발견 중심의 숙주-병원균 상호 작용을 위한 라벨 프리 정량적 프로테오믹스 워크플로우

여기서, 우리는 질량 분광계 기지를 둔 proteomics에 의하여 감염 도중 호스트와 병원체 사이 상호 작용을 프로파일기 위하여 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 단일 실험에서 호스트(예를 들어, 대식세포)와 병원체(예를 들어, Cryptococcus neoformans)의단백질 풍부도의 변화를 측정하기 위해 라벨이 없는 정량화를 사용합니다.

당사의 프로토콜은 숙주와 병원체의 관점에서 진균 감염을 조사하여 질병에 중요한 생물학적 시스템 간의 상호 작용을 식별합니다. 한 번의 실험으로 진균 단백질과 숙주 단백질을 모두 검출할 수 있으며, 감염 중에만 생성되는 진균 단백질을 식별하여 새로운 감염 관련 단백질을 나타낼 수 있습니다. 우리는 치료를 위한 새로운 항독성 전략을 발견하여 진균 감염을 치료하는 데 중점을 두고 있지만, 당사의 단백질체학 및 생물정보학 파이프라인은 보편적이며 많은 생물학적 시스템에 적용될 수 있습니다.

우리의 접근 방식은 다양한 병원체와 수많은 면역 반응에 대한 연구의 토대를 마련하며 크립토코커스와 선천면역 체계 간의 관계에 대한 새로운 통찰력을 제공하는 데 사용할 수 있습니다. 병원체에 대한 대식세포 반응과 충분한 진균 단백질을 검출하는 것이 중요합니다. 따라서 각 종에 대한 MOI와 시점을 테스트하고 최적화하는 것이 좋습니다.

대식세포와 진균 세포 배양은 어려울 수 있으므로 공동 배양 후 무엇을 기대할 수 있는지 아는 것이 중요합니다. 시각화는 연구자에게 절차 구현에 대한 확신을 제공합니다. 대식세포 감염에 대비하여 진균 세포를 준비하려면 중장상 배양에서 C neoformans 세포를 수집하고 원심분리한 다음 동일한 원심분리기 조건에서 1ml의 실온 PBS로 3회 부드럽게 세척합니다.

마지막 세척 후, 항생제 무 세포 배양 밀리리터당 8번째 세포의 1.2 배 10에서 8번째 세포, 중간 농도로 진균 세포를 재현탁시키고 70%에서 80% 컨플루언스 6웰 대식세포 배양 플레이트의 4웰 각각에 1밀리리터의 진균 세포 현탁액을 첨가합니다. 그런 다음 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 3시간 동안 넣습니다. 플레이트를 조심스럽게 기울여 세척당 웰당 1밀리리터의 PBS로 각 웰을 세 번 부드럽게 세척할 수 있도록 합니다.

마지막 세척 후 감염 숙련도를 측정하려면 6웰 플레이트의 각 웰에 1ml의 무항생제 배지를 추가하고 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 넣습니다. 적절한 실험 시점에서 각 웰에서 상층액을 수집하고 표준 프로토콜에 따라 각 웰의 LDH 양을 측정합니다. 동시에 감염되지 않은 대식세포 세포를 용해하여 최대 세포 독성 값을 결정합니다.

그런 다음 표시된 공식을 사용하여 세포 독성을 계산할 수 있습니다. 감염되지 않은 대식세포 수집 및 공동 배양을 위해 감염되지 않은 대식세포의 각 웰에 1ml의 차가운 PBS를 추가합니다. 1분 후 플레이트를 부드럽게 두드려 웰 바닥에서 세포를 분리하고 세포 현탁액을 단일 15ml 튜브에 모읍니다.

원심분리로 세포를 수집하고 상등액을 완전히 제거하여 액체 질소에서 펠릿을 즉시 급속 동결하여 영하 80도 보관을 가능하게 합니다. 데이터 세트에 대한 프로세스의 주성분 분석에 따르면 예상대로 데이터 간 분리의 가장 큰 구성 요소는 감염된 샘플과 감염되지 않은 샘플인 것으로 나타났습니다. 샘플의 두 번째 특징은 생물학적 다양성입니다.

Pearson 상관관계를 유클리드 거리에 의한 계층적 클러스터링과 결합하면 복제 재현성이 95%에서 96% 사이인 감염된 샘플과 감염되지 않은 샘플의 뚜렷한 클러스터링을 보여줍니다.Benjamini-Hochberg False Discovery Rate를 사용하여 다중 가설 테스트를 위해 보정된 학생 테스트를 수행하여 감염되지 않은 대조군과 비교하여 감염 중 풍부도에 상당한 차이가 있는 단백질을 식별할 수 있습니다. 이 분석에서 감염 시 발현의 상당한 변화를 보여주는 117개의 숙주 단백질이 확인되었습니다. 특히, 감염 중에 예상되는 대로 진균 단백질의 풍부함이 크게 증가하는 것도 관찰되었습니다.

대식세포를 공동 배양, 세척 및 검체 채취 중에 부드럽게 다루는 것이 중요합니다. 병원체가 숙주에 어떻게 적응하고 숙주가 감염으로부터 스스로를 방어하는지 정의함으로써 미생물학 및 면역학 분야에 대한 새로운 통찰력을 얻을 수 있습니다.