인간 신장 조직에서 지역 전사학을 밝히기 위해 레이저 미세 절제술의 응용 프로그램

레이저 미세해부는 신장 조직 샘플 내에서 공간적으로 정의된 영역의 전사체 분석을 가능하게 합니다. 이를 통해 질병으로 인한 변화가 발생한 후에도 관심 구조를 식별할 수 있는 고유한 기회를 얻을 수 있습니다. 이 방법론의 주요 장점은 단일 세포 RNA 염기서열분석과 같은 다른 오믹스 기술과의 상보성입니다.

그것은 현저한 조직 경제를 제공하고 심지어 낮게 발현된 전사체의 검출을 허용합니다. 조직 샘플을 획득한 후 섭씨 영하 20도로 설정된 저온 유지 장치를 사용하여 표본을 12마이크로미터 두께로 절단하고 슬라이드 어댑터를 사용하여 표본을 특수 레이저 현미해부 슬라이드에 고정합니다. 동결절편 후 10일 이내에 PBS의 RNase-free 10%BSA 89.2마이크로리터를 FITC 팔로이딘 4마이크로리터, DAPI 1.5마이크로리터, Alexa Fluor 546에 직접 접합된 관심 항체 2마이크로리터 및 RNase 억제제 3.3마이크로리터와 혼합합니다.

영하 20도의 온도에서 100% 아세톤으로 슬라이드를 1분 동안 세척하고 슬라이드를 습도 챔버에 넣습니다. 세척당 30초 동안 새로운 RNase-free PBS로 슬라이드 상단을 두 번 세척한 다음 RNase-free PBS에서 10% BSA로 30초 동안 두 번 세척합니다. 마지막 세척 후 준비된 항체 용액으로 샘플을 실온에서 5분 동안 처리한 후 RNase-free PBS에서 10% BSA로 2회 더 세척합니다.

두 번째 세척 후 슬라이드를 레이저 현미해부 절단 플랫폼에 로드하기 전에 조직 배양 후드에서 슬라이드를 5분 동안 자연 건조합니다. RNA 분리 키트에서 50마이크로리터의 추출 버퍼를 포함하는 PCR 작업에 적합한 오토클레이브 500마이크로리터 마이크로 원심분리 수집 튜브를 장치에 설치합니다. 로딩 후 염색, 형태 및 위치를 기준으로 샘플 내의 관심 영역을 식별합니다.

면역형광을 사용하여 최소 500, 000 마이크로미터 평방 세그먼트의 윤곽을 그립니다. 그런 다음 40 이상의 레이저 출력을 사용하여 해당 부위를 절제하기 위해 레이저 현저부를 시작합니다. 레이저 현미해부 과정이 완료되면 마이크로 원심분리기 수집 튜브의 뚜껑을 닫고 튜브를 세게 튕겨 내용물이 캡에서 튜브 바닥으로 이동하도록 합니다.

원심분리 후 튜브를 섭씨 42도의 수조에서 30분 동안 배양한 후 튜브를 다시 원심분리합니다. 그런 다음 상등액을 섭씨 영하 80도의 새 500마이크로리터 튜브로 옮깁니다. 신장에서 세뇨관 하위 세그먼트의 식별은 세포 형태 및 구조적 랜드마크 외에도 고유한 세뇨관 마커의 항체 염색을 통해 이루어집니다.

형태학적 조직 특징 및 이미지 구조의 공간적 위치와 함께 형광 라벨링은 높은 신뢰도로 신장 하위 세그먼트를 시각화하는 데 도움이 됩니다. 이 대표적인 다운스트림 염기서열분석 분석에서 최소 해부 면적 투입량을 충족하는 성공률이 90% 이상이었으며, 그 결과 유전자 검출에 사용할 수 있는 총 mRNA 수량이 많았습니다. 이 분석에서는, 견본의 100%는 적어도 10, 000의 유전자의 최소한도 탐지 문턱에 맞혔다.

레이저 현미해부 후, 알려진 마커의 유전자 발현에 대한 농축 분석을 다른 구획의 유전자 발현과 비교할 수 있습니다. 이 분석에서는 레이저 미세해부 부위 전사체학을 통해 각 하위 세그먼트에 대한 하나의 마커를 식별했으며, 이는 해당 네프론 하위 세그먼트의 특정 면역조직화학적 염색도 생성했습니다. 레이저 현미해부는 해부할 관심 구조를 정확하게 식별하기 위해 사용자의 전문 지식에 크게 의존한다는 점에 유의하는 것이 중요합니다.

이 기술을 사용하면 질병 진행과 관련된 잠재적 경로와 건강한 조직의 생물학을 평가하는 데 사용할 수 있는 특정 지역 유전자 발현 시그니처를 연구할 수 있습니다.