레이저 Microdissection는 세포의 하위 집합 유전자 발현 프로 파일링에 적용 Drosophila 윙 디스크

본 연구에서는 초파리 날개 디스크의 침묵 영역과 uns 침묵 영역의 RNA 전사체 프로파일링을 비교하기 위해 적용된 레이저 현미해부에 대한 철저한 설명을 제공합니다. 이 접근 방식은 생물학적 재료로 수동으로 절부된 초파리 이미지 디스크를 주요 장비로 사용하는 레이저 마이크로 해부기를 필요로 합니다. 우리는 LI A-L-L-M-D 6, 000 및 실시간 PCR 기계를 사용합니다.

우리는 BioRad iq를 사용했습니다. 필요한 5 가지 작은 도구는 오목한 판, 작은 페인트 브러시, 미세 해부 집게, 주사기 바늘에 장착 된 드롭 슬라이드, 곤충 핑, 애완 동물 멤브레인이있는 금속 프레임, 작은 플라스틱 튜브입니다. 이 방법에는 다음 단계가 포함됩니다.

1단계는 GAL 4개의 UAS 시스템을 사용하여 자손에서 국소적이고 특이적인 유전자 침묵을 유발하기 위해 두 개의 적절한 oph 형질전환 계통을 교차하는 것입니다. 2단계, 해부 프레임을 처리합니다. 3단계, 레이저 마이크로 해부기를 설정합니다.

4 단계, 유전자 십자가의 유충 자손에서 날개 상상 디스크를 수동으로 수집합니다. 5단계, GFP로 표시된 상상 디스크의 특정 영역에 대한 레이저 현미해부를 수행합니다. 6단계, 디스크의 침묵 및 비고체 영역의 등가 영역에 대한 전사 프로파일링을 통해 관심 유전자의 침묵에 의해 유발되는 효과를 설정할 수 있습니다.

유전자 X 생체 내 전사 프로파일링이라고 부르려면 미세 해부 영역에서 RNA를 추출하고, 수동 해부의 정확도를 제어하고, R-T-P-C-R에 의한 두 샘플의 GFP 발현을 평가하고, 추정되는 발현의 정량화를 수행해야 합니다. 두 샘플의 침묵 유전자를 실시간 R-T-P-C-R 또는 마이크로어레이 분석을 수행하여 표적화합니다. 이제 각 단계에 대한 자세한 내용.

첫 번째 단계는 유전적 교배입니다. 유전자 교배는 GAL 4개의 UAS 형질전환 균주를 포함하며 유충 자손에서 침묵된 상상 디스크를 얻는 데 중점을 둡니다. 다용도 GAL four 시스템을 사용하면 RNA 간섭에 의한 특이적이고 국소적인 유전자 침묵을 유발할 수 있습니다.

한 균주는 십자가에서 GAL 4를 특정 시간적 또는 공간적 패턴으로 발현하는 드라이버 이식 유전자를 도입합니다. 및 A-U-A-S-G-F-P 리포터는 GAL 4개의 표현 영역을 시각화할 수 있습니다. 두 번째 균주는 헤어핀 침묵 RNA를 발현하는 UAS 반응자 전이유전자를 도입하여 세포에서 한 번 발현된 유전자 X를 특이적으로 표적으로 할 수 있습니다.

이 RNA는 이 십자가의 자손에서 선택된 유전자 X를 특이적으로 침묵시킬 수 있는 작은 간섭 RNA를 생성하기 위해 절단됩니다. UAS 침묵 전이유전자는 GAL 4 단백질을 발현하는 세포에서만 전사되므로 X 유전자의 공간적으로 제한된 침묵을 유도합니다. 다양한 응용 분야 중에서 우리는 후방 구획에서 특정 침묵을 지시하는 Grailed GAL 4 드라이버에 의해 침묵된 날개 디스크에서 RNA 전사체 프로파일링에 중점을 두었습니다.

침묵 영역은 U-A-S-G-F-P 전이유전자의 발현에 의해 표시됩니다. 뒤쪽 구획에서. GGFP의 발현과 유전자 x의 침묵이라는 두 가지 이벤트가 트리거됩니다.

2단계, RNA 활성을 억제하기 위한 해부 프레임의 처리. 프레임 슬라이드와 해부 도구를 실온에서 최소 1시간 동안 DEPC 물로 세척하고 멸균실에서 건조시킵니다. RNA의 활성을 억제하기 위해, RNA가 이미 없는 새로운 50ml 튜브를 사용하고, 튜브에 집게를 넣은 DEPC 물로 채워지고, 매달린 드롭 슬라이드 및 애완 동물 프레임을 사용하십시오.

둘 다 필요했다 현저해부를 위해. 튜브를 닫고 거꾸로 뒤집은 다음 최소 1시간 동안 반응하도록 두십시오. 실온에서 1시간 후 집게가 있는 다른 튜브로 DEPC 물을 옮깁니다.

슬라이드가 떨어지지 않도록 튜브 내부에 슬라이드를 잡으십시오. 그런 다음 슬라이드를 튜브 내부에서 건조시킵니다. 3단계, 미세 해부 설정.

먼저 필요한 모든 장치, 형광 전구, 현미경 및 현미 해부용 소프트웨어를 켭니다. 경고 창은 레이저도 켜도록 상기시켜 줍니다. 그것을 하고 microdisect 설정을 완료하는 동안 레이저를 예열하십시오.

이제 조직을 수집 할 우물을 준비 할 때입니다. 삭감. Leica LMD 6, 000 레이저 절단 장비를 사용하면 최대 4개의 튜브를 적재하여 서로 다른 샘플을 수집할 수 있습니다. 우리의 목적을 위해 두 개의 튜브만 있으면 됩니다.

하나는, GFP 긍정적인 침묵 조직을 모으기 위하여, 마이크로 pec를 가진 GFP 부정적인 unile 조직을 모으기 위하여 다른 사람. RNA를 보존하기 위해 두 튜브 캡에 20마이크로리터의 트라이 시약 용액을 채웁니다. 이제 microdisection은 4단계, joof 유충의 날개 이미징 디스크의 손 해부를 사용할 준비가 되었습니다.

앞서 설명한 바와 같이 얻은 유충 자손에서 날개 디스크를 분리하고 다른 조직이 디스크를 오염시키지 않는지 확인하십시오.이 목표를 달성하기 위해 I 해부 접근 방식은 모든 원본 디스크의 대량을 수집하는 데 일반적으로 사용되는 접근 방식과 상당히 다릅니다. 먼저 링거 용액으로 유충을 씻어 부착 매체를 제거합니다. 그런 다음 매달린 드롭 슬라이드에 넣고 즉시 입을 아래로 당겨 머리를 잘라냅니다.

이제 곤충 핀을 사용하여 다른 조직을 조심스럽게 해부합니다. 빨간색 윤곽선은 수집할 가상 날개 디스크를 보여줍니다. 디스크를 부착 조직에서 빠르고 부드럽게 유지하고 격리된 각 날개 디스크를 즉시 절단할 수 있도록 절개 프레임으로 옮깁니다.

이 절차는 총 100개의 날개 디스크 수에 도달할 때까지 반복해야 합니다. 5단계, GFP로 표시된 날개 디스크의 특정 영역에 대한 레이저 현미해부. 원래 날개 디스크가 멤브레인에 있으면 절단을 진행할 수 있습니다.

프레임을 홀더에 놓고 홀더를 전동 스테이지에 고정합니다. LMD 6, 000을 일반적인 현미경으로 사용하여 원래 날개 디스크를 찾으십시오. 그것에 초점을 맞추고 컷을 설정하십시오.

디스크의 양쪽, GFP 양극 및 다른 쪽에 맞는 타원형 영역을 그립니다. GFP 양극 파트를 수집하려는 튜브 캡을 선택합니다. 잘라내기 시작 버튼을 누릅니다.

마이크로 해부기(micro disanader)는 이동 및 절단 기능을 선택하여 이전에 설정한 속도와 힘으로 조직을 절단합니다. 선택되지 않은 조직 조각이 떨어질 때까지 수동으로 절단을 미세 조정할 수 있습니다. 3D 애니메이션은 마이크로 해부자 절단 레이저가 조직에 초점을 맞추고 선택한 둘레를 따라 절단하는 아래에서 어떤 일이 일어나는지 보여줍니다.

절단이 완료되면 조직 조각이 선택한 튜브 캡에 떨어지고 결과적으로 트라이 시약에 떨어집니다. 첫 번째 절단 후 날개 디스크의 다른 쪽에 있는 절단 영역을 이동하여 동등한 GFP 음의 영역을 절단합니다. 새로운 절단을 진행하기 전에 GFP 양성 조직과 GFP 음성 조직을 분리하기 위해 다른 튜브 캡을 선택해야 합니다.

자동 절단 후 절단 시작 버튼을 누릅니다. 두 번째 컷 전에 3D 애니메이션에서 보여준 것처럼 수동으로 컷을 미세 조정합니다. 전동 스테이지는 선택한 튜브 캡을 절단 영역 아래로 이동합니다.

레이저 빔은 선택한 둘레를 따라 절단된 조직에 초점을 맞추고, 절단이 완료되면 조직 조각이 Tri 시약이 들어 있는 선택된 튜브 캡에 떨어집니다. 충분한 자료를 수집하기 위해 100개의 가상 날개 원반에 대해 절차를 반복했습니다. 샘플을 수집했으면 튜브를 내립니다.

이것은 지금까지 수행한 모든 작업을 잃게 만들 수 있는 섬세한 단계입니다. 그러니 조심하세요. 뚜껑을 거꾸로 닫고 실험을 계속합니다.

이것은 GFP 양성 조직이있는 것입니다. 이것은 GFP 음성 조직을 가진 다른 하나입니다. 6단계, 전사 프로파일링.

튜브를 돌려 캡에서 액체를 분리하고 최대 1ml까지 Try 시약을 추가합니다. 대략 5, 000 제곱된 각각의 100개의 지역에서 표준 시도 시약 프로토콜에 따라 RNA 적출을 실행하십시오. 우리의 수율은 1.5마이크로그램의 RNA였습니다.

우리는 무작위 헥사로 CD NA를 합성하기 위해 위 첨자 3 in vitrogen을 사용합니다. 수동 해부의 정확도는 R-T-P-C-R에 의해 두 샘플에서 GFP 발현을 확인하여 제어되었습니다. 양이 많은 R-T-P-C-R이 있는 젤에서 볼 수 있듯이.

우리는 침묵 유전자 X의 발현 수준을 유전자 X 매개 조절 경로의 가능한 추정 표적의 발현 수준과 함께 평가했습니다. 이 다이어그램은 유전자 X와 그 추정 표적 중 하나의 발현 수준의 예를 보여줍니다. 그것들을 유전자 Y라고 부르는데, 이는 비고체 날개 디스크의 전방 후방 구획에 있는 기저 발현 수준과 관련되어 있다.

선택된 유전자 X의 활성은 침묵 시 40%로 감소된 것으로 밝혀졌습니다. 대조적으로, 추정 표적 중 하나인 유전자 Y는 유전자 X에 의해 부정적으로 조절되었다는 가설을 입증하도록 이끄는 7배 증가로 크게 상향 조절된 것으로 밝혀졌으며, 위에서 설명한 실험적 접근 방식이 다양한 조절 경로에서 추정 표적의 검증에 성공적으로 적용될 수 있다고 결론지었습니다.