질병에서 기능 장애 단백질-단백질 상호 작용 매핑

저희 연구는 원래의 세포와 조직에서 직접적으로 단백질-단백질 간 기능 장애를 지도화하여, 질병이 세포망을 재배선하는 방식을 밝혀냅니다. 대부분의 원자간 기법과 달리, dfPPI는 유전공학과 환자 집단에 대한 기술이 필요 없으며, 샘플당 한 번의 다중화 포착을 사용합니다. 시작하려면, 20밀리몰라 트리스, 20밀리몰라 염화칼륨, 5밀리몰라 염화마그네슘, 0.01%Nb-40을 포함한 단백질 추출 버퍼를 준비합니다.

사용 직전에 프로테아제와 인산효소 억제제를 바로 추가하고, 완충제는 얼음 위에 보관하세요. 냉동 조직 샘플을 농구가 부착된 미세 조직 균질화 튜브에 넣습니다. 500-700마이크로리터의 천연 용해 버퍼를 추가하고, 조직의 밀도와 균질화 용이성에 따라 부피를 조절합니다.

그 다음, 얼음 위에 놓인 시료를 연마 벽에 부드럽게 위아래로 움직이며 균질화하여 균일한 현탁액이 나올 때까지 진행합니다. 용해물을 4도 섭씨에서 30분간 배큐하여 바이알을 회전 장치에 올려놓습니다. 배양 중에는 샘플을 부드럽게 섞어 회전시키세요.

벤치탑 원심분리기를 사용해 13,000 G에서 4도 섭씨에서 10분간 원심분리하여 세포 이물질을 제거합니다. 상원액을 조심스럽게 수집하여 투명한 1.5밀리리터 마이크로 원심분리관에 옮기세요. 제조사 지침에 따라 BCA 검사 키트를 사용해 상청액 내 총 단백질 농도를 측정하세요.

다음으로, 이소프로판올 스톡에서 직접 폴리우레탄 비즈 한 조각을 채취합니다. 구슬이 가라앉도록 두어 저장 용매를 제거하세요. 이소프로판올을 조심스럽게 흡입한 후 천연 용해 버퍼를 추가한 뒤, 부드러운 피펫팅이나 역전으로 구슬을 완전히 재현탁합니다.

비즈를 세척하고 평형을 맞추기 위해 튜브를 소용돌이로 돌린 후 원심분리합니다. 그 후 피펫 팁이 장착된 진공 라인으로 상액을 흡인하되, 펠릿을 건드리지 않도록 주의하세요. 세척된 비드에 같은 비율로 결합 버퍼를 추가하여 균일한 작업 비드 슬러리를 만듭니다.

40마이크로리터의 폴리우레탄 비드 슬러리를 1.5밀리리터 마이크로 원심분리관에 분할하여 절단된 피펫 팁을 사용해 부드럽게 분사합니다. 그 후 각 튜브에 1밀리리터의 버퍼를 첨가하여 천연 용해 버퍼로 세 번 세척합니다. 튜브를 소용돌이로 구슬을 다시 현탁한 후, 10,000G에서 1분간 원심분리한 후 흡인으로 상원액을 버립니다.

최종 세척 후에는 튜브에 남은 액체 대부분을 제거하여 비드 펠릿이 손상되지 않도록 합니다. 정규화된 단백질 추출물을 40마이크로리터의 대조 비드 슬러리가 들어 있는 개별 1.5밀리리터 마이크로 원심분리관에 첨가합니다. 적절한 양의 천연 용해 버퍼를 추가하여 최종 부피를 250마이크로리터로 조절합니다.

샘플을 4도 섭씨에서 30분간 인큐베이팅하며, 분당 10-15회전으로 작동하는 끝-끝 회전 회전기를 사용합니다. 튜브를 10,000G에서 4도 섭씨에서 1분간 원심분리하여 대조군 구슬과 응집 또는 불용성 단백질을 함께 떨어뜨립니다. 1밀리리터 피펫을 사용해 통제 구슬에서 상청액을 조심스럽게 채취한 후, 40 마이크로리터의 세척된 폴리우레탄 비드 슬러리가 담긴 신선한 1.5밀리리터 튜브로 옮깁니다.

샘플을 4도 섭씨에서 3시간 동안 배양하고, 끝 아래로 회전시키는 회전 방식으로 진행합니다. 튜브를 조심스럽게 원심분리한 후, 상원액을 흡인하고 앞서 보인 대로 구슬을 네 번 세척합니다. 튜브에 남아 있는 PBS를 제거하세요.

세척된 구슬을 80마이크로리터 2몰 요소에 50밀리몰라 중탄산암모늄에 피펫팅 또는 짧은 소용돌이 처리하여 다시 부탁합니다. 그 다음 디티오트레이톨을 첨가하여 최종 농도는 1밀리몰에 도달합니다. 튜브를 막은 후, 37도 섭씨에서 30분간 가열된 궤도 셰이커에서 분당 1,100회전으로 진동시키며 인큐베이션합니다.

최종 농도는 3.67밀리몰에 도달하기 위해 요오도아세트아마이드를 첨가합니다. 튜브를 실온에서 어두운 곳에서 45분간 부양시키고, 분당 1,100회전으로 흔들면 됩니다. 이제 반응하지 않은 아이오도아세트아마이드를 소집하기 위해 디티오트레이톨을 추가하여 최종 농도가 3.67밀리몰라로 만들고, 피펫팅으로 부드럽게 혼합합니다.

샘플에 0.5밀리그램/밀리리터 질량분석용 Lys-C 프로테아제를 750나노그램 첨가합니다. 혼합물을 37도 섭씨에서 1시간 동안 부양하고, 분당 1,150회전으로 흔듭니다. 다음으로, 시퀀싱 등급 0.5밀리그램/밀리리터 신선화 트립신을 750나노그램 신선에 첨가합니다.

혼합물을 37도 섭씨에서 하룻밤 동안 배큐하고 분당 1,150회전으로 흔들면 됩니다. 다음 날, 샘플을 1,000-5,000 G에서 실온에서 1-5분간 원심분리합니다. 피펫을 이용해 상청액을 신선한 1.5밀리리터 마이크로 원심분리관에 조심스럽게 옮기고, 구슬을 버립니다.

소화액의 pH를 3 이하로 조절하려면 트리플루오로아세트산을 50%씩 떨어뜨리면 됩니다. 표시 스트립을 사용해 pH를 확인하세요. PU-비즈는 에피샤페로움 고해체에서 강한 HSP90, HSC70 및 뜨거운 단백질을 포착했으며, 에피샤페로머 저해액 해체의 신호는 거의 없어 프로브의 생물학적 특이성을 확인했습니다.

PU 비드의 화물 프로필은 PU 비즈 레인에서 풍부하고 고분자량 신호를 보였고, 제어 비드 레인에서는 거의 배경이 없어 성공적인 프로브 활성을 확인했습니다. Coomassie 염색된 SDS-PAGE 겔은 네 개의 인겔 처리 샘플에 걸쳐 밴드 분포가 일관되게 나타나, 질량분석기 전 천연 용해액에서 단백질 복합체가 성공적으로 농축되었음을 확인했습니다. 기술적 재현성은 주성분 분석으로 확인되었으며, 복제 샘플은 밀집되어 있고 서로 다른 샘플은 깔끔하게 분리되었습니다.

전구체 이온 강도 분포는 대부분의 특징에서 변동 계수가 20% 미만이며 샘플 간 중앙값이 9.7%에서 11.9% 사이임을 보여주어 펩타이드 검출과 회수가 일관됨을 확인했습니다. 로그 변환 단백질 풍부도의 계층적 군집화는 강한 샘플 분리와 샘플 간 변이가 보존되었으며, 단백질 강도는 낮은 풍부도부터 고농축 단백질까지 다양하게 나타납니다. 경로 풍부화 분석은 Reactome, KEGG, WikiPathways와 같은 유전자 온톨로지 범주와 큐레이션 데이터베이스를 포함한 여러 온톨로지에 걸쳐 광범위한 주석 적용 범위를 보여주었습니다.

dfPPI는 다른 접근법이 도달할 수 없는 기전적 및 치료적 통찰을 발견할 수 있게 해주었습니다. dfPPI는 인터오믹스를 실제 질병 코호트와 기본 질환 수준으로 끌어올려 정확한 기전적 및 치료 가설을 가능하게 합니다. 우리는 현재 dfPPI를 확장하여 알츠하이머병과 파킨슨병과 같은 신경퇴행성 질환의 네트워크 수준 변화를 지도화하고 있습니다.