뇌 구조를 표적으로 삼고 화학 유전 학적 신경 조절을 평가하기위한 집중 초음파 유도 혈액 뇌 장벽 개방

이 프로토콜은 집속 초음파 혈액 뇌 장벽(BBB) 개방, 결과 유전자 발현 평가 및 조직학적 검사를 통한 화학 유전 수용체의 신경 조절 활성 측정을 통해 유전자 전달에 필요한 단계를 설명합니다.

당사의 프로토콜은 마우스에서 집속 초음파의 밀리미터 미만의 정밀도 표적화를 가능하게 합니다. 이를 통해 수술이나 MRI 호환 초음파 장비를 사용할 필요 없이 저렴한 3D 프린팅 부품을 사용하여 초음파를 표적화할 수 있습니다. 집속 초음파 혈액-뇌 장벽 개방은 처음에는 상당히 까다로울 수 있습니다.

변환기가 탈기된 젤 또는 물을 사용하여 동물에 적절하게 결합되고 주입 중에 미세 기포가 무너지지 않는 것이 중요합니다. 이 절차를 시연하는 사람은 Caltech의 대학원생인 Richard Li입니다. 마취된 마우스에서 페달 반사에 대한 반응 부족을 확인한 후, 헤파린 식염수 1밀리리터당 10단위를 사용하여 깨끗한 25-35 게이지 카테터를 세척하고 에탄올 패드를 사용하여 동물의 꼬리를 소독합니다.

카테터를 측면 꼬리 정맥에 삽입하고 조직 접착제를 사용하여 카테터를 제자리에 고정합니다. 바늘이 올바르게 삽입되면 카테터에서 혈액의 역류가 관찰됩니다. 접착제가 마르면 제모 크림으로 동물의 머리에 있는 털을 제거하고 마우스를 3D 프린팅 MRI 캐리지에 넣고 머리가 콧방울 안에 있는 바이트 바에 앞니를 장착합니다.

뭉툭한 막대를 안전한 압력으로 두개골에 고정하고 30초 동안 호흡을 관찰하여 동물이 초당 한 번의 호흡 속도로 자유롭게 호흡하고 있는지 확인합니다. 타겟팅 가이드를 이어바에 연결하고 호흡을 다시 확인합니다. MRI 캐리지를 MRI 홀더에 넣고 홀더를 자석 구멍 안에 넣습니다.

그런 다음 MRI 시퀀스를 획득하여 스캐너에서 마우스의 위치를 파악하고 3D 고속 로우 앵글 샷 시퀀스를 사용하여 전체 뇌를 이미지화합니다. MRI 유도 표적화를 수행하려면 캐리지를 입체 기구 내에 놓고 양면 테이프가 있는 금속 블록을 사용하여 입체 기구의 두 지지대에 블록을 고정합니다. MRI 이미지를 집속 초음파 유도 소프트웨어 프로그램이 실행 중인 컴퓨터로 전송하고 이미지를 엽니다.

모든 이미지가 로드되면 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 다시 포맷을 클릭하여 이미지를 세 축으로 다시 포맷합니다. 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 변환기를 원형 표적 가이드에 지역화합니다. 시상면 보기에서 가상 변환기의 수직 위치를 조정하여 수조와 변환기 하우징의 두께를 고려합니다.

궤적 계획에서 목표로 할 영역을 표시하고 스프레드시트에 좌표를 기록합니다. 원하는 대상 지정 깊이를 다이얼 인하고 앞에서 설명한 대로 좌표를 기록해 둡니다. 그런 다음 궤적 보내기를 클릭하고 실행하여 각 점을 대상으로 합니다.

MRI의 좌표와 입체성 프레임의 상관 관계를 파악하려면 맞춤형 장착 변환기를 타겟팅 가이드 위에 놓고 세 개의 타겟팅 볼트가 각각 트랜스듀서 홀더와 타겟팅 가이드를 모두 통과할 수 있을 때까지 이동합니다. 볼트가 장력을 받거나 기울어지지 않았는지 확인하고 트랜스듀서가 MRI에서 표적 가이드의 중심이 나타나는 지점에 위치할 때까지 트랜스듀서를 전후 방향으로 10.56mm 앞으로 이동합니다. 그런 다음 가상 트랜스듀서의 중심에서 대상 영역까지의 거리를 결정하고 프레임을 사용하여 트랜스듀서를 이러한 좌표로 이동합니다.

주사 용액을 준비하려면 800마이크로리터의 식염수와 100마이크로리터의 MRI 조영제를 1.5ml 튜브에 혼합하여 로드합니다. 다음으로, microbubble 활성화 장치에 있는 45 초 동안 micro-bubbles를 활성화하기 전에 활성화되지 않은 microbubble 해결책을, 실내 온도에 가져오십시오. 활성화 후에, 천천히 21 계기 바늘 장비된 1개 밀리리터 tuberculin 주사통으로 해결책의 중앙에서 마이크로 거품의 100 마이크로리터를 적재하고, 대조제 해결책으로 마이크로 거품의 80 마이크로리터를 추가하십시오.

부유선광을 방지하기 위해 1.5ml 튜브를 15초 동안 부드럽게 뒤집어 준비된 용액을 혼합합니다. 혼합이 끝나면 200마이크로리터의 마이크로버블 용액을 바늘이 없는 주사기에 넣고 주사기를 뒤집습니다. 플런저를 눌렀다가 집어넣어 주사기가 거꾸로 되어 있는 동안 30게이지 바늘을 주사기에 혼합하고 부착합니다.

그런 다음 바늘 끝에 물방울이 나타날 때까지 마이크로 버블 용액을 천천히 밀어냅니다. 마이크로 거품이 준비되자마자, 두개골에 압력의 0.3에서 0.45 메가 파스칼과 더불어 120의 반복과 더불어 10 밀리초에, 조정하십시오. 타겟팅 가이드를 제거하고 탈기된 초음파 젤을 마우스 머리에 바르고 거품이 생기지 않도록 주의합니다.

이어바 홀더의 평평한 부분에 직접 놓일 때까지 변환기를 내리고 좌표를 입체 기기로 다이얼합니다. 관심 있는 아데노 관련 바이러스를 체중 농도 1g당 0.5-2배 10에서 10번째 바이러스 입자로 희석하고 바이러스 입자를 30게이지 바늘이 장착된 1ml 주사기에 로드합니다. 꼬리 정맥 카테터에 용액을 주입하고 80마이크로리터의 마이크로 버블 용액을 마우스에 주입합니다.

MRI로 혈액-뇌 장벽의 개방을 평가하려면 시연된 대로 빠른 로우 앵글 샷 시퀀스를 기록합니다. DREADD 자극을 위해 클로자핀 N-옥사이드를 밀리리터당 1밀리그램 농도의 멸균 식염수에 용해시키고 복강내에 주입합니다. 출산 후 15분에서 45분 후에 동물의 행동 활동을 기록하기 시작합니다.

신경 세포 활성화 분석을 위해서는 뇌 조직을 사용합니다. 입증된 프로토콜에 따라 T1 신호 향상은 해마 영역과 뇌의 다른 부분에서 달성될 수 있습니다. 관찰된 바와 같이, mCherry에 대한 면역 염색은 DREADD 발현의 보다 신뢰할 수 있는 검출로 이어집니다.이 절차에서는 마이크로 버블을 부드럽게 다루고 MRI 이미징 및 주입 중에 동물이 안정적인지 확인하는 것을 기억하십시오.