세포 외 매트릭스 내에서 임베디드 공학 3 차원 상피 조직

이 절차의 목표는 분기 형태 형성에 대한 기계적 응력의 영향을 결정하는 것과 같은 많은 실험 상황에서 사용하기 위해 콜라겐 젤에 내장된 동일한 3차원 조직의 융기를 엔지니어링하는 것입니다. 이 방법은 집단 세포 행동의 기본 메커니즘을 결정하는 것과 같은 조직 형태 형성의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 조작된 조직의 기하학이 제어되고 재현 가능하여 물리적 및 생화학적 요인을 정밀하게 조작하고 측정할 수 있다는 것입니다.

따라서 표본 크기가 충분히 커서 높은 통계적 신뢰도로 결론을 내릴 수 있습니다. 표준 포토리소그래피 기술을 사용하여 원하는 어레이로 포토패터닝된 실리콘 마스터를 준비하는 것으로 시작하십시오. 이 비디오에 사용된 패턴은 200미크론 떨어진 직사각형 구조로 구성됩니다.

다음으로, 일회용 접시에 프리폴리머와 경화제를 결합하여 PDMS 50g을 10:1 비율로 혼합합니다. 그런 다음 혼합물을 15-30분 동안 진공 상태에서 두어 혼합 과정에서 유입된 기포를 제거합니다. 실리콘 마스터 질감의 면이 위로 향하게 하여 플라스틱 계량 보트에 놓고 탈기된 PDMS 용액을 금형 위에 붓습니다.

그런 다음 접시를 오븐에 넣고 섭씨 60도에서 12시간 동안 PDMS를 경화시킵니다. 경화되면 플라스틱 용기에서 PDMS와 마스터를 제거합니다. 실리콘 웨이퍼에서 PDMS를 조심스럽게 분리합니다.

그런 다음 깨끗한 면도날을 사용하여 각인된 기능 주변에서 과도한 PDM을 제거합니다. 이제 면도날을 사용하여 패턴화된 PDMS를 개별 직사각형 스탬프로 자릅니다. 이 우표는 앞면이 위로 향하게 하여 깨끗한 100mm 직경의 페트리 접시에 보관하십시오.

다음으로, 동일한 10:1 비율의 프리폴리머와 경화제를 사용하여 탈기된 PDMS 용액의 새로운 배치를 준비합니다. 이 용액 2-3g을 100mm 직경의 페트리 접시에 스핀 코팅한 다음 섭씨 60도에서 12시간 동안 PDMS를 경화시킵니다. 그런 다음 면도날을 사용하여 PDMS의 얇은 층을 스탬프의 지지대로 사용할 직사각형으로 자릅니다.

각 스탬프에는 두 개의 지지대가 필요합니다. 모든 서포트가 절단되면 PDMS 스탬프 및 서포트를 70% 에탄올에 담그고 생물 안전 캐비닛에서 흡입기를 사용하여 건조시켜 멸균합니다. 생물 안전 캐비닛에서 PBS의 50 마이크로 리터의 1 % BSA를 각 스탬프의 상단에 추가합니다.

물방울로 덮인 우표를 섭씨 4도에서 최소 4시간 동안 놓아 BSA가 우표 표면에 흡수되도록 합니다. 그런 다음 스탬프를 생물 안전 캐비닛에 다시 넣고 PDMS 스탬프에서 BSA 용액을 흡인합니다. 다음으로, 50 마이크로 리터의 세포 배양 배지로 스탬프의 표면을 두 번 세척합니다.

각 세척 후에 배지를 흡입하십시오. 각 PDMS 스탬프에 대해 35mm 직경의 조직 배양 접시 하나를 배치합니다. 각 접시에 PDMS 스탬프의 길이보다 약간 작은 거리만큼 떨어진 두 개의 PDMS 지지대를 놓습니다.

그런 다음 핀셋을 사용하여 15mm 직경의 유리 커버 슬립을 집어 70% 에탄올을 사용하여 살균합니다. 핀셋으로 커버 슬립을 잡고 여분의 액체를 흡입한 다음 별도의 페트리 접시에 보관하십시오. 다음으로, 50 마이크로리터의 밀리리터당 4밀리그램 콜라겐 혼합물을 각 스탬프에 직접 분배하여 PDMS 스탬프의 표면을 균일하게 코팅합니다.

핀셋을 사용하여 콜라겐으로 코팅된 PDMS 스탬프를 각각 집어 부드럽게 뒤집습니다. 조직 배양 접시의 PDMS 지지대 위에 거꾸로 된 스탬프 콜라겐 면을 아래로 내립니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 30분 동안 접시를 배양합니다.

다음으로, 나머지 콜라겐 혼합물 50마이크로리터를 각 원형 커버 슬립에 분배하고 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다. 이 시점에서 관심 있는 세포 유형을 수확합니다. 여기 EpH4 마우스 유방 상피 세포가 있는데, 이 세포는 밀리리터당 1-1,000만 개의 세포 농도로 부유

이제 인큐베이터에서 겔화된 콜라겐 샘플을 제거합니다. 핀셋을 사용하여 PDMS 스탬프를 위로 부드럽게 들어 올려 성형된 콜라겐에서 분리하고 버립니다. 콜라겐 젤의 특징이 왜곡되지 않도록 스탬프를 똑바로 위로 들어 올리는 것이 중요합니다.

30마이크로리터의 농축된 세포 현탁액을 원하는 형상의 성형된 공동을 포함하는 각 콜라겐 겔의 표면에 분배합니다. 명시야 현미경으로 세포를 관찰하면서 접시를 좌우로 부드럽게 흔들어 구멍 내에 세포가 정착하는 것을 촉진합니다. 충치는 5분 이내에 채워야 합니다.

구멍 주변에서 과도한 세포를 제거하려면 각 조직 배양 접시를 옆으로 기울이고 콜라겐 겔 표면에 400마이크로리터의 세포 배양 배지를 부드럽게 분배합니다. 접시를 기울이면서 겔 위에 배양 배지를 천천히 분배하여 겔 표면의 여분의 세포가 제거되고 겔 공동의 세포가 변위되지 않도록 부드럽게 세척하는 것이 중요합니다. 액체를 흡입하고 세척을 두 번 더 반복합니다.

여분의 세포가 언제 헹궈졌는지 관찰하기 위해 각 세척 사이에 현미경으로 콜라겐 겔을 확인하십시오. 세포가 채워진 구멍 주변에서 여분의 세포를 제거한 후 조직 배양 접시를 섭씨 37도의 인큐베이터에 15분 동안 놓습니다. 그런 다음 핀셋을 사용하여 콜라겐으로 코팅된 유리 커버 슬립을 부드럽게 뒤집고 셀로 채워진 콜라겐 몰드 위에 올려 커버 슬립의 콜라겐이 셀로 채워진 구멍 위에 캡을 형성하도록 합니다.

샘플을 섭씨 37도에서 15분 동안 배양합니다. 콜라겐 캡이 세포로 채워진 콜라겐 몰드에 부착되면 2-2 1/2 밀리리터의 세포 배양 배지를 겔 위의 유리 덮개 슬립 위에 천천히 분배하고 섭씨 37도에서 1-3 일 동안 샘플을 배양합니다. 이 이미지는 세포 파종 전에 유형 I 콜라겐 겔로 성형된 어레이의 저배율 및 고배율 보기에서 가져온 것입니다.

웰의 모양은 실리콘 마스터의 특징의 모양에 따라 결정됩니다. 여기, 직사각형 우물은 유방 상피 세포로 채워져 있습니다. 이 예에서 각 200 x 50 미크론 직사각형 웰에는 약 80 - 100개의 셀이 포함되어 있습니다.

세포 파종 24시간 후, 세포가 조직을 형성하기 위해 웰 내에서 서로 부착하는 것이 관찰되었습니다. 배양 배지에 성장 인자 HGF를 첨가한 후 24시간 후, 조직은 분지 형태 형성을 겪는 것이 보입니다. 세포 이동과 관련된 단백질 중 하나는 국소 접착 키나아제(focal adhesion kinase)인데, 이 복합 이미지에서 볼 수 있듯이 일반적으로 분지화가 발생하는 웰 말단에서 증가합니다.

이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 2시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차에 따라 견인력 현미경 검사, 실시간 RT-PCR 및 웨스턴 블로팅과 같은 다른 방법을 수행하여 세포가 이동할 때 가하는 힘과 관심 유전자의 전사체 및 단백질 수준의 변화를 결정할 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 정의된 초기 기하학적 구조가 콜라겐 겔 내에 삽입되는 이 3D 세포 배양 모델을 설정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.