Name: 레이저 Microdissection는 세포의 하위 집합 유전자 발현 프로 파일링에 적용 Drosophila 윙 디스크 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-30T17:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 59 s
Description: 배우세요 레이저 미세절단을 이용한 Drosophila 날개 원반의 특정 구역 유전자 발현 프로파일링 방법입니다. RNAi 침묵 및 비침묵 영역을 비교하여 조직 미생태계에서 유전자 조절 메커니즘을 규명합니다.

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저자 프로프 감사합니다. 키아 라 캄파넬라과 경쟁력의 암라 센터, 레이저 microdissector의 사용과 그들을 제공하는 나폴리 페데리코 II 대학, 나폴리, 이태리, 그리고 3D 애니메이션 관대한 도움 씨 빈센조 Vicidomini.

1 부. 구체적이고 현지화된 RNAi의 대상이 Drosophila Imaginal 윙 디스크의 준비. 생물 학적 소재로, 우리는 GAL4/UAS 시스템 1에 의해 언어 및 특정 유전자 입을 대상이 유전자 변형 애벌레에서 얻은 Drosophila imaginal 윙 디스크를 사용했습니다. 하나 GAL4 드라이버 UAS 응답 두 번째를 가지고이 애벌레 자손은 두 부모의 라인과 관련된 유전자 십자가에서 orginates. 특정 시간적 및 / 또는 공간적 패턴에 GAL4을 표현하는 것 외에도, 드라이버 라인은 GAL4 표현 도메인을 시각화 수 UAS - GFP 기자를 수행합니다. UAS 응답 라인, UAS 시퀀스의 통제를 받고 특별히 관심을 선택한 유전자 (유전자 X 불러야 2) 타겟팅할 수 RNA (hpRNA)을 입을 헤어핀을 표현. 일단 세포로 표현, hpRNA X는 특별히 선택된 유전자를 침묵 할 수 작은 간섭 RNA (siRNA)를 생성 죽습니다. 애벌레 자손에서, 그 드라이버와 UAS - 입을 구조에만 GAL4 단백질을 표현하는 그 세포 베꼈는데는 응답 transgenes을 모두 실시하고, 따라서 선택된 유전자 X의 공간 제한 입을를 유도 수 있습니다 가능한 응용 프로그램의 다양한 가운데, 우리는 engrailed - GAL4의 통제하에 우리의 관심이 선택한 유전자 (유전자 X) (EN) 드라이버, 날개 디스크 3의 후부 구획에서 특정 입을를 실행할 수있는 침묵이 접근 방식을 적용 , 그의 영토는 UAS - GFP transgene의 표현에 의해 표시되었다. 침묵 imaginal 날개 디스크가 손으로 해부 특히 주변 오염 조직, 준수 tracheas를 제거하기 위해 돌보는했다. 각 절연 날개 디스크 다음 신속하고 부드럽게 선택 영역의 즉각적인 레이저 microdissection을위한 이전 처리, RNase 무료 해부 프레임으로 전달했다. 2 부. 날개 디스크의 침묵 (후부)와 unsilenced (앞쪽에) 구획에서 선택한 영역의 레이저 microdissection. 그리고 unsilenced (앞쪽에, GFP - unlabelled) 구획이 실현되었다;되면 날개 디스크 침묵 (GFP - 표시 후부)에서 특정 영역의 레이저 microdissection은 멤브레인을했다. 이것은 쉽게 모두 들어갈 수있는 영역을 그림으로 수행 되었음 디스크의 GFP - 긍정적이고 부정적인 측면 GFP -. microdissector 아래, 우리는 먼저 선택한 경계선을 잘라 만드는 GFP 양성 세포에 레이저 광선을 하였다. microdissector 선택한 속도와 전력 절감과 함께 진행지만, 조직의 선택된 영역 아래에있는 튜브에 폭포까지 그것은 수동으로 절단 범위를 좁힐 수 있습니다. 이 튜브는 GFP 양성 세포는 이후 RNA 추출을위한 준비가되도록, TRI 시약의 작은 볼륨을 포함하고 있습니다. 우리는 이후 unsilenced, GFP - 부정적인 조직에서 이에 상응하는 지역을 해부하다하기 위해, 날개 디스크의 GFP - 부정적인 측면, 반대로 절단 영역을 옮겼습니다. 다시 한번, 자동 절단 후, 우리는 수동으로 절단을 수정하기 위해 진행. 일단 상처는 RNA 추출을위한 준비 또한 GFP - 부정적인 조직이 TRI 시약에서 발견되었습니다, 완료했다. 부 3. Microdissected 조직 분야에서 RNA 추출 및 전송 프로파일. 우리는 모자에서 액체를 분리하기 위해 튜브를 늘인 다음 표준 TRI 시약 프로토콜 다음 RNA 추출을 수행하는 1 ML에 TRI 시약을 추가했습니다. 충분한 자료를 수집하기 위해, 우리는 100 imaginal 날개 디스크에있는 절단 절차를 반복했다. 5000에 대한 μm의이 각각 100 지역에서 시작, 우리의 수율은 RNA 1.5 μg의되었습니다. 매뉴얼 해부의 정확도는 다음 랜덤 Hexamers와 cDNA 합성하는 슈퍼 스크립트 III (Invitrogen)를 사용하여 RT - PCR에 의해 침묵과 unsilenced 샘플에서 GFP 발현을 선택하여 제어했습니다. 함께 자사의 규제 경로의 putative 대상의 사람과 침묵 유전자 X의 표현 수준을 결정하기 위해 주력하고 이후 정량 분석​​은 마스터 믹스 (Invitrogen)을 사용하여 실시간 RT - PCR에 의해 수행되었다.

<ol><li>Elliott, D. A., Brand, A. H. The GAL4 System A Versatile System for the Expression of Gene. Dahmann, C. , Humana Press Inc. Totowa, NJ. (2008).</li>
<li>Klein, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wing+disc+development+in+the+fly%3A+the+early+stages.+%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Wing disc development in the fly: the early stages. </a> Current Opinion in Genetics & Development. 11, 470-475 (2001).</li>
<li>Dietzl, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+transgenic+RNAi+library+for+conditional+gene+inactivation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila.</a> Nature. 448, 151-U1-151-U1 (2007).</li>
<li>Martin, F. A., Morata, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartments+and+the+control+of+growth+in+the+Drosophila+wing+imaginal+disc%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Compartments and the control of growth in the Drosophila wing imaginal disc.</a> Development. 133, 4421-4426 (2006).</li>
<li>Tabata, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+morphogen+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetics of morphogen gradients.</a> Nature Reviews Genetics. 2, 620-630 (2001).</li>
<li>Moreno, E. &amp, Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((dMyc+transforms+cells+into+super-competitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">dMyc transforms cells into super-competitors.</a> Cell. 117, 117-129 (2004).</li>
</ol>

unsilenced 날개 디스크의 앞쪽에 / 후부 구획에 달성 자신의 기초 표현 수준과 관련하여, 선택된 유전자 X의 활동이 입을시 40 %까지 감소 발견되었습니다. 대조적으로, 자사의 putative 목표 (유전자 Y) 중 하나는 우리가 부정적인 유전자 X. 규제했다는 가설을 검증하기 위해 선도적인, (7 접이식 증가)까지 - 규제 대폭 발견 우리는 위에서 설명한 실험 방법이 성공적으로 다양한 규제 경로의 putative 대상의 검증에 적용할 수있는 결론을 내린다. 또한, 우리는 RNA 추출의 수율 개선이 빠른 속도로 microarray 분석에 의해화된 전송 프로파일의 특성으로 인한 것을 짐작할. 이것은 중요한 생물 학적 과정의 자세한보기를 달성하기위한 가능성을 열 것이다. 예제를 들어, 잃어버린 및 우승자 세포 클론 morphogenetic 그라디언트 4, 5 또는 셀 대회 6 과정...

변종 플리 Drosophila UAS - 입을 라인 VDRC RNAi 모음 2에서 구할 수 있습니다. GAL4 - 드라이버 라인 컬렉션은 블루밍턴 Drosophila 증권 센터 (인디애나, 미국)에서 사용할 수 있습니다. 장비 필요한 장비는 레이저 microdissector (Leica LMD6000), 쿨터 Microfuge 22R (베크맨), PCR (내 자전거 타는 사람을 BIO - RAD), 실시간 PCR (BIO - RAD iQ5)가 포함되어 있습니다. 도구 필요한 도구는 다음과 같습니다 유리 웰스, 브러시, microdissection의 포셉, 매달려 드롭 슬라이드, 주사기 바늘, PET 멤브레인, 플라스틱 튜브 (50 ML, 05 ML, 0.25 ML)과 금속 프레임에 장착된 곤충 핀합니다.

레이저 microdissection는 세포의 하위 집합 유전자 발현 프로 파일링에 적용 drosophila 윙 디스크

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

조직의 이질적인 성격 스트림 분석을 손상, 생물 학적 샘플에서 생성된 수있는 정보의 양을에 제한 요소로 입증되었습니다. 생체내 상호 작용의 분자 철저한 분석을 요점을 되풀이하기 위해 많은 조직 내의 기존의 복잡하고 역동적인 세포 연결을 고려 하나는 자신의 기본 컨텍스트 내에서 특정 세포 인구를 분석할 수 있어야합니다. 레이저 중재의 microdissection은 분자 무결성을 유지하면서 직접 미세한 시각에 따라 관심의 세포의 모호하지 식별 및 풍작을 수 있도록,이 목표를 달성하실 수 있습니다. 우리는 성장 조절, 세포 분화 및 organogenesis를 연구하는 유리한 모델 시스템을 대표하는 개발 Drosophila 날개 디스크의 정의된 영역 내에서 유전자 발현을 분석하는이 기술을 적용했습니다. 애벌레 imaginal 디스크는 천재적으로 가계 제한 경계에 의해 앞쪽에 및 사후, 지느러미 및 복부 구획으로 세분화됩니다. inducible GAL4 - UAS 이진 표현 시스템이 구획의 각 특별히 만들 GAL4 - 드라이버 해당의 통제하에 UAS - GFP transgene을 표현 형질 전환 파리에서 라벨 수있는 사용하고. 형질 디스크에서 세포의 개별 하위 집합의 유전자 발현 프로 파일링은 정확하게 레이저 절단을 안내하기 위해 형광 GFP 신호를 사용하여 레이저 중재 microdissection 후 결정하실 수 있습니다. 하류 응용 프로그램의 다양한 가운데, 우리는 지역화된 RNA 간섭 (RNAi) 이후 RNA의 성적표 프로 파일링에 집중했다. RNAi 기술의 출현과 함께, GFP 라벨은 특정 유전자 입을 수있는 분리된 세포 인구의 transcriptional 응답을 한정된 수 있도록, 주어진 유전자의 현지 최저와 결합 수 있습니다. 이 방법의 유효성을 검사하기 위해, 우리는 (GFP 표현으로 표시) 뒷부분에서 디스크의 동일한 영역을 해부하고, 그렇지 않으면 ubiquitously 표현 유전자의 P의 구획에 지역 입을시 앞쪽에 (unlabelled) 구획. RNA는 microdissected 침묵과 unsilenced 영역과 정량 실시간 RT - PCR에 의해 결정 비교 유전자 발현 프로 파일링에서 추출한했다. 우리는이 방법이 효과적으로 Drosophila imaginal 디스크 내에서 세포의 하위 집합의 정확한 transcriptomics에 대해 적용할 수 것을 보여줍니다. RNA의 소스로 거대한 디스크 준비가 일반적으로 세포 균질성을지지하면서 실제로, 그것은 잘 transcriptional 표현이 위치 정보의 결과에서 이러한 구조 내에서 크게 달라질 수 있다고 알려져 있습니다. 레이저 절단을 안내화된 형광 GFP 신호를 사용하여보다 정확한 transcriptional 분석이 수행하고 수익성 자신의 기본 컨텍스트 내에서 서로 다른 세포 lineages의 사본 프로 파일링 포함하여 서로 다른 응용 프로그램에 적용할 수 있습니다.

레이저 microdissection은 현지화된 RNAi를 받게 Drosophila 날개 디스크의 특정 구획에있는 유전자 발현 프로 파일링을 분석에 적용되었다<em&gt; 생체내에</em&gt;. 침묵과 unsilenced 구획의 상당 지역에서 추출한 RNA는 기본 조직 microecology의 컨텍스트 내에서 비​​교 유전자 발현 프로 파일링을 결정하는 정량 RT - PCR로 분석했다.

레이저 Microdissection는 세포의 하위 집합 유전자 발현 프로 파일링에 적용 Drosophila 윙 디스크

조직의 이질적인 특성은 생물학적 시료로부터 생성할 수 있는 정보의 양에 있어 제한 요인임이 입증되었으며, ...

본 영상에서는 초파리 날개 성숙판(wing disc)의 유전자 억제 영역과 비억제 영역 간의 RNA 전사체 프로파일링 비교 분석을 위해 적용된 레이저 미세절단법(laser microdissection)에 대해 상세히 설명합니다. 이 방법의 생물학적 시료로는 수작업으로 분리한 초파리 상상판(image discs)이 필요하며, 주요 장비로는 레이저 미세절단기가 사용됩니다. 본 실험에서는 LI A-L-L-M-D 6, 000과 실시간 PCR 기기를 사용합니다.BioRad iq를 사용하였습니다. 필요한 다섯 가지 소형 도구는 오목 플레이트, 소형 페인트 브러시, 미세절제 포셉, 현수적 슬라이드, 주사바늘에 장착된 곤충 핀, PET 막이 있는 금속 프레임, 소형 플라스틱 튜브입니다. 이 방법은 다음 단계들로 구성됩니다.첫 번째 단계는 GAL4-UAS 시스템을 이용하여 자손에서 국소적이고 특이적인 유전자 억제를 유도하기 위해 적절한 두 가지 oph 형질전환 라인을 교배하는 것입니다. 두 번째 단계는 해부 프레임을 처리하는 것입니다. 세 번째 단계는 레이저 미세 해부 장치를 설정하는 것입니다.4단계에서는 유전자 교배로 얻은 유충 자손으로부터 날개 성충원반을 수동으로 수집합니다. 5단계에서는 GFP로 표지된 성충원반의 특정 영역에 대해 레이저 미세절단을 수행합니다. 6단계에서는 원반의 억제된 영역과 억제되지 않은 동등한 영역의 전사체 프로파일링을 통해, 표적 유전자의 억제로 인해 유발된 효과를 규명할 수 있습니다.유전자 X라고 명명된 유전자의 생체 내(in vivo) 전사 프로파일링을 위해서는 미세 절제 영역으로부터 RNA를 추출하고, 수동 절제의 정확도를 제어하며, R-T-P-C-R을 통해 두 샘플의 GFP 발현을 평가하고, 실시간 R-T-P-C-R 또는 마이크로어레이 분석을 수행하여 두 샘플에서 억제된 유전자의 추정 표적 발현량을 정량화하는 과정이 필요합니다. 이제 각 단계에 대한 자세한 내용을 살펴보겠습니다.첫 번째 단계인 유전적 교배입니다. 유전적 교배는 GAL4 UAS 형질전환 계통을 이용하며, 유충 자손에서 유전자가 억제된 성충원판을 얻는 데 중점을 둡니다. 다재다능한 GAL4 시스템을 통해 RNA 간섭에 의한 특이적이고 국소적인 유전자 억제를 유도할 수 있습니다.한 계통은 특정 시간적 또는 공간적 패턴으로 GAL4를 발현하는 드라이버 트랜스진과 GAL4 발현 영역의 시각화를 가능하게 하는 UAS-GFP 리포터를 교

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의 레이저 캡처 Microdissection Drosophila 주변 뉴런

초파리의 성체 구조는 상상 원반이라고 하는 주머니와 같은 구조에서 파생됩니다. 이러한 디스크의 분석은 조직 결정, 구획 경계 설정, 세포 증식, 세포 운명 사양 및 평면 세포 극성을 포함한 많은 발달 과정에 대한 통찰력을 제공합니다. 이 프로토콜은 광/형광 현미경 검사를 위해 가상 디스크를 준비하는 데 사용됩니다.

해부하고, 상상 디스크의 면역 염색에서 초파리

여기에서는 전사 프로파일링을 위한 특정 식물 세포 유형의 레이저 보조 미미해부에 대한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 다양한 종과 세포 유형에 적합하지만, 십자화과 속 Boechera에서 유성 생식 및 종말 생식에 중요한 암컷 생식세포의 접근하기 어려운 세포에 초점을 맞추고 있습니다.

개별 세포 유형의 전사 프로파일 링을위한 도구로 레이저를 이용한 이외에 Microdissection (LAM)

이 프로토콜은 초파리의 눈 / 더듬이 가상적인 디스크 (EAD에게)에서 형광 표시, 유 전적으로 정의 클론 종양을 생성하는 방법을 보여줍니다. 그것은 세 번째 령 유충과 방법을 시각화하고 유전자 발현 변화와 종양 침입을 정량화를 처리하는 방법에서 EAD 뇌를 해부하는 방법에 대해 설명합니다.

그만큼<em&gt; 초파리</em&gt; 가상적인 디스크 종양 모델 : 유전 모자이크를 사용하여 유전자 발현 및 종양 침윤의 시각화 및 정량화

발달적으로 중요한 많은 유전자는 세포 또는 조직 특이적 발현 패턴을 가지고 있습니다. 본 논문은 야생형과 비교하여 옥수수잎-칼집 경계와 lg1-R 돌연변이에서 다르게 발현되는 유전자를 확인하기 위한 LM RNA-seq 실험에 대해 설명합니다. 여기에서 논의된 실험적 고려 사항은 다른 발달 현상의 전사체 분석에 적용됩니다.

레이저 이외에 Microdissection RNA-서열에 대한 실험 디자인 : 옥수수 잎 개발의 분석 교훈

정확 하 게 초파리 조직에서 성적 증명서 또는 단백질을 감지 하는 능력은 그들의 풍부 및 지역화 프로세스와 관련 된 개발을 공부 하 고 중요 합니다. 여기에 번데기 날개를 해 부하는 간단한 프로시저의 설명이 이다. 이 날개는 몇 가지 기법 (immunohistochemistry, PCR 분석 결과, 등)에서 샘플으로 사용할 수 있습니다.

번데기 날개 초파리 Immunodetections 또는 PCR 분석 실험에 적합의 해 부를 신속 하 고 효율적인 방법

이 프로토콜은 마우스 배아의 신선한 냉동 섹션에서 연골과 뼈의 분리를 위한 레이저 포획 미세 분부를 설명합니다. 연골과 뼈는 크레실 바이올렛 염색에 의해 빠르게 시각화되고 전사분석을 위한 고품질 RNA를 산출하기 위하여 정확하게 집합될 수 있습니다.

유전자 발현 분석을 위한 마우스 배아 연골 및 뼈의 레이저 포획 미세 해부

리간드에 노출되는 타이밍은 발달 결과에 영향을 미칠 수 있습니다. 여기에서 우리는 날개 디스크의 세포에서 Dpp에게 불린 Drosophila 뼈 형태 유전학 단백질 (BMP)의 심상 방출을 보여주는 방법을 보여줍니다.

초파리 날개 디스크에서 이미징 Dpp 릴리스

RNA 시퀀싱을 위해 개별 선충류 조직을 분리하기 위해 레이저 미세 해부를 사용하는 프로토콜이 기술되어 있습니다. 이 프로토콜은 종 특이적 유전자 툴킷을 필요로하지 않으므로 단일 조직 샘플 수준에서 다른 종간에 유전자 발현 프로필을 비교할 수 있습니다.

종에 구애받지 않는 단일 조직 응용 분야를 위한 레이저 미세 해부

우리는 GFP 재구성 기반 접근법을 사용하여 살아있는 초파리 날개 상상 디스크의 인접한 상피층에 있는 세포 간의 접촉을 측정하기 위한 프로토콜을 설명합니다.

살아있는 초파리 날개 상상 디스크에서 사이톤군에 의해 매개되는 세포-세포 접촉을 평가하기 위한 GFP 상보 기반 이중 발현 시스템

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Drosophila melanogaster의 눈-더듬이 및 날개 상상 디스크의 소규모 해부 및 항체 염색

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