Name: Fumarylacetotate 하이드로 아세테이트 도메인 함유 단백질의 발현, 정제, 결정화 및 효소 어세포 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-20T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: 학습하세요 FAHD1 단백질의 발현 및 정제 방법을 E. coli에서 IPTG 유도와 니켈 NTA 친화 크로마토그래피를 이용하여. 효소 활성 분석과 결정화를 통해 TCA 사이클 및 미토콘드리아 대사 조절 메커니즘을 연구할 수 있습니다.

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저자는 애너벨라 피틀의 전문적인 기술 지원과 Haymo Pircher의 파일럿 방법 개발에 매우 감사드립니다.

<ol><li>Brouns, S. J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Insight+into+Substrate+Binding+and+Catalysis+of+a+Novel+2-Keto-3-deoxy-d-arabinonate+Dehydratase+Illustrates+Common+Mechanistic+Features+of+the+FAH+Superfamily%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural Insight into Substrate Binding and Catalysis of a Novel 2-Keto-3-deoxy-d-arabinonate Dehydratase Illustrates Common Mechanistic Features of the FAH Superfamily.</a> Journal of Molecular Biology. 379, 357-371 (2008).</li>
<li>Timm, D. E., Mueller, H. A., Bhanumoorthy, P., Harp, J. M., Bunick, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+and+mechanism+of+a+carbon-carbon+bond+hydrolase%5BTitle%5D)+AND+%22Structure+%28London%2C+England%3A+1993%29%22%5BJournal%5D)">Crystal structure and mechanism of a carbon-carbon bond hydrolase.</a> Structure (London, England: 1993). 7, 1023-1033 (1999).</li>
<li>Weiss, A. K. H., Loeffler, J. R., Liedl, K. R., Gstach, H., Jansen-Dürr, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fumarylacetoacetate+hydrolase+%28FAH%29+superfamily+of+enzymes%3A+multifunctional+enzymes+from+microbes+to+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">The fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) superfamily of enzymes: multifunctional enzymes from microbes to mitochondria.</a> Biochemical Society Transactions. 46, 295(2018).</li>
<li>Guimarães, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+Structures+of+Apo+and+Liganded+4-Oxalocrotonate+Decarboxylase+Uncover+a+Structural+Basis+for+the+Metal-Assisted+Decarboxylation+of+a+Vinylogous+%CE%B2-Keto+Acid%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Crystal Structures of Apo and Liganded 4-Oxalocrotonate Decarboxylase Uncover a Structural Basis for the Metal-Assisted Decarboxylation of a Vinylogous β-Keto Acid.</a> Biochemistry. 55, 2632(2016).</li>
<li>Zhou, N. Y., Fuenmayor, S. L., Williams, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((nag+genes+of+Ralstonia+%28formerly+Pseudomonas%29+sp.+strain+U2+encoding+enzymes+for+gentisate+catabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">nag genes of Ralstonia (formerly Pseudomonas) sp. strain U2 encoding enzymes for gentisate catabolism.</a> Journal of Bacteriology. 183, 700(2001).</li>
<li>Izumi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+Mechanism+of+HpcG%2C+a+Hydratase+in+the+Homoprotocatechuate+Degradation+Pathway+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structure and Mechanism of HpcG, a Hydratase in the Homoprotocatechuate Degradation Pathway of Escherichia coli.</a> Journal of Molecular Biology. 370, 899-911 (2007).</li>
<li>Manjasetty, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+structure+of+fumarylacetoacetate+hydrolase+family+member+Homo+sapiens+FLJ36880%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">X-ray structure of fumarylacetoacetate hydrolase family member Homo sapiens FLJ36880.</a> Biological Chemistry. 385, 935-942 (2004).</li>
<li>Tame, J. R. H., Namba, K., Dodson, E. J., Roper, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+crystal+structure+of+HpcE%2C+a+bifunctional+decarboxylase%2Fisomerase+with+a+multifunctional+fold%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The crystal structure of HpcE, a bifunctional decarboxylase/isomerase with a multifunctional fold.</a> Biochemistry. 41, 2982-2989 (2002).</li>
<li>Ran, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structures+of+Cg1458+reveal+a+catalytic+lid+domain+and+a+common+catalytic+mechanism+for+the+FAH+family%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Crystal structures of Cg1458 reveal a catalytic lid domain and a common catalytic mechanism for the FAH family.</a> The Biochemical Journal. 449, 51-60 (2013).</li>
<li>Ran, T., Wang, Y., Xu, D., Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression%2C+purification%2C+crystallization+and+preliminary+crystallographic+analysis+of+Cg1458%3A+A+novel+oxaloacetate+decarboxylase+from+Corynebacterium+glutamicum%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+F%3A+Structural+Biology+and+Crystallization+Communications%22%5BJournal%5D)">Expression, purification, crystallization and preliminary crystallographic analysis of Cg1458: A novel oxaloacetate decarboxylase from Corynebacterium glutamicum.</a> Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 67, 968-970 (2011).</li>
<li>Pircher, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+human+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+Domain-containing+Protein+1+%28FAHD1%29+as+a+novel+mitochondrial+acylpyruvase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of human Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-containing Protein 1 (FAHD1) as a novel mitochondrial acylpyruvase.</a> Journal of Biological Chemistry. 286, 36500-36508 (2011).</li>
<li>Pircher, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+FAH+domain-containing+protein+1+%28FAHD1%29+as+oxaloacetate+decarboxylase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of FAH domain-containing protein 1 (FAHD1) as oxaloacetate decarboxylase.</a> Journal of Biological Chemistry. 290, 6755-6762 (2015).</li>
<li>Petit, M., Koziel, R., Etemad, S., Pircher, H., Jansen-Dürr, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+oxaloacetate+decarboxylase+FAHD1+inhibits+mitochondrial+electron+transport+and+induces+cellular+senescence+in+human+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Gerontology%22%5BJournal%5D)">Depletion of oxaloacetate decarboxylase FAHD1 inhibits mitochondrial electron transport and induces cellular senescence in human endothelial cells.</a> Experimental Gerontology. 92, 7-12 (2017).</li>
<li>Etemad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxaloacetate+decarboxylase+FAHD1+%E2%80%93+a+new+regulator+of+mitochondrial+function+and+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Ageing+and+Development%22%5BJournal%5D)">Oxaloacetate decarboxylase FAHD1 – a new regulator of mitochondrial function and senescence.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 177, 22-29 (2019).</li>
<li>Weiss, A. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+the+bi-functionality+of+human+oxaloacetate+decarboxylase+FAHD1%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Structural basis for the bi-functionality of human oxaloacetate decarboxylase FAHD1.</a> Biochemical Journal. 475, 3561-3576 (2018).</li>
<li>Taferner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FAH+domain-containing+protein+1+%28FAHD-1%29+Is+required+for+mitochondrial+function+and+locomotion+activity+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">FAH domain-containing protein 1 (FAHD-1) Is required for mitochondrial function and locomotion activity in C. elegans.</a> PLoS ONE. 10, 1-15 (2015).</li>
<li>Mizutani, H., Kunishima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification%2C+crystallization+and+preliminary+X-ray+analysis+of+the+fumarylacetoacetase+family+member+TTHA0809+from+Thermus+thermophilus+HB8%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+F+Structural+Biology+and+Crystallization+Communications%22%5BJournal%5D)">Purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of the fumarylacetoacetase family member TTHA0809 from Thermus thermophilus HB8.</a> Acta Crystallographica Section F Structural Biology and Crystallization Communications. 63, 792-794 (2007).</li>
<li>Bateman, R. L., Bhanumoorthy, P., Witte, J. F., McClard, R. W., Grompe, M., Timm, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+Inferences+from+the+Crystal+Structure+of+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+with+a+Bound+Phosphorus-based+Inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mechanistic Inferences from the Crystal Structure of Fumarylacetoacetate Hydrolase with a Bound Phosphorus-based Inhibitor.</a> Journal of Biological Chemistry. 276, 15284-15291 (2001).</li>
<li>Zeng, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+strategy+for+introducing+large+and+multiple+changes+in+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Efficient strategy for introducing large and multiple changes in plasmid DNA.</a> Scientific Reports. 8, 1714(2018).</li>
<li>Higuchi, R., Krummel, B., Saiki, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+method+of+in+vitro+preparation+and+specific+mutagenesis+of+DNA+fragments%3A+study+of+protein+and+DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A general method of in vitro preparation and specific mutagenesis of DNA fragments: study of protein and DNA interactions.</a> Nucleic Acids Research. 16, 7351-7367 (1988).</li>
<li>Jansen-Duerr, P., Pircher, H., Weiss, A. K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+FAH+Fold+Meets+the+Krebs+Cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Enzymology+and+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">The FAH Fold Meets the Krebs Cycle.</a> Molecular Enzymology and Drug Targets. 2, 1-5 (2016).</li>
<li>Rupp, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+use+of+crystallization+phase+diagrams%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+F+Structural+Biology+Communications%22%5BJournal%5D)">Origin and use of crystallization phase diagrams.</a> Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 71, 247-260 (2015).</li>
<li>Rupp, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRupp%2C+B+%22Biomolecular+Crystallography%3A+Principles%2C+Practice%2C+and+Application+to+Structural+Biology%22">Biomolecular Crystallography: Principles, Practice, and Application to Structural Biology</a>. , Garland Science. (2010).</li>
<li>Flint, D. H., Nudelman, A., Calabrese, J. C., Gottlieb, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enol+oxalacetic+acid+exists+in+the+Z+form+in+the+crystalline+state+and+in+solution%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Organic+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Enol oxalacetic acid exists in the Z form in the crystalline state and in solution.</a> The Journal of Organic Chemistry. 57, 7270-7274 (1992).</li>
<li>Pogson, C. I. I., Wolfe, R. G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxaloacetic+acid+tautomeric+and+hydrated+forms+in+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Oxaloacetic acid tautomeric and hydrated forms in solution.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 46, 1048-1054 (1972).</li>
<li>Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L., Kost, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baculovirus+as+versatile+vectors+for+protein+expression+in+insect+and+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells.</a> Nature Biotechnology. 23, 567-575 (2005).</li>
<li>Steinberger, R., Westheimer, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metal+Ion-catalyzed+Decarboxylation%3A+A+Model+for+an+Enzyme+System+1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Metal Ion-catalyzed Decarboxylation: A Model for an Enzyme System 1.</a> Journal of the American Chemical Society. 73, 429-435 (1951).</li>
<li>Tate, S. S., Grzybowski, A. K., Datta, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stability+constants+of+the+magnesium+complexes+of+the+keto+and+enol+isomers+of+oxaloacetic+acid+at+25%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">The stability constants of the magnesium complexes of the keto and enol isomers of oxaloacetic acid at 25.</a> Journal of Chemical Society. , 1381-1389 (1964).</li>
<li>Tate, S. S., Grzybowski, A. K., Datta, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+acid+dissociations+of+the+keto+and+enol+isomers+of+oxaloacetic+acid+at+25%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">The acid dissociations of the keto and enol isomers of oxaloacetic acid at 25.</a> Journal of Chemical Society. 1372, 1380 (1964).</li>
<li>Brecker, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+2%2C4-diketoacids+and+their+aqueous+solution+structures%5BTitle%5D)+AND+%22New+Journal+of+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Synthesis of 2,4-diketoacids and their aqueous solution structures.</a> New Journal of Chemistry. 23, 437-446 (1999).</li>
</ol>

저자는 경쟁적인 금전적 이익을 공개하고 선언할 것이 없습니다. H. G. MoleculeCrafting.Hugs e.U.에서 CEOCSO이며 사용자 정의 합성을 통해이 연구를위한 아실피루브를 제공했습니다. P.J.D.의 연구실에서 일하는 것은 오스트리아 과학 기금(FWF): 프로젝트 번호 P 31582-B26에 의해 지원되었습니다. 이 원고에 대한 출판 비용은 프로젝트 번호 P 31582-B26에 따라 오스트리아 과학 기금 (FWF)에 의해 부분적으로 충당되었습니다. A. N. 및 B. R.은 프로젝트 P28395-B26에 따라 오스트리아 과학 기금(FWF)의 지원을 받습니다.

fumarylacetotatetate하이드라아제 (FAH)1,2 효소의 수퍼 패밀리는 고도로 보존된 촉매 FAH 도메인3,4,5,6을 공유하는 효소의 그룹을 기술합니다. , 7명 , 8개 , 9개 , 10. 일반적인 촉매 센터에도 불구하고, 이 효소는 다기능이며, 대부분은 원핵생물에서 발견되며, 여기서 그들은 복잡한 탄소 원에서 회수된 화합물을 분해하는 데 사용된다3. 이 가족의 단지 3명의 일원은 지금까지 진핵생물에서 확인되었습니다: FAH2를주는 이름, 뿐 아니라 FAH 도메인 포함 단백질 1 (FAHD1)11,12,13,14 ,15 및 FAH 도메인 함유 단백질 2 (FAHD2). FAHD1의 고갈은 손상된 미토콘드리아 호흡과 연관되었습니다13,16 및 중간 잠재력에 연결되는 세포 노화 표현형14의 가역적인 모형과 연관되었습니다 전자 수송 시스템의 단점. 인간 FAHD1 및 모델 시스템 (마우스, 선충, 암 세포주, 식물 등)에서의 정형 고리 뿐만 아니라 선택된 점 돌연변이 변이체는 잠재적인 관심의 약성 표적이 되었습니다. 이 연구를 위해, 순도의 높은 수준에서 재조합 단백질, 결정 구조 및 선택적 항체에 의해 유도 촉매 메커니즘에 대한 정보뿐만 아니라 중요합니다.
이 원고는 대장균,친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 황산 암모늄 침전, 준비 및 분석 젤 여과, 결정화, X선 회절, 및 포토메트릭 분석. 여기에 설명된 방법 및 프로토콜의 목적은 세균학, 식물 생물학, 동물 및 인간 연구와 같은 다양한 분야에서 일하는 과학자들에게 FAH 수퍼패밀리의 구성원을 특성화하는 지침을 제공하는 것입니다. 특성이 없는 수퍼패밀리 구성원이 특정 분야에서 관련성이 있어야 합니다. 여기에 설명된 프로토콜은 다른 원핵생물 또는 진핵 FAH 수퍼패밀리 구성원을 특성화하는 것을 목표로 하는 프로젝트에 대한 귀중한 지원을 제공할 수 있습니다.
여기에 설명된 방법의 뒤에 근거는 잘못 기술된 단백질의 특성화 (특히, 알려지지 않은 생리적 관련성의 신진 대사 효소)를 위해, 정제된 재조합 단백질로 시작하는 접근이 허용한다는 사실입니다 체외 활성 효소 제제, 고품질 항체 및 선택된 효소에 대한 강력하고 특정 한 약리학 적 억제제와 같은 귀중한 고품질 연구 도구개발. 기재된 방법은 빠른 단백질 액체 크로마토그래피(FPLC) 및 X선 결정학을 필요로 합니다. 대체 방법(예를 들어, 화학적 유도 없이 단백질을 발현하거나, 열처리 후 원심분리에 의한 단백질 정제를 표시하기 위해 탈염 및 크기 배제 크로마토그래피를 표시하기 위해),다른곳에서 17에서 발견될 수 있다. FAH 슈퍼 패밀리 효소 2, 7,9,17,18의발현 및 정제를 위해 광범위한 방법을 사용할 수 있지만, 이 작업은 발현에 초점을 맞추고 특히 FAHD 단백질의 정제.
본 원고의 토론 섹션에서, FAHD1 단백질(하이드로라제, 데카르복실라제)에 대해 확인된 촉매 메커니즘(15)은 촉매 반응의 화학적 특성을 입증하기 위해 보다 상세하게 설명한다. 전작7,15,18(PDB: 6FOG, PDB:6FOH)을 기반으로 얻은 데이터는 케토-에놀 이소머라아제로서 효소의 제3 활성을 암시한다.

<table><tbody><tr><td>BL21(DE3) pLysS 유능한 E. coli</td><td>Promega</td><td>L1195</td><td>T7 프로모터 및 리보솜 결합 부위</td></tr><tr><td>pET E. coli T7 발현 벡터를</td> 가진 유전자에서 고효율 단백질 발현 <td>MERCK-http://www.merckmillipore.com/AT/de/life-science-research/genomic-analysis/dna-preparation-cloning/pet-expression-vectors/qFSb.qB.mLQAAAFA6.VkiQ0G,nav</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>0.45 &micro; m 필터 장치</td><td>MERCK</td><td>SLHP033NS</td><td>Millex-HP, 0.45 &micro; m, PES 33mm, 멸균되지 않음</td></tr><tr><td>0.22 &micro; m 필터 유닛</td><td>MERCK</td><td>SLGP033RS</td><td>Millex-HP, 0.22 &micro; m, PES 33 mm, 멸균되지 않음</td></tr><tr><td>Eppendof 튜브 1.5 mL</td><td>VWR</td><td>525-1042</td><td>미세 원심 튜브; 오토클레이브</td></tr><tr><td>15 mL Falcon</td><td>VWR</td><td>734-0451</td><td>원심 튜브</td></tr><tr><td>50 mL Falcon</td><td>VWR</td><td>734-0448</td><td>원심 튜브</td></tr><tr><td>PS 큐벳 분광 광도계 Semi-Micro</td><td>VWR</td><td>30622-758</td><td>VIS 투명 큐벳</td></tr><tr><td>UV 큐벳 분광 광도계 Semi-Micro</td><td>VWR</td><td>47727-024</td><td>UV/VIS 투명 큐벳</td></tr><tr><td>이소프로필-&베타;-D-티오갈락토피라노시드(IPTG)</td><td>ROTH</td><td>2316</td><td>DE3/pET 시스템으로 단백질 발현 유도에 사용되는 화학 물질</td></tr><tr><td>이미다졸</td><td>ROTH</td><td>X998</td><td>니켈 하전 친화성 수지에서 폴리히스티딘(6xHis) 서열 용출에 사용되는 화학 물질</td></tr><tr><td>Glass Econo-Column Columns</td><td>Bio-Rad</td><td>-</td><td>http://www.bio-rad.com/de-at/product/glass-econo-column-columns?ID=2cfb1c6e-32e8-4c72-b532-dd39013d707d&pcp_loc=catprod</td></tr><tr>세균 성장 선택을 위한<td>chloramphenicol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378</td><td>항생제; 저항성 endi&oacute; BL21 (DE3) E. coli의 pLysS 플라스미드에 ded; 25 &마이크로; 세균 성장 선택을 위한 g/mL 최종 농도</td></tr><tr><td>카나마이신</td><td>시그마-알드리치</td><td>60615</td><td>항생제; 이 내성이 채택된 pET 벡터에 인코딩된 경우 사용; 50 &마이크로; 세균 성장 선택을 위한 g/mL 최종 농도</td></tr><tr><td>암피실린</td><td>시그마-알드리치</td><td>A1593</td><td>항생제; 이 내성이 채택된 pET 벡터에 인코딩된 경우 사용; 100&마이크로; g/mL 최종 농도</td></tr><tr><td>Ultra-15, MWCO 10 kDa</td> 단백질 농축을 위한 <td>Sigma-Aldrich</td><td>Z706345</td><td>원심 필터;https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/z706345?lang=de&reg;ion=AT</td></tr><tr><td>Ultra-0.5 원심 필터 장치</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z677108</td><td>단백질 농축을 위한 원심 필터; https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/ALDRICH/Z677108?lang=de&region=AT&cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xviews-_-prodRecCold5-2</td></tr><tr><td>옥살로아세트산</td><td>시그마-알드리치</td><td>O4126</td><td>TCA 대사산물</td></tr><tr><td>옥슬라산나트륨</td><td>시그마-알드리치</td><td>71800</td>, <td>FAH 슈퍼패밀리 효소의 경쟁 억제제</td></tr><tr><td>투석 튜빙 셀룰로오스 멤브레인</td><td>시그마-알드리치</td><td>D9277</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d9277; 또는 유사한</td></tr><tr><td>Ni-NTA 아가로스</td>, <td>Thermo-Fischer</td>, <td>R90101</td><td>, 폴리히스티딘(6xHis) 염기서열을 포함하는 재조합 단백질을 정제하는 데 사용할 수 있는 니켈 하전 친화성 수지</td></tr>, <tr><td>96-Well UV Microplate</td><td>, Thermo-Fischer</td><td>8404</td>, <td>UV/Vis, 투명 평면 바닥, 96 well plate</td></tr><tr><td>, PageRuler, Prestained Protein Ladder, 10 - 180 kDa,</td><td>Thermo-Fischer</td><td>26616</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/26616?SID=srch-hj-26616</td></tr><tr><td>&Auml; KTA FPLC 시스템</td><td>GE 헬스케어 생명 과학</td><td>-</td><td>GE 헬스케어의 FPLC 시스템을 사용; 다른 사용자 정의 버전이 존재합니다; 이 작업은 "&Auml; KTA pure" 시스템</td></tr><tr><td>HiTrap Phenyl HP 컬럼</td><td>GE Healthcare Life Sciences-https://www.gelifesciences.com/en/it/shop/chromatography/prepacked-columns/hydrophobic-interaction/hitrap-phenyl-hp-p-05630</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Mono S 10/100 GL</td><td>GE Healthcare Life</td> <td>Sciences-</td><td>https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/ion-exchange/mono-s-cation-exchange-chromatography-column-p-00723</td></tr><tr><td>Mono Q 10/100 GL</td><td>GE Healthcare Life Sciences-https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/ion-exchange/mono-q-anion-exchange-chromatography-column-p-00608</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>HiLoad Superdex 컬럼 75pg (G75)</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>-</td><td>https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/size-exclusion/hiload-superdex-75-pg-preparative-size-exclusion-chromatography-columns-p-05800</td></tr><tr><td>HiLoad Superdex 칼럼 200pg (G200)</td><td>GE 헬스케어 생명과학</td><td>-</td><td>https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/size-exclusion/hiload-superdex-200-pg-preparative-size-exclusion-chromatography-columns-p-06283</td></tr><tr><td>TECAN 마이크로플레이트 리더</td><td>TECAN Life Sciences-https://lifesciences.tecan.com/microplate-readers</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>아세틸피루베이</td><td>트 MoleculeCrafting.HuGs e.U.</td><td>-</td><td>맞춤형 합성</td></tr><tr><td>benzoylpyruvate</td><td>MoleculeCrafting.HuGs e.U.</td><td>-</td><td>맞춤형 합성</td></tr><tr><td>VDX&trade; 플레이트(24웰</td>)<td>Hampton</td><td>HR3-142</td><td>Hanging Drop Vapor Diffusion 파라핀 오일을 통한 결정화에 사용되는 24웰 플레이트</td></tr>Hanging Drop Vapor Diffusion <tr><td>커버슬립(22mm)</td>을 통한 결정화에 사용되는 <td>Karl Hecht KG</td><td>14043</td><td>커버슬립 Hanging Drop Vapor Diffusion</td>을 통한 결정화에 사용되는 Karl Hecht KG 14043 커버슬립</tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>루리아 국물(LB) 배지</td><td>자가 준비</td><td></td>-<td>대장균에 대한 일반 성장 배지: 5 g/L 효모 추출물; 카제인에서 10 g/L 펩톤; 10 g/L 염화나트륨; 12 g/L 한천</td></tr><tr><td>NZCYM 매체</td><td>자체 준비</td><td>-</td><td>증폭에 사용되는 대장균에 대한 더 나은 성장 배지: 10 g/L NZ 아민; 5 g/L NaCl; 5 g/L 효모 추출물; 1 g/L 카사미노산; 2 g/L MgSO4; pH를 7.4로 조정</td></tr>루<tr><td>리아 국물(LB) </td><td></td><td>세균 그로스 선택을 위한 LB-매체 및 항생제를 포함하는 아가로스 플레이트 자체 준비-오토클레이브 아가로스 플레이트; https://www.addgene.org/protocols/pouring-lb-agar-plates/</td><td></td></tr> <tr><td>Ni-NTA 실행 완충액</td><td>자체 준비</td><td>-</td><td>20 mM Tris-HCl pH 7,4; 50-300 mM NaCl; 10-200 mM 이미다졸; 범위: 최적 값은 FAHD 단백질에 따라 다름</td></tr><tr><td>Ni-NTA 용출 버퍼</td><td>자체 준비</td><td>-</td><td>20 mM 트리스 -HCl pH 7,4; 50-300mM 염화나트륨; 200-500 mM 이미다졸; 범위: 최적의 값은 FAHD 단백질에 따라 다릅니다.</td></tr><tr><td>HIC 실행 버퍼</td><td>자체 준비</td><td>-</td><td>44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 100 mM NaCl; 20 mM DTT; pH 7</td></tr><tr><td>HIC 실행 버퍼 AS</td><td>자체 준비</td><td>-</td><td>황산 암모늄(AS)으로 포화된 HIC 실행 버퍼로 조정; pH 7로 조정: 70 g 황산 암모늄 + 90 mL 버퍼, 차가운 방에서 밤새 교반; pH 7.0</td></tr><tr><td>Mono S 저염 버퍼</td><td>자체 준비로 조정</td><td>-</td><td>44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 10-300 mM NaCl; 범위: 최적 값은 FAHD 단백질에 따라 다릅니다.</td></tr><tr><td>Mono S 고염 완충액</td><td>자체 준비-</td><td></td><td>44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 1-2 M NaCl; 범위: 최적 값은 FAHD 단백질에 따라 다릅니다.</td></tr><tr><td>Mono Q 저염 완충액</td><td>자체 준비</td><td>-</td><td>20 mM Tris-HCl; 15 mM NaCl; pH 8.0으로 조정</td></tr><tr><td>Mono Q 고염 완충액</td><td>자체 준비</td><td>-</td><td>20mM 트리스-HCl; 1 M NaCl; 10 % 글리세롤; pH 8.0</td></tr><tr><td>G75 / G200 실행 버퍼</td><td>자체 준비</td> <td>-</td><td>15 mM Tris-HCl; 300 mM NaCl로 조정; pH 7.4</td></tr><tr><td>효소 분석 버퍼</td><td>자체 준비</td> <td>-</td><td>50 mM Tris-HCl pH7.4로 조정; 100 mM KCl; 1 mM MgCl 2</td></tr><tr><td>protein 결정화 버퍼</td><td>자체 준비</td><td></td> <td>G75 / G200 결정</td>화 1 mM DTT</tr><tr><td>저장소 솔루션</td>과 함께 실행 버퍼 <td>자체 준비</td> <td>-</td> <td>100 mM Na-Hepes pH 7.5; 5-20 % (w/v) PEG4k; 10 mM-200 mM MgCl2</td></tr></tbody></table>

fumarylacetotate 하이드로 아세테이트 도메인 함유 단백질의 발현, 정제, 결정화 및 효소 어세포

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Fumarylacetotate 하이드라제 (FAH) 도메인 함유 단백질 (FAHD)는 진핵생물에 있는 FAH 수퍼패밀리의 확인된 일원입니다. 이 수퍼 패밀리의 효소는 일반적으로 주로 하이드로라제및 데카르복실라아제 메커니즘을 포함하는 다기능성을 나타낸다. 본 문서에서는 FAHD 단백질의 발현 및 정제를 위한 일련의 연속적인 방법을 제시하며, 주로 FAHD 단백질 1(FAHD1) 종(인간, 마우스, 선충류, 식물 등)을 소개한다. 커버된 방법은 대장균,친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 예비 및 분석 젤 여과, 결정화, X선 회절 및 광측정 분석에서의 단백질 발현입니다. 높은 수준의 순도의 농축 단백질 (>98%) 결정화 또는 항체 생산에 사용될 수 있다. 유사하거나 낮은 품질의 단백질은 효소 검정에 사용되거나 검출 시스템에서 항원으로 사용될 수 있다(Western-Blot, ELISA). 이 작품에 대한 토론에서 FAHD1의 식별된 효소 메커니즘은 하이드라제 및 데카르박실라아제 이중 기능을 보다 자세하게 설명하기 위해 설명되어 있습니다.

준비된 클로닝 벡터로 시작하여 BL21(DE3) pLysS 대장균을구입하였고, 플라스미드는 열 충격 또는 임의의 적절한 대체 방법을 통해 박테리아 내로 삽입된다(도 1). 증폭의 짧은 기간 후, 형질전환 된 박테리아는 LB 한천 플레이트에 도금되어 하룻밤 사이에 성장합니다. 이 시점에서 플레이트는 다양한 잠재적 오류 소스에 따라 다르게 보일 수 있습니다. 플레이트는 비어 있을 수 있습니다 (즉, 콜로니 없음), 완전히 박테리아에 의해 자란, 또는 사이 뭔가, 각각. 최적의 및 비최적 변환 후 LB 한천 플레이트의 두 가지 예는 그림 7A에도시되어 있습니다. 너무 많은 세균성 식민지는 너무 많은 박테리아가 도금되었다는 것을 나타냅니다 (가능성) 또는 사용 항생제가 만료 될 수 있음을 (가능성). 너무 적은 세균성 식민지는 충분하지 않은 플라스미드가 변형을 위해 사용되었거나 (다음 번에 더 많이 사용) 또는 너무 많은 항생제가 박테리아를 선택하는 데 사용되었다는 것을 나타낼 수 있습니다. 어쨌든, 식민지가 존재하는 경우에, 2개의 선택적인 항생제를 사용하는 것은 성장하는 변형되지 않은 박테리아의 다소 미미한 기회를 의미하기 때문에, 그(것)들은 잘되어야 합니다. 그러나 콜로니는 박테리아가 변형 능력을 상실했음을 나타냅니다 (장기간 잘못된 저장 또는 저장, 반복적 동결 및 해동 등으로 인해), 열 충격이 성공하지 못했습니다 (플라스미드 섭취 또는 세균 없음) 너무 많은 열에 의해 사망), 복제 벡터가 손상되거나 실수로 잘못된 세트의 선택적 항생제가 사용되었습니다(플라스미드 벡터에서 내성 유전자 확인).
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59729/59729fig07v2.jpg"> 그림 7 : 박테리아 변형 및 IMAC에 대한 대표적인 결과. (a) 변형된 BL21(DE3) 대장균을가진 대표적인 LB 한천 플레이트, 다음 프로토콜 단계 1.1에 의해 얻어진다. 왼쪽: 잘 분포된 콜로니가 있는 접시(긍정적인 예). 오른쪽: 단일 콜로니가 하나뿐인 플레이트(음수 예). 흰색 원은 좋은 식민지를 표시합니다. 빨간색 원은 서로 너무 가깝게 자라는 식민지를 표시하며 격리된 콜로니를 사용할 수 있는 한 선택해서는 안 됩니다. (B) 일련의 유도 제어의 12.5% 아크릴아미드 SDS-PAGE 분석("-"는 IPTG 유도 전에 나타낸다; "+"는 IPTG 유도 후, 펠릿 수확 전에, 총 단백질의 동일한 양으로 조정된 것을 나타낸다. 이는 1.2단계에서 설명한다. (c) 그의-태그된 FAHD1 단백질의 Ni-NTA 정제의 예시적인 12.5% 아크릴아미드 SDS-PAGE 분석. 이것은 프로토콜의 섹션 3에 설명되어 있습니다. 친화성 크로마토그래피는 고순도 (&gt;70 %, 검은 색 화살표)의 단백질을 산출하지만, 몇 가지 작은 오염도 관찰됩니다 (빨간색 화살표). 이 오염은 열에 묶는 비 FAHD 단백질, 및 FAHD 단백질에 묶는 단백질에서 이루어져 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59729/59729fig07v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
검증된 콜로니가 선택되고 선택됩니다. 영양 배지에서 증폭 후, 단백질 발현은 화학 IPTG의 적용에 의해 유발된다. 밀리그램 수량으로 발현된 단백질을 함유하는 세균 펠릿은 수확되고, 발현은 SDS-PAGE를 통해 검증된다(예를 들어 도 7B참조). 이 간단한 프로세스 중에 일부 문제가 발생할 수 있습니다. 첫째, 일부 단백질은 분명히 어떻게 든 숙주 박테리아의 자연 대사를 방해하기 때문에 포함 시체를 형성합니다. 이것은 인간 FAHD1 및 FAHD2의 일부 포인트 돌연변이에 대해 관찰되었다. 이러한 경우에, 곤충 세포 와 같은 다른 발현 시스템은 더 적합 할 수 있으며 고려되어야한다. 곤충 세포로부터 펠릿을 수확한 후, 예를 들어, 단백질의 정제는 본 프로토콜에 기재된 것과 동일한 단계를 따른다. 둘째, DE3-pET 시스템은 때때로 "새는" 것으로 밝혀져 있다(즉, 단백질은 이미 IPTG 유도 전에 어느 정도 발현된다). 이것에 대한 잠재적인 이유는 잘 이해되지 않습니다, 그러나 차가운 방 인큐베이터에서 천천히 밤새 단백질을 표현하는 것을 도울 수 있습니다. 셋째, 단백질이 발현되지 않는다. 이것은 아마도 최악의 시나리오, 그것은 가능성이 손상 된 플라스미드 벡터를 나타내기 때문에 따라서 플라스미드를 순서를 정하는 것이 좋습니다.
그의-태그가 단백질을 태그하는 데 사용된 경우, Ni-NTA 아가로즈를 이용한 친화도 크로마토그래피는 대부분의 오염을 제거하는 쉽고 저렴한 포획 방법이다(도 7C). 다른 태그 시스템(예: STREP-II)에도유사한 방법이 존재합니다. 태그가 사용되지 않은 경우, 황산 암모늄 침전및 연속적인 소수성 교환 크로마토그래피의 조합은 또한 대부분의다른 단백질로부터 단백질을 분리할 수 있다(도 8A). 그러나, 두 가지 방법(도7C 대 도 8A)을비교하면, Ni-NTA 방법의 우수성은 SDS-PAGE 분석에 의해 입증될 수 있다. 따라서 그의태그가 붙은 단백질을 사용하는 것이 좋습니다.
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59729/59729fig08v2.jpg"> 그림 8 : FPLC 실험(HIC, 이온 거래소, SEC)의 대표적인 결과. (a) 프로토콜의 섹션 4에 기재된 바와 같이, 전형적인 크로마토그램 및 12.5% 아크릴아미드 SDS-PAGE 분석 후 암모늄 황산염(AS) 침전 후 의학적 FAHD1 단백질의 침전. 녹색 선은 AS를 포함하지 않는 버퍼 B의 그라데이션을 반영합니다. 이 과정에서 AS는 점차 시스템에서 씻어 내다낸다. 이 패널을 도 7C와 비교하면 HIC-페닐 방법에 비해 Ni-NTA 친화성 크로마토그래피의 위력이 표시되며, 단백질 정제를 위한 His-tag 시스템을 사용하는 장점이 있다. (b) Ni-NTA 정제 후 그의-태그된 FAHD의 예시적인 크로마토그램 및 12.5% 아크릴아미드 SDS-PAGE 양이온 교환 크로마토그래피 분석. 소금 구배를 사용하여, 적용된 견본은 개별적인 단백질로 분리됩니다. (c) 예시적인 크로마토그램 및 12.5% 아크릴아미드 SDS-PAGE 분석의 G75 크기 배제 크로마토그래피 그의-태그가 붙은 FAHD 다음 의 양이온 교환 크로마토그래피. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59729/59729fig08v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
연속적으로, 단백질은 양이온/음이온 교환 크로마토그래피에 의해 남은 오염으로부터 더 분리된다(예를 들어, 도 8B참조), 크기 배제 크로마토그래피(예를 들어, 도 8C참조). 이 순서대로 초기 정제 전략을 설정하는 것이 좋습니다; 그러나, 이 컬럼은 단백질이 충분히 순수할 때까지, 이후에 그리고 변이에서 조합해서 이용되어야 합니다.
간단한 활성 반응 실험은 활성 기질 및/또는 보조 인자에 대한 "예 또는 아니오" 결정을 테스트하기 위해, Ni-NTA 정제 후 그의-tagged 단백질, 또는 이온 교환 컬럼 후 태그가 지정되지 않은 단백질로 수행될 수 있다. 특정 활동 및 운동 상수는 가장 높은 순도의 단백질로 결정되어야 합니다. 결정화는 이온 교환 컬럼 후에 단백질로 시도될 수 있습니다, 그러나 결정의 질은 거의 항상 단백질 순도와 상관관계가 있습니다. 폴리클로날 항체는 정제 프로토콜의 임의의 단계에서 단백질에 대하여 제기될 수 있다; 그러나, 여기에서 질은 또한 단백질 순도와 상관관계가 있습니다.

fumarylacetotatetate하이드라세아세테이트 도메인 함유 단백질의 발현 및 정제는 예시(대장균, FPLC에서발현)로 기재된다. 정제된 단백질은 결정화 및 항체 생산에 사용되며 효소 공아에 사용됩니다. 선택된 광측정 분석제는 옥살로아세테이트 데카르박실라제 및 아실피루베테 하이드로라제로서 FAHD1의 다기능성을 표시하기 위해 제시된다.

Fumarylacetotate 하이드로 아세테이트 도메인 함유 단백질의 발현, 정제, 결정화 및 효소 어세포

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

당사의 프로토콜은 단백질뿐만 아니라 일반적으로 단백질을 함유한 FAH 도메인의 효율적인 발현 및 정제 방법을 설명합니다. FHD 단백질-1은 미토콘드리아의 TCA 주기 및 에너지 대사에 있는 규제 역할을 합니다. 우리는 세포 노화에 FHD-1 다운 조절을 연결할 수 있었고 효소 활성 및 단백질 구조에 대한 정보는 일반적으로 관찰 된 표현형 뒤에 분자 메커니즘을 이해하기 위해 요구된다.IPTG 유도 벡터 시스템을 통해 단백질을 표현하는 주요 장점은 모든 방법이 모든 실험실에서 비교적 저렴하고 쉽게 설정할 수 있다는 것입니다. 니켈 NTA 아가로즈 수지와 함께 폴리 히스티딘 형 단백질을 사용함으로써, 친화도 크로마토그래피의 엄청난 선택성은 저렴한 비용으로 사용될 수 있다. 대부분의 목적을 위해, 이 질에서 얻은 단백질은 이미 충분할 지도 모릅니다.다른 손에 FPLC는 다른 방법에 비해 몇 가지 장점을 가진 잘 확립되고 일반적인 방법입니다. 먼저, 얼음에 유능한 BL21-DE3 플라이스 E.coli 박테리아의 100 마이크로리터에 5-10 나노그램의 플라스미드를 삽입합니다. 내용을 혼합하기 위해 튜브를 약간 누릅니다.박테리아를 얼음에 30분 간 유지하여 몇 분마다 튜브를 부드럽게 두드십시오. 온도 가루를 섭씨 42도로 가열합니다. 박테리아가 함유된 튜브를 장치에 넣고 90초 동안 가열합니다.그런 다음 튜브를 얼음 위에 즉시 놓습니다. 얼음에 5-10 분 후, NZCYM 배지의 600 마이크로 리터를 추가하고 박테리아 인큐베이터에 튜브를 배치합니다. 1 시간 동안 섭씨 37도에서 흔들리는 방향을 따라 중간 속도로 튜브를 흔들어.배양 후, 선택 항생제를 포함하는 10센티미터 LB 한천 판에 세균 배양의 플레이트 200 마이크로리터. 하룻밤 사이에 37°C에서 박테리아 인큐베이터에서 LB 한천 플레이트의 박테리아를 배양합니다. 성공적인 식민지 형성 후, 하나의 단일 식민지를 선택하고 선택 된 항생제와 NZCYM의 다섯 밀리리터에 분산.하룻밤 사이에 섭씨 37도에서 박테리아 인큐베이터의 배양. 성공적인 세균 성장 후, 단백질 수량의 수요에 따라 250 밀리리터, 500 밀리리터 또는 1 리터 의 매체 배치에서 박테리아를 증폭시하십시오. 그런 다음 박테리아를 문화하여 박테리아 인큐베이터에서 2~3시간 동안 섭씨 37도에서 배양합니다.인큐베이션을 따라 포토메트릭 분석을 위해 샘플을 그립니다. 600 나노미터의 광학 밀도가 0.4에 도달하면 200 마이크로몰라를 이소프로필 베타-D-티오갈라크토피라노시드의 최대 1밀리머까지 적용한다. 37섭씨 단백질 발현에서 박테리아 인큐베이터에서 3~5시간 이상 후 단백질 발현이 소진된다.원심분리를 통해 세균펠릿을 5, 000회 G에서 5분간 수확하십시오. 그런 다음 상체를 버리고 펠릿을 영하 20도에서 동결하여 간단한 보관을 하십시오. 원래 세균 현탁액의 각 250 밀리리터에 대해, 박테리아 펠릿에 선택한 완충제의 5 밀리리터를 적용합니다.적용된 버퍼 5밀리리터당 베타-메르카토에탄올 10마이크로리터를 추가합니다. 10 밀리리터 파스퇴르 파이펫을 사용하여 긁힘과 파이펫팅을 사용하여 펠릿을 서스펜션으로 기계적으로 강제합니다. 모든 서스펜션을 50 밀리리터 튜브로 옮기십시오.그런 다음 서스펜션을 초음파 처리합니다. 다음으로, 섭씨 4도에서 고속으로 30분 동안 원심분리기. 얼음 에 필터 단위로 연속적으로 상체를 필터링합니다.안정적인 리테이너에 부착하고 니켈 NTA 실행 버퍼로 세척하여 빈 플라스틱 또는 유리 기둥을 준비합니다. 단백질 현탁액의 각 10 밀리리터에 대해 열에 니켈 NTA 아가로즈 슬러리의 500 마이크로 리터를 적용합니다. 니켈 NTA 실행 버퍼로 컬럼을 완전히 채우면 아가로즈 수지를 방해하지 않고 버퍼가 중력에 의해 실행되도록 합니다.다음으로, 단백질 현탁액을 컬럼에 적용하고 시료가 중력에 의해 통과되도록 한다. 샘플이 통과한 후 컬럼을 니켈 NTA 실행 버퍼로 채웁니다. 컬럼 아래에 UV 투명 큐벳을 놓고 니켈 NTA 용출 버퍼 1밀리리터를 수집합니다.빈 샘플 대 280 나노미터에서 샘플의 광학 밀도를 확인하십시오. 최적으로, 샘플은 2.5보다 큰 광학 밀도를 표시합니다. FAHD 단백질과 니켈 NTA 용출 완충제는 동결 및 해동 시 침전되며, 투석 버퍼 100밀리리터당 DTT 의 마이크로리터 1개를 사용하여 얼음에서 하룻밤 동안 다른 완충제에 대해 단백질을 투석합니다.FPLC 시스템을 설정하고 5개의 열 볼륨으로 열을 세척하고 5개의 열 량의 물을 제공합니다. 컬럼을 계평화한 후 투석된 샘플을 열에 적용하고 흐름을 수집합니다. 그라데이션 용출을 설정합니다.그라데이션이 완료되면 한 열 볼륨 범위에서 더 이상 피크가 감지되지 않을 때까지 높은 염분 버퍼로 실행합니다. 마이크로 플레이트 리더기를 시작하고 섭씨 25도에서 30분 동안 평형화합니다. 효소 분석 버퍼에서 테스트할 기판의 20 밀리머 용액1밀리리터를 준비합니다.텍스트 프로토콜의 파이펫팅 계획에 따르면, 효소 분석 버퍼 90마이크로리터를 5마이크로리터의 효소 용액으로 우물에 배관하여 효소 블랭크 및 샘플 웰을 준비한다. 그런 다음 95 마이크로리터의 효소 분석 버퍼를 우물에 배관하여 기판 블랭크 및 샘플 웰을 준비합니다. 측정 직전에 5개의 마이크로리터의 효소 분석 버퍼를 6개의 빈 우물에 적용합니다.20 밀리머 기판 용액의 5개의 마이크로리터를 샘플 웰에 적용합니다. 50 마이크로리터 설정에서 멀티 채널 파이프를 사용하여 우물을 부드럽게 혼합합니다. 그런 다음, 마이크로 플레이트 리더에 플레이트를 삽입하고 255 나노미터에서 각 우물을 측정합니다.마지막으로 스프레드시트에서 분석을 수행합니다. 최적이고 최적이 아닌 변환 후 LB 천 판의 두 가지 예가 여기에 묘사됩니다. 너무 많은 세균성 식민지는 2개의 많은 박테리아가 도금되었거나 항생제가 만료될 수 있다는 것을 표시합니다.너무 적은 세균성 식민지는 충분하지 않은 플라스미드가 변환을 위해 사용되었거나 너무 많은 항생제가 박테리아를 선택하는 데 사용되었다는 것을 나타낼 수 있습니다. 밀리그램 수량으로 발현 단백질을 함유한 세균성 펠릿을 수확하고 발현은 SDS 페이지를 통해 검증된다. 일부 문제는 포함 된 신체 또는 발현 되지 않는 단백질을 형성 하는 단백질을 포함 하 여 이 그렇지 않으면 간단한 과정 동안 발생할 수 있습니다.그의 태그가 단백질을 태그하는 데 사용되는 경우, 니켈 NTA 아가로즈와의 친화 성 염색체는 오염의 대부분을 제거하는 쉽고 저렴한 캡처 방법입니다. 태그가 사용되지 않으면, 암모늄 황산염 침전및 연속 소수성 교환 크로마토그래피의 조합은 또한 단백질을 다른 단백질의 대다수로부터 분리할 수 있다. 단백질은 이온 교환 크로마토그래피에 의해 남은 오염으로부터 더 분리되고 크기 배제 크로마토그래피를 통해 충분히 순수한 단백질을 얻습니다.특히 설명된 방법 중 어느 것도 어렵지 않습니다. 그러나 모든 방법은 교육이 필요합니다. 첫 번째 시도는 실패할 수 있지만 몇 가지 추가 적응 후에 실험이 성공할 수 있습니다.여기에 제시된 모든 방법은 단백질 정제의 일반적인 방법입니다. FAHD 단백질에 특화된 비록, 프로토콜은 정화하고 싶은 어떤 단백질든지에 적응될 수 있습니다. 재조합 인간 FAHD-1은 설명된 방법과 고해상도 엑스레이 구조에 의해 얻어졌으며, decarboxylase 및 하이드로라제와 같은 기능으로 FAHD-1에 대한 우리의 이해에 크게 기여하였다.이 작업에 사용되는 박테리아는 안전 균주이며 위험하지 않습니다. 일반 안전 가이드는 모든 화학 물질에 적용되며 FPLC 컬럼은 주의하여 처리해야 합니다.

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연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

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Fumarylacetotate 하이드로 아세테이트 도메인 함유 단백질의 발현, 정제, 결정화 및 효소 어세포

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