집중 스캐닝 초음파를 사용하여 뇌로 항체 전달

치료용 항체 중 극히 일부만이 뇌에 흡수됩니다. 우리의 방법을 사용하면 항체가 혈액-뇌 장벽을 일시적으로 열어 뇌로 전달됩니다. 이 기술을 사용하면 비침습적 방식으로 쥐의 뇌에 항체를 전달할 수 있습니다.

세포 계수기를 사용하여 마이크로 거품의 품질 관리를 실행하기 위하여는, 합병기에서 마이크로 거품 해결책을 제거하고 마이크로 거품 해결책 작은 유리병의 격막을 관통하기 위하여 19의 계기 바늘을 이용하십시오. 19 게이지 바늘이 장착된 1밀리리터 주사기를 사용하여 100마이크로리터의 마이크로 버블을 5밀리리터의 여과된 유동 용액에 희석하고 100마이크로리터의 희석된 마이크로 버블 용액을 큐벳의 여과된 유동 용액 10밀리리터에 피펫으로 묽니다. 세포 계수기 플랫폼의 큐벳을 제자리에 고정하고 샘플 수집에 30미크론 조리개가 사용되는지 확인합니다.

소프트웨어에서 표준 작동 방법을 로드하고 표준 작동 방법 및 농도 편집을 선택합니다. 희석을 위해 5, 000 번 입력하고 적용 및 확인을 클릭하십시오. 정보 편집을 클릭하여 적합한 파일 이름을 선택합니다. 미리보기를 선택하고 마이크로 버블 샘플 농도가 10% 미만인지 확인합니다.시작 및 확인을 선택하여 샘플 수집을 시작합니다.

측정 후 여과된 유동 용액으로 세포 계수기의 조리개를 헹굽니다. 희석된 마이크로 버블 용액의 큐벳을 수조에서 30초 동안 초음파 처리합니다. 시연된 대로 초음파 처리된 마이크로 버블 용액을 측정하고 정보 편집을 클릭하여 데이터를 공백으로 표시합니다.

블랭크를 측정한 후 초기 판독값에서 최종 판독값을 빼서 미세 기포가 아닌 입자를 제외합니다. 형광 항 마우스 IgG 항체로 섹션을 라벨링하려면 실온에서 15분 동안 제조업체의 지침에 따라 0.1몰 중탄산나트륨 완충액에 Alexa Flour 647로 마우스 IgG 항체 1mg을 표시합니다. 배양이 끝나면 형광 표지된 항체 용액을 스핀 컬럼에 로드하고 원심분리로 항체를 정제합니다.

그런 다음 분광 광도계를 사용하여 단백질 농도를 측정합니다. 집속 스캐닝 초음파 시스템을 설정하려면 물 덩어리에 5mm 공간을 추가하여 초음파 초점을 물 덩어리 바닥에서 9mm 아래에 배치합니다. 물 덩어리에 약 300ml의 탈기된 탈이온수를 채우고 환형 배열을 채워진 물 덩어리에 놓습니다.

치과 거울을 사용하여 표면에 기포가 없는지 확인하고 응용 프로그램 소프트웨어를 실행합니다. 파형 메뉴에서 파형 듀티 사이클 설정을 선택하고 펄스 반복 주파수를 10Hz로, 듀티 사이클을 10%로, 초점을 80mm로, 중심 주파수를 1메가헤르츠로, 진폭을 0.65메가파스칼로, 기계적 인덱스를 0.65로 설정합니다. set을 눌러 파형을 정의하고 파형을 메모리에 저장합니다.

치료 계획을 선택한 후 모션 컨트롤러 창에서 스캔 탭을 열고 X 차원에서 모션에 대한 시작, 중지 및 증가 값을 입력하고 Y 방향으로 모션에 대한 시작, 중지 및 증분 값을 입력합니다. 치료 사이트에 대한 작업을 정의하려면 이벤트를 클릭하고 스크립트 편집 창을 엽니다. 각 처리 부위에서 선택한 순서대로 실행할 작업 목록을 선택하고 이동 유형을 래스터 그리드로 설정합니다.

이벤트 탭에서 작업 추가를 선택하고 동기적으로 이동 시작, 트리거, ARB 대기 및 중지, 트리거 ARB 작업을 스크립트 패널로 이동합니다. 그런 다음 대기 작업을 클릭하고 6, 000밀리초의 대기 시간을 선택합니다. 분석을 위해 동물을 준비하려면 마취된 쥐에서 발가락 꼬집음에 대한 반응 부족을 확인한 후 영구 마커를 사용하여 머리 중앙에 라벨을 붙인 다음 바닥 컷오프가 있는 작은 계량 보트의 바닥에 플라스틱 랩을 붙이고 계량 보트에 초음파 젤을 채웁니다.

집중 초음파 처리를 위해, 마이크로 거품의 유리병을 반전시키고 29 계기 인슐린 주사기로 쥐의 체중의 그램 당 해결책의 1 마이크로리터를 온화하게 적재하십시오. 형광 표지된 항체 100마이크로리터를 주사기에 추가하고 주사기를 엄지와 검지 손가락 사이에 주사기를 부드럽게 뒤집어 굴려 항체와 주사기 내의 미세 기포를 혼합합니다. 조심스럽고 천천히 150마이크로리터의 마이크로 버블과 항체 용액을 마우스에 역궤도 주입하고 타이머를 2분으로 설정합니다.

안과 연고를 바르고 마우스를 헤드 홀더에 넣고 코를 홀더에 고정합니다. 초음파 젤로 채워진 작은 계량 보트를 머리 위에 놓고 계량 보트 내의 초음파 젤 위에 놓일 때까지 물 덩어리를 내립니다. 그런 다음 조이스틱을 사용하여 헤드 중앙 내에서 변환기 초점을 시각적으로 정렬합니다.

타이머가 꺼지면 소프트웨어의 모션 탭에서 원점 재설정을 선택하고 전체 스캔을 선택합니다. 치료가 완료되면 동물의 눈에 안과 연고를 바르고 마우스를 따뜻한 회복 챔버에 넣습니다. 여기에서는 마이크로 버블이 올바르게 생성되었을 때 얻을 수 있는 크기와 농도에 대한 배양 계수기 측정의 대표적인 결과를 나타냅니다.

뇌에 의한 항체 흡수는 적외선 스캐너 또는 형광 현미경을 사용하여 전체 뇌 또는 조직 섹션에서 쉽게 시각화할 수 있습니다. 이러한 이미지에서 입증된 바와 같이, 미세아교세포(microglia) 마커에 대한 대표적인 염색은 미세아교세포가 항체 전달 후 더 식세포가 되는지 여부를 결정하는 데 사용할 수 있습니다. 특히 역안와 주사를 수행하고 생쥐의 머리 위에 변환기를 적용할 때 동물의 복지와 안전을 보장하는 것이 중요합니다.

이 방법을 사용하면 다양한 스캐닝 패턴을 적용하여 해마, 피질 또는 개별 뇌 반구와 같은 뇌의 여러 영역을 표적으로 삼을 수 있습니다. 이 기술은 혈액뇌장벽을 관통하는 새로운 치료법과 약물을 개발하고 혈액뇌장벽의 형성 및 개방 메커니즘을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.