유형의 영향을 평가하기 위하여이 방법을 적용하는 프로토콜이 제시된다.

암 세포의 침략에 응용 프로그램을 사용하여 종양의 기질 미시의 조직 공학

이 문서는 유방암 세포의 침입을 정량화하는 3 차원 (3D) 분석의 사용에 대한 자세한 방법을 제공합니다. 특히, 우리는 세포가 침입 할 때 발생하는 멤브레인 무결성의 손실을 검사하는 등의 분석을 설정하는 데 필요한 절차, 정량화 및 데이터 분석뿐만 아니라 방법에 대해 설명합니다.

3 차원 (3D) 모델을 사용하여 유방암 세포 침윤의 정량화

이 폐 세포 외 기질에서 3 차원 세포 배양 지지체를 제작하는 방법이다. 그대로 폐 세 차원 세포의 성장을 지원할 수있는 하이드로 겔로 처리된다.

3 차원 세포 배양을위한 폐 세포 외 매트릭스에서 조정 히드로 겔

여기, 우리는 기본 유 방 암 세포 뿐만 monocytes 그리고 콜라겐 저하, 면역 세포 모집, 셀 결과 함께 그들의 직접/간접적인 상호 작용 연구로 형태를 분석 하는 3 차원 문화 방법 설명 침공, 그리고 암 관련 된 염증의 승진.

(ECME) 추출 Monocytes 그리고 기본 유 방 암 세포는 세포 외 기질 간의 통신을 분석-기반 3 차원 시스템

우리는 셀과 다중 세포 소기관으로 3D 문화와 실험을 위한 장치를 구성 하는 방법을 설명 합니다. 이 장치는 정의 된 화학 유인 구배가 있는 3D 미세 환경에서 가용성 신호에 대 한 셀룰러 응답을 분석 할 수 있습니다. 유기 체는 약한 시끄러운 입력의 검출에 단일 세포 보다 낫다.

화학 유인 그라데이션에 대 한 다중 세포 반응의 3D 분석

The aim of this method is to obtain fibroblast-derived 3D matrices as a natural scaffold for subsequent cellular assays. 섬유아세포는 전처리된 배양판에 씨를 뿌리고 매트릭스 생성을 위한 아스코르브산으로 자극된다. 행렬은 탈세포화되고 관련 세포(예를 들어, 내피 세포)를 배양하도록 차단된다.

섬유 아세포 유래 3D 매트릭스 시스템은 내피 튜브 형성 분석에 적용

현재 프로토콜은 1차 조직(피부, 폐포, 기도 및 장)의 전층 장기 온칩 배양의 성공적인 확립 및 성숙을 위한 Open-Top Organ-Chip의 기능과 필수 배양 양식을 설명하여 시험관 내에서 인간 상피/중간엽 및 혈관 틈새 인터페이스의 다양한 기능적 측면을 조사할 수 있는 기회를 제공합니다.

Reconspartuting Cytoarchitecture and Function of Human Epithelial Tissues on an Open-Top Organ-Chip (개방형 장기 칩에서 인간 상피 조직의 세포 구조 및 기능 재구성)

여기에서는 나노섬유막 기반 2층 시스템에서 섬유아세포로 배양된 상피 세포가 어떻게 막에 안정적으로 부착하고 성장할 수 있는지 보여줍니다.

나노섬유막(Nanofibrous membranes)을 이용한 상피세포의 3차원 공동배양 모듈 구축

배우세요 조직 공학을 통해 콜라겐 겔에 임베디드된 균일한 3차원 상피 조직을 제작하는 방법을. 이 기술은 기계적 응력이 세포 행동에 미치는 영향을 정밀하게 연구할 수 있게 합니다.

세포 외 매트릭스 내에서 임베디드 공학 3 차원 상피 조직

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