발견 중심의 숙주-병원균 상호 작용을 위한 라벨 프리 정량적 프로테오믹스 워크플로우
2020년 10월 20일
여기서, 우리는 질량 분광계 기지를 둔 proteomics에 의하여 감염 도중 호스트와 병원체 사이 상호 작용을 프로파일기 위하여 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 단일 실험에서 호스트(예를 들어, 대식세포)와 병원체(예를 들어, Cryptococcus neoformans)의단백질 풍부도의 변화를 측정하기 위해 라벨이 없는 정량화를 사용합니다.
당사의 프로토콜은 숙주와 병원체의 관점에서 진균 감염을 조사하여 질병에 중요한 생물학적 시스템 간의 상호 작용을 식별합니다. 한 번의 실험으로 진균 단백질과 숙주 단백질을 모두 검출할 수 있으며, 감염 중에만 생성되는 진균 단백질을 식별하여 새로운 감염 관련 단백질을 나타낼 수 있습니다. 우리는 치료를 위한 새로운 항독성 전략을 발견하여 진균 감염을 치료하는 데 중점을 두고 있지만, 당사의 단백질체학 및 생물정보학 파이프라인은 보편적이며 많은 생물학적 시스템에 적용될 수 있습니다.
우리의 접근 방식은 다양한 병원체와 수많은 면역 반응에 대한 연구의 토대를 마련하며 크립토코커스와 선천면역 체계 간의 관계에 대한 새로운 통찰력을 제공하는 데 사용할 수 있습니다. 병원체에 대한 대식세포 반응과 충분한 진균 단백질을 검출하는 것이 중요합니다. 따라서 각 종에 대한 MOI와 시점을 테스트하고 최적화하는 것이 좋습니다.
대식세포와 진균 세포 배양은 어려울 수 있으므로 공동 배양 후 무엇을 기대할 수 있는지 아는 것이 중요합니다. 시각화는 연구자에게 절차 구현에 대한 확신을 제공합니다. 대식세포 감염에 대비하여 진균 세포를 준비하려면 중장상 배양에서 C neoformans 세포를 수집하고 원심분리한 다음 동일한 원심분리기 조건에서 1ml의 실온 PBS로 3회 부드럽게 세척합니다.
마지막 세척 후, 항생제 무 세포 배양 밀리리터당 8번째 세포의 1.2 배 10에서 8번째 세포, 중간 농도로 진균 세포를 재현탁시키고 70%에서 80% 컨플루언스 6웰 대식세포 배양 플레이트의 4웰 각각에 1밀리리터의 진균 세포 현탁액을 첨가합니다. 그런 다음 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 3시간 동안 넣습니다. 플레이트를 조심스럽게 기울여 세척당 웰당 1밀리리터의 PBS로 각 웰을 세 번 부드럽게 세척할 수 있도록 합니다.
마지막 세척 후 감염 숙련도를 측정하려면 6웰 플레이트의 각 웰에 1ml의 무항생제 배지를 추가하고 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 넣습니다. 적절한 실험 시점에서 각 웰에서 상층액을 수집하고 표준 프로토콜에 따라 각 웰의 LDH 양을 측정합니다. 동시에 감염되지 않은 대식세포 세포를 용해하여 최대 세포 독성 값을 결정합니다.
그런 다음 표시된 공식을 사용하여 세포 독성을 계산할 수 있습니다. 감염되지 않은 대식세포 수집 및 공동 배양을 위해 감염되지 않은 대식세포의 각 웰에 1ml의 차가운 PBS를 추가합니다. 1분 후 플레이트를 부드럽게 두드려 웰 바닥에서 세포를 분리하고 세포 현탁액을 단일 15ml 튜브에 모읍니다.
원심분리로 세포를 수집하고 상등액을 완전히 제거하여 액체 질소에서 펠릿을 즉시 급속 동결하여 영하 80도 보관을 가능하게 합니다. 데이터 세트에 대한 프로세스의 주성분 분석에 따르면 예상대로 데이터 간 분리의 가장 큰 구성 요소는 감염된 샘플과 감염되지 않은 샘플인 것으로 나타났습니다. 샘플의 두 번째 특징은 생물학적 다양성입니다.
Pearson 상관관계를 유클리드 거리에 의한 계층적 클러스터링과 결합하면 복제 재현성이 95%에서 96% 사이인 감염된 샘플과 감염되지 않은 샘플의 뚜렷한 클러스터링을 보여줍니다.Benjamini-Hochberg False Discovery Rate를 사용하여 다중 가설 테스트를 위해 보정된 학생 테스트를 수행하여 감염되지 않은 대조군과 비교하여 감염 중 풍부도에 상당한 차이가 있는 단백질을 식별할 수 있습니다. 이 분석에서 감염 시 발현의 상당한 변화를 보여주는 117개의 숙주 단백질이 확인되었습니다. 특히, 감염 중에 예상되는 대로 진균 단백질의 풍부함이 크게 증가하는 것도 관찰되었습니다.
대식세포를 공동 배양, 세척 및 검체 채취 중에 부드럽게 다루는 것이 중요합니다. 병원체가 숙주에 어떻게 적응하고 숙주가 감염으로부터 스스로를 방어하는지 정의함으로써 미생물학 및 면역학 분야에 대한 새로운 통찰력을 얻을 수 있습니다.
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개요
본 프로토콜은 질량 분석 기반 프로테오믹스를 사용하여 진균 감염 동안 숙주와 병원균 사이의 상호작용을 조사합니다. 이를 통해 단일 실험에서 숙주 및 병원균 단백질을 모두 검출할 수 있으며, 감염 관련 단백질에 대한 통찰력을 제공합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 감염성 질환
- 단백질체학
배경
- 숙주-병원체 상호작용을 이해하는 것은 질병 연구에 있어 매우 중요합니다.
- 진균 감염은 심각한 건강 위험을 초래하므로 새로운 치료 전략이 필요합니다.
- 단백질체학을 통해 감염 중 단백질 풍부도의 변화를 밝혀낼 수 있습니다.
- 대식세포는 병원체에 대한 면역 반응에서 핵심적인 역할을 합니다.
연구 목적
- 숙주 대식세포와 병원균인 Cryptococcus neoformans 사이의 상호작용을 분석합니다.
- 진균 감염 중에 생성되는 새로운 감염 관련 단백질을 식별합니다.
- 다양한 생물학적 시스템에 적용 가능한 보편적인 프로테오믹스 및 생물정보학 파이프라인을 구축합니다.
사용된 방법
- 단백질 검출을 위한 질량분석 기반 프로테오믹스.
- 단백질 풍부도 변화 측정을 위한 레이블 프리 정량 분석.
- 정확한 결과 도출을 위한 감염다중도(MOI) 및 시점의 최적화.
- 프로테오믹스 데이터 해석을 위한 생물정보학 분석.
주요 결과
- 감염 중에 특이적으로 생성되는 진균 단백질의 확인.
- Cryptococcus neoformans에 대한 대식세포 반응에 대한 통찰.
- 다양한 병원균 및 면역 반응 연구를 위한 프레임워크 구축.
- 다양한 생물학적 시스템에 대한 프로토콜의 적용 가능성 입증.
결론
- 본 프로토콜은 숙주-병원체 상호작용을 연구하기 위한 종합적인 접근 방식을 제공합니다.
- 이는 진균 감염 및 면역 반응에 관한 향후 연구의 기초를 마련합니다.
- 다른 종에 대해서는 실험 조건의 추가적인 최적화가 권장됩니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
이 라벨 프리 정량 단백질체학 워크플로우는 감염 중 숙주와 병원체의 단백질체를 동시에 프로파일링할 수 있게 하여, 감염성 질환 연구의 타겟 검증에 필수적인 편향되지 않은 단백질 풍부도 데이터를 제공합니다. 감염 관련 진균 단백질과 숙주 반응 시그니처를 식별함으로써, 이 방법은 항-독성 전략의 기전적 리스크 감소를 지원하고 전임상 타겟 선정에 정보를 제공합니다. 숙주-병원체 시스템 전반에 걸친 전이 가능성은 항진균 및 면역 조절 약물 발굴 프로그램의 포트폴리오 전반에 걸친 적용성을 높여줍니다.
바이오제약 R&D의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 과학적 가치: 감염 중에만 독점적으로 생성되는 병원체 단백질을 식별함으로써, 새로운 병원성 관련 표적이 되는 치료 가설의 검증을 가능하게 합니다.
- 과학적 가치: 두 프로테옴의 상관관계가 있는 풍부도 변화를 통해 호스트-병원체 상호작용 경로를 명확히 하여 기능적 표적 검증을 지원합니다.
- 과학적 가치: 표적 가설의 리스크를 줄이기 위해 정량적이고 재현 가능한 감염 상태의 프로테오믹 프로파일을 제공함으로써 메커니즘적 모호성을 감소시킵니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 운용 가치: 표준화된 감염 조건과 MOI 최적화를 통해 후속 분석법 개발을 위한 검증된 생물학적 시스템(감염된 대식세포)을 준비합니다.
- 운용 가치: 스크리닝 캠페인의 분석법 표준화 및 재현성 평가에 적합한 정량적 무표지 프로테오믹스 결과물을 생성합니다.
- 운용 가치: 보편적인 프로테오믹스 및 생물정보학 파이프라인 설계 덕분에 다양한 병원균에 걸쳐 확장 가능한 플랫폼 재사용을 지원합니다.
중개 및 전임상 연구
- 중개적 가치: 미생물 침입에 반응하는 질병 관련 호스트 단백질을 식별하여, 전임상 검증을 위한 바이오마커 정렬을 가능하게 합니다.
- 중개적 가치: 감염 상태의 프로테오믹스 변화를 병원성 기전과 연결함으로써, 발견 단계부터 전임상 단계까지의 연속성을 보장합니다.
- 중개적 가치: 병원성 및 호스트 방어 기전에 필수적인 단백질을 강조함으로써, 리스크가 조정된 추진 결정에 정보를 제공합니다.
파이프라인 및 워크플로 통합
이 워크플로우는 숙주-병원체 상호작용 프로파일링을 통해 초기 발견 생물학에 통합되며, 표준화된 감염 모델을 통해 스크리닝 준비 상태를 지원하고, 단백질체 변화를 병원성 및 면역 반응 메커니즘과 연결함으로써 중개 연구를 가능하게 합니다.
- 발견 생물학: 병원체와 호스트 모두의 프로테옴에서 감염으로 유도된 변화를 정량화함으로써 가설 검증과 경로 규명을 지원합니다.
- 스크리닝: 최적화된 MOI 및 시점을 적용하여 분석 준비가 완료된 생물학적 시스템을 제공함으로써, 화합물 평가를 위한 재현 가능한 감염 모델을 보장합니다.
- 분석학: 무표지 정량 측정 및 통계적 결과(예: Benjamini-Hochberg 보정 t-검정)를 제공하여 조건을 비교하고 유의하게 변화된 단백질을 식별합니다.
- 중개 연구: 프로테오믹 시그니처를 병원성 기전 및 호스트 방어 반응과 연결하여 바이오마커 발굴 및 전임상 연속성을 지원합니다.
- 기업적 재사용: 여러 병원체와 면역 체계에 적용 가능한 재사용 가능한 프로테오믹스 및 생물정보학 파이프라인을 구축하여 중복적인 방법 개발을 줄입니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 편향되지 않은 정량적 감염 상태 프로테오믹 프로파일링을 통해 타겟 검증의 예측 신뢰도를 높입니다.
- 운영적 가치: 검증된 QC 지표(PCA, 클러스터링, 95-96% 반복 재현성)와 최적화된 공동 배양, 세척 및 용해 프로토콜을 통해 재현성과 표준화를 향상시킵니다.
- 전략적 가치: 핵심 병원성 인자와 호스트 반응 네트워크를 밝혀냄으로써 go/no-go 결정을 개선하고, 항진균 프로그램의 후기 단계 생물학적 리스크를 줄입니다.
- 포트폴리오 영향: 감염 특이적 단백질 발현 및 경로 관여도를 기반으로 리스크가 조정된 타겟 우선순위 지정을 가능하게 합니다.
구현 시 고려 사항
- 포유류 및 진균 세포 배양, 프로테오믹스 시료 준비 및 질량 분석 데이터 분석에 관한 전문 지식이 필요합니다.
- LC-MS/MS 장비, 비표지 정량(label-free quantification) 소프트웨어, 그리고 PCA, 클러스터링 및 차등 발현 분석을 위한 생물정보학 도구의 사용 가능 여부에 따라 달라집니다.
- 연구 간 재현성을 확보하기 위해 감염 파라미터(MOI, 시점) 및 시료 처리 과정에 대한 팀 간 표준화가 필수적입니다.
- 진균 세포 준비 및 대식세포 합류도(confluency) 최적화를 포함하여, 서로 다른 병원체-호스트 시스템에 따른 적응 고려 사항이 포함됩니다.
- 실질적인 제한 사항으로는 높은 호스트 배경 신호 속에서 저발현 진균 단백질을 검출해야 하는 기술적 어려움이 있으며, 이를 위해 충분한 감염 깊이와 민감도가 요구됩니다.
