Name: 동적 라이브 셀 이미징에 대한 호스트 병원체 상호 작용 연구를위한 광학 트랩의 사용 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: 배우세요 광학 트랩과 회전 디스크 공초점 현미경을 활용한 실시간 숙주 병원체 상호작용 관찰 기법을 통해 세포 내 동적 과정을 최소한의 간섭으로 연구하는 방법을 익히세요.

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이 작품은 의학 내부 자금의 매사 추세츠 종합 병원과 (JMT, MKM, MLC, JMV), 바이오 메디컬 이미징 국립 연구소 생물 부여 T32EB006348 (CEC), 매사 추세츠 종합 병원의 전산과 통합 생물학 발전 기금을위한 센터 및 AI062773 (지원했습니다 RJH), 보조금 AI062773, DK83756, 그리고 DK 043,351 (RJX), NSF 0,643,745 (MJL), NIH R21CA133576 (MJL), 미 국립 보건원의 알레르기 및 전염병 국립 연구소 (NIAID) (NIH) AI057999 (JMV ). 우리는 기술 지원을하는 데 도움이 토론을 위해 니콜라스 C. 요더 감사하고, 찰스​​ 펠츠 (RPI 주식 회사).

1. 광학 트래핑에 대한 병원균의 문화 조건 <ol><li> 3 일간 30 SBD (Sabouraud 덱스 트로 오스)이있는 세미 솔리드 한천 미디어 ° C에서 A. fumigatus (B-5233/RGD12-8)을 성장. </li><li> C. 그로 30 흔드는 인큐베이터에 하루 100 μg / ML 암피실린를 포함하는 YPD에 albicans (SC5314) (효모 - 펩톤 덱스 트로 오스) 액체 문화 ° C. </li></ol> 2. 형광 라벨에 대한 병원균의 준비 <ol><li> 수확은 병원균의 양을 원하는과 1.5 ML 반응 관에 전송할 수 있습니다. </li><li> 인산염의 추가 300 μL 반응 관에 호수 (PBS)를 버퍼. </li><li> 30 초 동안 혼합 Sonicate. </li><li> 1 분 4,000 rpm으로 원심 분리기. </li><li> 펠렛은 그대로두고, 뜨는을 대기음. </li><li> 반복 (2.4)과 (2.5) 두 번 더. </li><li> PBS의 500μL에 Resuspend. </li></ol> 3. 형광 염색과 병원균의 라벨링 <ol><li> 100 μL dimethylformamide (DMF) (10 MG / ML의 농도)에 대한 관심의 색소 (예 : 알렉사 플루어 488 알렉사 플루어 647) 1 MG를 디졸브. </li><li> 세탁 병원체를 포함하는 반응 튜브에 색소 혼합 3 μL를 추가합니다. </li><li> ° C 1 시간을 회전 또는 37 샘플을 흔들. </li><li> 1 분 4,000 rpm으로 centrifuging하여 PBS 배와 샘플을 씻으십시오. </li><li> PBS 300 μL에 Resuspend. </li></ol> 4. 전체 혈액에서 T - 세포를 수확 <ol><li> 전체 혈액을 (신선한) 구합니다. </li><li> 따뜻한 피, PBS + 2% 태아 소 혈청 (FBS) 및 실온에 histopaque. </li><li> 전체 혈액의 50 μL / ML에서 RosetteSep 인간의 CD4 + T 세포 농축 칵테일을 추가합니다. </li><li> 샘플을 회전하고 실온에서 20 분 동안 품어. </li><li> PBS + 2퍼센트 FBS의 동일한 볼륨 샘플을 희석하고 부드럽게 섞는다. </li><li> 레이어 혼합 최소화 histopaque 위에 샘플을 희석 </li><li> 브레이크 해제와 함께 실온에서 1,200 XG에서 20 분 동안 원심 분리기. </li><li> 강화 세포를 제거합니다. </li><li> PBS + 2퍼센트 FBS 솔루션으로 2 배 강화 세포를 씻으십시오. </li><li> 적혈구 세포 lysing 버퍼 2 분 동안 적혈구를 Lyse </li><li> 5 분 PBS + 2퍼센트 FBS와 1,500 rpm으로 원심 분리기 lysed 적혈구 10 ML 추가 </li><li> 펠렛을 방해하지 않도록주의, 뜨는 기음 </li><li> 10% 태아 소 혈청을 포함 IMDM 미디어에 Resuspend </li></ol> 5. 챔버 슬라이드로 RAW 264.7 macrophages의 준비 <ol><li> DMEM (Dulbecco의 수정 이글의 매체) 10 % FBS, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신,, 1 % L - 글루타민을 포함 준비. </li><li> 따뜻한 목욕에서 37로 따뜻한 미디어, 트립신, 그리고 PBS ° C. </li><li> PBS로 플레이트 2X 와시 </li><li> 각 씻어 사이의 PBS를 대기음. </li><li> (10cm 조직 문화 접시) 표면을 커버하기 위해 판 5 ML의 트립신을 추가합니다. </li><li> 37 5 분 품어 ° C. </li><li> 천천히 강판 표면의 세포를 분리하기 위해 접시의 측면을 노크. 접시 이외의 트립신을 시작하지 않도록주의하십시오. </li><li> 5 ML 또는 트립신 미디어의 상당 금액을 추가합니다. </li><li> 반응 관에 혼합 대기음. </li><li> 3 분 1,000 XG에 원심 분리기. </li><li> 기음 미디어, 펠렛을 방해하지 않도록주의하십시오. </li><li> 미디어 10 ML에 Resuspend. </li><li> 챔버 슬라이드의 각 회의소 미디어 400 μL를 추가합니다. </li><li> 각 챔버에 세포 현탁액의 5 μL를 추가합니다. </li><li> 37 인큐베이터에서 하룻밤 성장 ° C 5% CO 2. </li></ol> 6. 샘플로 병원균의 추가 <ol><li> 관심 분류 병원균의 Pipet 5-10 μL (단계 1-3에서) 챔버로. </li><li> 준수 macrophages 방해하는 챔버의 바닥을 만지​​지 않도록 조심하고 아래로 pipeting에 의해 철저히 섞는다. </li></ol> 7. 디스크 공촛점 현미경을 회전에 샘플을로드하면 (비디오, 구성 요소를 통해 스캔) <ol><li> 디스크 공촛점 현미경을 회전하기 위해 모든 구성 요소를 켭니다. </li><li> DIC 이미징에 대한 현미경을 맞춥니다. </li><li> 인큐베이터에서 챔버 슬라이드를 제거합니다. </li><li> 전문 단계로 챔버 슬라이드를 삽입합니다. </li><li> 챔버 슬라이드 위로 (DIC 이미징에 필요한)를 제거합니다. </li></ol> 8. 광학 트래핑을위한 준비 (비디오, 구성 요소를 통해 스캔 방법은 현미경으로 통합) <ol><li> 광학 함정에 셔터를 켭니다. </li><li> IR 레이저를 켜십시오. </li><li> 광학 트랩을 열고 셔터 (레이저에서). </li><li> IR 레이저 앞에서 셔터를 확인은 IR 카드를 선택하여 닫힙니다. </li></ol> 9. 광학 트랩과 함께 선택과 병원균의 조작 <ol><li> 준수 슬라이드에 macrophages에 중점을두고 있습니다. </li><li> macrophages에 인접한 용액에 자유롭게 변동 병원체를 찾습니다. </li><li> 병원체는 트랩의 주변에 그러한 단계로 이동합니다. </li><li> 셔터를 열고 함정을 갖습니다. </li><li> 정지 함정과 접촉에 macrophages을 제공할 샘플을 이동페드 병원체. </li><li> DIC, 형광, 또는 두 가지 모두의 조합하거나, 디스크 공촛점 현미경을 회전과 이미지. 일반적으로, 트래핑은 DIC에 완료하고, 실시간 영상은 형광하여 이루어집니다. </li></ol> 10. 대표 결과 : 생체내의 및 체외 환경에서 병원균과 구슬의 전체 공간과 시간적 컨트롤을 발휘하기 위해, 우리는 회전하는 디스크 공촛점 현미경 (개략도는 그림에 표시됩니다. 1)에 통합되어 사용자 정의 - 기본 트래핑 장치를 설계. 풀 가동, 레이저 전원이 350 MW를 제공하고 광학 트랩 장치의 다양한 광학 구성 요소로 빛을 결합 후, 같은 전력 측정기로 측정 TIRF 목표에 전력 ~ 80 MW는, 트랩을 형성하는 데 사용된 챔버 인치 트래핑 레이저로 고정 갇힌 개체를 누른 상태에서 개체에 갇힌 상대 챔버에서 개체를 위치하기 위해서는, 무대가 이동되었습니다. 무대는 갇힌 입자에 드래그 힘이 최대 트래핑 포스를 초과하지 않았 있도록, 속도가 느린 정도 판매율에서 이동되었습니다. C. albicans 별도의 인구 (전형적인 크기 - ~ 5 μm의)는 여러 형광 채널 영상을 보여주는 세 가지 색상 각각 (AF488, AF568, 그리고 AF647, 초록, 파랑, 대응 및 그림 빨강, 각각)와 라벨이 붙지만 동시에 광학 병원체를 막고있는 동안. 하나의 C. 회색 화살표로 표시로 albicans는에도 붐비는 환경에서 운영자가 선택한 하나의 병원체의 특정 위치 (그림 2A)을 캡처하여 조작할 수있는 능력을 보여주는, 다른 효모의 클러스터를 통해 사각형 패턴에 갇혀 및 이동되었습니다 . 추가 병원성 미생물에 의해 전시 여러 가지 형상 morphologies 함정이 시스템의 유연성을 설명하기 위해 광학 트위터도 C를 유지하고 ...을 놓다 수있었습니다 pseudohyphae로 albicans 입자. C. 흰색 화살표로 명시된 및 형광 GFP - LC3 - RAW 세포 (그림 2B) 옆에 위치로 AF647 (적색)으로 표시 albicans는 궤도를 따라 이동했다. C.의 효모 부분 pseudohyphae 같이 붙여으로 albicans가 덫에 걸렸다. 우리는 또한이 특정 세포 라인과 병원균 (그림 3A)와 phagocytosis의 절대 시간 프레임을 분석하기 위해 RAW 마우스 대식 세포 세포 옆에 Aspergillus fumigatus에 위치. 일단 병원균이 세포와 접촉하게, 트랩이 해제되어, 시간 - 저속 영상은 (그림 3B) 이후 세포 사건을 관찰하는 고용됩니다. 광학 트랩도 혈액에서 분리 구슬 (그림 4) 면역 버렸네를 형성하는 T - 세포 위해서는 안티 인 경우에는 3 번 CD에 들어 항체로 코팅 구슬에 인접한 이동 기본 T - 세포를 캡처하는 데 사용되었다, 추가를 보여 다용도 직접 트랩 및 면역 세포를 조작합니다. <img src="/files/ftp_upload/3123/3123fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 결합 광학 트랩 및 방적 디스크 공촛점 현미경 설정의 개요 및 개략도. 트래핑 빔 (보라색), 브라이트 영상 (오렌지), 형광 여기 빔 (적색), 형광 방출 (녹색), 전하 결합 소자 (CCD) 카메라를위한 조명 경로 전자 - 곱하여 요금 결합 장치를 보여주는 악기 레이아웃 (EM - CCD) 카메라, 이색성 거울 (D1 및 D2), 거울 (M1과 M2) 및 렌즈 (L1, L2, L3, L4). 트랩 - 공촛점 현미경 시스템의 다른 모든 구성 요소는 그림에 표시됩니다. <img src="/files/ftp_upload/3123/3123fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. (A)의 형광 이미지 갇혀 C를 조작 albicans. 다른 찬란 - 분류 C.의 분야에 갇힌 찬란 - 라벨 (알렉사 플루어 488 (AF488), 청색) 유기체 albicans (AF568, AF647 초록, 빨간색). 무대는 같은 회색 화살표로 표시 갇혀, 파란색 CA 입자 주위에 이동됩니다. C.의 (B) 빠진 의사 hyphal 형태 GFP - LC3 RAW 셀 옆에 albicans. CA의 찬란 분류 psuedohyphal 양식 (빨강, AF647) 광학 갇혀 GFP - LC3에 인접한 이동은 RAW macrophages을 표명했다. 흰색 화살표로 CA의 유기체가 궤도를 따라 이동합니다. <img src="/files/ftp_upload/3123/3123fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 트래핑과 A.의 위치 phagocytic RAW 셀 옆에 fumigatus. 갇혀 A.의 (A) 브라이트 이미지 fumigatus,처럼 빨간색 화살표로 표시된 경로를 따라 이동과 위치, 흰색 화살표로 표시. 갇혀있는 병원체는 초점 약간 약간 초점 평면 위의 유기체를 밀어 트랩에 의한 것입니다. 답변 그것이 원하는 RAW 세포에 인접한 위치까지 fumigatus가 이동합니다. (B) 독감A.의 phagocytosis의 orescence 이미징 RAW 세포에 의해 fumigatus. 함정 병원체가 RAW 세포 옆에 배치되면 phagocytosis 프로세스가 활성화됩니다. 30 S에서 RAW 세포의 막이 입자 주위 한잔을 변경하고 형성하기 시작합니다. 60 S에서는 컵 완전히 형성된다. 90 년대부터 150s, A.로 fumigatus가 가득 채우고 있으며, 180 S에 의해 입자가 완전히 internalized입니다 <img src="/files/ftp_upload/3123/3123fig4.jpg" alt="그림 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> 그림 4. 안티 인 경우에는 3 번 CD에 들어있는 구슬 항체 코팅 옆에 위치로 광학 트랩 감동 T - 세포 기본의 기본 T - 세포 안티 인 경우에는 3 번 CD에 들어 코팅 구슬로 버렸네를 형성합니다. DIC 이미지 트래핑. 세포 그런 다음 이미지에 쉽게 분별 수없는 면역 버렸네를 형성한다.

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<li>Lin, S. J., Schranz, J., Teutsch, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspergillosis+case-fatality+rate%3A+Systematic+review+of+the+literature%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis.%22%5BJournal%5D)">Aspergillosis case-fatality rate: Systematic review of the literature.</a> Clin Infect Dis.. 32, 358-366 (2001).</li>
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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

5 μm의 -이 작품에서 우리는 3 μm의 사이의 크기와 병원균을 캡처하는 광학 트랩을 사용합니다. 저희 연구실에 관심이 병원균은 일반적으로 이러한 차원을 가지고 있지만, 여기에 설명된 광​​학 트위터 시스템은 크기의 큰 범위를 함정에 융통성이 있습니다. 사실 광학 트랩은 단일 원자의 직경 약 10 μm의 세포에 이르기까지 입자를 캡처하는 데 사용되었습니다. 원형, 타원형, 그리고 생물 학적 병원균과 함께 작업할 때 유용합니다 매우 길쭉한 입자 : 또한,이 광학 트래핑 시스템은 다양한 형태의 입자를 포착 수있었습니다. 이 방법, phagocytosis와 버렸네 형성과 함께, 실시간으로 조사되었고, 세포 표면에 구조적 변화 분석했다. 셀 옆에 위치 입자에 의해, 살아있는 병원균은 제어 및 phagocytic 기계를 활성화하고 살아있는 세포의 면역 반응을 연구하고 phagocytosis의 전체 과정을 통해 이벤트의 절대 시작을 모니터하고 조작했다. 그 결과, phagocytic ...

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 (옵션) </th></tr><tr><td> A. fumigatus </td><td></td><td></td><td> 알비노 변형, B-5​​233/RGD12-8, KJ 권 - 정, NIH에서 선물 </td></tr><tr><td> C. albicans </td><td></td><td></td><td> SSY50 - B 돌연변이, 엘레 프 테 리오스 Mylonakis, MGH에서 선물, SC5314 변형, 제랄드 핑크의 선물, 화이트 헤드 연구소 </td></tr><tr><td> 알렉사 플루어 488 </td><td> Invitrogen </td><td> A20000 </td><td></td></tr><tr><td> 알렉사 플루어 647 </td><td> Invitrogen </td><td> A20006 </td><td></td></tr><tr><td> dimethylformamide </td><td> 시그마 </td><td> D4551 </td><td></td></tr><tr><td> 신선한 혈액 </td><td></td><td></td><td> RJW 히스, MGH, HMS의 선물 </td></tr><tr><td> 니콘 거꾸로 현미경 </td><td> 니콘 </td><td></td><td> 모델 티 - E </td></tr><tr><td> 트래핑 레이저, ChromaLase </td><td> 블루 스카이 연구 </td><td> 클라스 - 106 - STF02 - 02 </td><td></td></tr><tr><td> 형광 여기 레이저 </td><td> 응집 성의 </td><td></td><td> 모델 이노바 70C </td></tr><tr><td> 트래핑 구성 요소에 대한 Breadboards </td><td> Thorlabs </td><td> MB1224, MB1218 </td><td></td></tr><tr><td> 광학 공기 테이블 </td><td> 기술 매뉴펙쳐링 코퍼레이션 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 페달 제어 전자 셔터 </td><td> Uniblitz </td><td></td><td> 빈센트 어소, 로체스터, NY에서 구입한 </td></tr><tr><td> Singlemode 광섬유 </td><td> 오즈 광학 </td><td> PMJ - 3S3S - 1064-6 </td><td></td></tr><tr><td> 섬유 포지셔너 </td><td> Thorlabs </td><td> PAF - X - 5 - C </td><td></td></tr><tr><td> 섬유 콜리 메 이터 </td><td> 오즈 광학 </td><td> HPUCO - 23-1064 - P - 25AC </td><td></td></tr><tr><td> 망원경에 대한 렌즈 </td><td> Thorlabs </td><td> AC254 - 150 - B </td><td> 150mm의 초점 거리 </td></tr><tr><td> 번역 단계 (X, Y, Z) </td><td> 뉴 포트 </td><td> M - 461 - XYZ </td><td></td></tr><tr><td> IR 이색성 거울 </td><td> 채도 </td><td> ET750 - SP - 2p8 </td><td></td></tr><tr><td> 목표 렌즈 (100X) </td><td> 니콘 </td><td></td><td> NA = 1.49, 기름 침지, TIRF 목표 </td></tr><tr><td> 공촛점 머리 </td><td> 요코 </td><td> CSU - XI </td><td></td></tr><tr><td> 편광판 </td><td> 니콘 </td><td> MEN51941 </td><td></td></tr><tr><td> 월라스튼 프리즘 </td><td> 니콘 </td><td> MBH76190 </td><td></td></tr><tr><td> EM - CCD 카메라 </td><td> 하마 마츠 </td><td> C9100 - 13 </td><td></td></tr><tr><td> CCD 카메라 (오르카 ER) </td><td> 하마 마츠 </td><td> C4742 - 80 - 12AG </td><td></td></tr><tr><td> 필터 휠 </td><td> Ludl </td><td> 99A353 </td><td></td></tr><tr><td> 필터 휠 </td><td> 서터 </td><td> LB10 - NWE </td><td></td></tr><tr><td> Chambered coverglass </td><td> Lab-Tek/Nunc </td><td> 155409 </td><td></td></tr><tr><td> Dynabeads </td><td> Invitrogen </td><td> 111 - 51D </td><td> 안티 인 경우에는 3 번 CD와 코팅 </td></tr><tr><td> Dulbecco의 수정된 이글 배지 (DMEM) </td><td> Invitrogen / Gibco </td><td> 10,313 </td><td></td></tr><tr><td> 페니실린 / 스트렙토 마이신 </td><td> Invitrogen / Gibco </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> L - 글루타민 </td><td> Invitrogen / Gibco </td><td> 25030-081 </td><td></td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 (HyClone) </td><td> ThermoScientific </td><td> SH30071.03 </td><td></td></tr></tbody></table>

동적 라이브 셀 이미징에 대한 호스트 병원체 상호 작용 연구를위한 광학 트랩의 사용

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

동적 라이브 셀 이미징은 면역 체계 1, 2 셀 사이의 실시간 상호 작용의 직접적인 시각화를 허용하지만, phagocytic 세포와 미생물 사이의 공간 및 시간적 통제의 부족은 병원균에 호스트 응답의 초기 상호 작용에 관찰 초점을 맞추고 렌더링이 어려운. 역사적으로, 이러한 phagocytosis 3와 같은 세포 연락처 이벤트는 두 세포 유형을 혼합하여 몇 군데있다, 그리고 지속적으로 상호 작용의 적절한 단계에서 serendipitous 세포 연락처를 찾을 수있는 필드의 전망을 검사합니다. 이러한 이벤트의 확률적 특성은 지루한이 프로세스를 렌더링하고,이 접근법에 의해 세포 - 세포 접촉 초기 또는 덧없는 이벤트를 관찰하기가 어렵습니다. 이 방법은 접촉의 가장자리에있는 셀 쌍을 발견하고, 그들은 완전의 연락처까지 그들을 관찰 필요하거나하지 않습니다. 이러한 한계를 해결하기 위해, 우리는 문화의 세포를 위치로 비침습, 비 - 파괴적인, 그러나 신속하고 효과적인 방법으로 광학 트래핑을 사용합니다. 광학 트랩, 혹은 광학 핀셋은 점점 삼차원 4 셀 및 기타 마이크론 크기의 입자를 캡처하고 육체적으로 조작하는 생물 학적 연구에 활용하고 있습니다. 방사선 압력 먼저 관찰 1970 년 5, 6의 광학 트위터 시스템에 적용하고, 첫번째 1987 7 생물 학적 표본을 제어하는 데 사용였습니다. 이후, 광학 핀셋은 생물학적인 현상 8-13 다양한 탐사하는 기술로 성숙했습니다. 우리는 진보로 결정 호스트 세포와 상호 작용을 촉진하는 생리적 환경에서 병원성 생물의 아름다운 공간과 시간적 제어를 제공하기 위해 온도 및 습도 제어 디스크 공촛점 현미경을 회전과 함께 광학 트랩을 통합하여 세포 이미징을 살고 방법 14 설명 연산자. 라이브, immunocompromised 개인 15, 16 (예 : AIDS, 화학 요법 및 장기 이식 환자)에서 잠재적으로 치명적인, 침략 감염을 일으킬 수 캔디다 albicans와 Aspergillus fumigatus, 같은 병원성 미생물은 광학에 인접한 비파괴 레이저 농도를 사용하여 갇혀 이동되었습니다 병원체를 phagocytose 수 macrophages. 고해상도는 빛과 형광 기반의 동영상을 전송 살아있는 세포의 phagocytosis의 초기 이벤트를 관찰할 수있는 능력을 만들었습니다. 면역학의 광범위한 적용을 설명하기 위해, 기본 T - 세포는 또한 갇혀 있단에 반대 인 경우에는 3 번 CD에 들어 코팅 microspheres와 시냅스를 형성 조작 및 버렸네 형성의 시간 저속 영상도 얻은되었습니다. 면역 세포에 관하여 사는 병원균의 훌륭한 공간적 제어를 발휘하는 방법을 제공함으로써, 세포의 상호 작용은 세포에 최소한의 섭동과 형광 현미경에 의해 캡처 수 있으며, 타고난과 적응 면역 반응의 초기에 강력한 통찰력을 얻을 수 있습니다.

방법을 개별적으로 선택 조작 설명 및 이미지 라이브 병원균은 회전 디스크 현미경을 결합 광학 트랩을 사용하고 있습니다. 광학 트랩은 생물의 공간적 시간적 및 제어를 제공하며, 호스트 세포에 인접 장소. 형광 현미경은 세포에 최소한의 섭동와 역동적인 세포 상호 작용을 캡처합니다.

동적 살아있는 세포 이미징(Dynamic live cell imaging)을 통해 면역 체계 세포 간의 실시간 상호작용을 직접 시각화할 수 있으나, 공간적 및 ...

다음 실험의 전반적인 목적은 광학 트래핑과 회전 디스크 공초점 현미경을 결합하여 숙주-병원체 상호작용을 실시간으로 관찰하는 것입니다. 이는 먼저 챔버 커버 글라스에 관심 대상인 병원체를 첨가함으로써 이루어집니다. 그다음, 입자를 선택하여 광학 트랩으로 포착합니다.마지막으로, 입자를 관심 세포로 유도합니다. 여기에서 보는 바와 같이, 광학 트래핑은 세포 내 동적 상호작용 관찰을 위해 두 개의 입자를 제어하는 효과적인 방법이 될 수 있습니다.이 방법은 감염성 질환 및 면역학 분야에서 숙주-병원체 상호작용에 관한 중요한 질문들에 답할 수 있으며, 여기에는 숙주 세포와 병원체 간의 공간적 관계를 완전히 제어했을 때 phagocytosis에 미치는 영향과, phagocytic 세포에 의해 섭취되는 병원체의 순서가 phagosomal 성숙에 영향을 미치는지 여부 등이 포함됩니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 사용자는 세포 및 비드 유형에 따라 트래핑 조건을 최적화해야 하므로 어려움을 겪을 수 있습니다. spinning disc를 설정하고 통합하는 과정이 필요하므로, 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다.모든 광학 부품에 정밀한 정렬이 필요하기 때문에 광학 트랩(optical trap)에 공초점(confocal)을 맞추는 개념을 이해하기는 어렵습니다. 관심 대상인 병원균을 수집합니다. 예를 들어, 여기서는 배지에서 하룻밤 동안 배양한 Canada albicans 300 µL를 배양액에서 제거하여 1.5 mL 반응 튜브로 옮깁니다.그런 다음 병원균을 상온에서 약 1300 Gs로 5분 동안 세 번 세척하며, 매회 상층액을 흡입하여 제거하고 펠렛을 그대로 둔 상태에서 재현탁용 PBS를 넣고 초음파 처리합니다. 세 번째 세척 후, 펠렛을 500 µL의 PBS에 재현탁합니다. 다음으로, dye of entrust 1 mg을 100 µL의 dimethylformamide에 녹여 최종 농도를 10 mg/mL로 조절합니다.그런 다음 세척된 병원균이 들어 있는 반응 튜브에 염료 혼합물 3 µL를 추가합니다. 염료는 빛에 민감하므로 튜브 주변을 알루미늄 호일로 감싸고, 37 °C에서 1시간 동안 샘플을 흔들어 섞어준 뒤, 이전과 동일하게 PBS로 샘플을 3회 원심 분리하여 침전시키고 세척합니다. 마지막 세척 후 침전물을 300 µL의 PBS에 다시 현탁합니다.워터배스에서 배지 trypsin과 PVS를 37 °C로 가온합니다. RAW 264.7 대식세포가 코팅된 10 cm 조직 배양 플레이트를 PBS로 2회 세척하며, 각 세척 단계 사이에 PBS를 흡입하여 제거합니다. 그다음, 플레이트 표면을 5 mL의 trypsin으로 덮고 37 °C에서 5분 동안 배양합니다.그런 다음 플레이트 측면을 가볍게 두드려 세포를 플레이트 표면에서 분리합니다. 이때 트립신이 플레이트 외부로 튀지 않도록 주의하십시오. 이제 플레이트에 5 mL의 배지를 넣고 혼합물을 반응 튜브로 옮깁니다.펠렛을 형성한 후, 펠렛이 흐트러지지 않도록 주의하며 배지를 흡입하여 제거하고 10 mL의 배지에 펠렛을 재현탁합니다. 챔버 슬라이드의 각 챔버에 400 µL의 배지를 넣은 다음, 각 챔버에 5 µL의 세포 현탁액을 첨가합니다. 세포를 37 °C, 5% CO2 조건의 인큐베이터에서 하룻밤 동안 배양합니다.인큐베이터에서 챔버 슬라이드를 꺼내어, 이전에 준비한 형광 표지된 표적 병원체를 대식세포가 들어 있는 각 챔버에 5~10 µL씩 피펫팅합니다. 챔버 바닥에 닿아 부착된 대식세포가 떨어지지 않도록 주의하며, 피펫팅으로 대식세포와 병원체를 충분히 혼합합니다. 스피닝 디스크 공초점 현미경의 모든 구성 장치를 켭니다.오일 침수 대물렌즈에 오일을 추가하여 현미경을 준비합니다. 챔버 슬라이드를 전용 스테이지에 삽입한 다음, 챔버 슬라이드의 상단을 제거하고 DIC 이미징을 위해 현미경을 정렬합니다. 광학 트랩 셔터와 IR 레이저를 켭니다.그런 다음 광학 트랩으로 향하는 레이저의 셔터를 엽니다. IR 카드를 사용하여 IR 레이저 앞의 셔터가 닫혀 있는지 확인하십시오. 이제 부착된 슬라이드 위의 대식세포에 초점을 맞춥니다.그런 다음 대식세포 인근의 용액 속에 자유롭게 떠다니는 병원균을 찾습니다. 이 과정에서 가장 어려운 부분은 시료 챔버 내의 물체와 커버 글라스 사이의 부착력으로 인해 시료 챔버에서 추적할 적절한 물체를 찾는 것입니다. 해당 물체를 이동시키려면 트래핑 레이저가 물체를 잡고 있는 동안 스테이지를 이동시켜야 하며, 스테이지의 항력이 트랩의 최대 포획력을 초과하지 않도록 충분히 느린 속도로 스테이지를 이동시켜야 한다는 점에 유의하는 것이 중요합니다.병원체가 트랩 근처에 오도록 스테이지를 이동합니다. 그런 다음 셔터를 열고 트랩을 작동시킵니다. 샘플을 이동시켜 대식세포가 고정된 트랩 내의 병원체 이미지와 접촉하게 합니다.회전 디스크 공초점 현미경의 DIC 형광 또는 두 방식의 조합을 사용하여, 일반적으로 크기가 약 5 µm인 *C. albicans*의 별개 군집들을 각각 녹색, 청색, 적색으로 표지했습니다. 이미징 능력을 보여주기 위해, 회색 화살표로 표시된 바와 같이 단일 *C. albicans*를 포획하여 다른 효모 군집 사이에서 사각형 패턴으로 이동시켰으며, 이는 밀집된 환경에서도 연산자가 선택한 특정 병원균의 위치를 포착하고 조작할 수 있음을 보여줍니다. 이 시스템이 병원성 미생물이 나타내는 다양한 형태학적 모양을 포획하는 유연성을 가지고 있음을 추가로 보여주기 위해, 광학 집게를 사용하여 가성 균사를 가진 *C. albicans* 입자를 고정하고 배치했습니다.C albicans는 적색 염료로 염색되었으며, 흰색 화살표로 표시된 궤적을 따라 이동하여 녹색의 형광 GFPL C3 원시 세포 옆에 배치되었습니다. albicans의 효모 부분이 가성균사가 뒤따라오면서 포획되었습니다.이 특정 세포주와 병원체 간의 식세포 작용의 절대적인 시간 프레임을 분석하기 위해 Aspergillus fumigatus를 생쥐 대식세포 옆에 배치했습니다. 이 그림의 명시야 이미지에서는 흰색 화살표로 표시된 포획된 aspergillus가 빨간색 화살표로 표시된 경로를 따라 어떻게 이동하고 배치되었는지 보여줍니다. 포획된 병원체는 트랩이 유기체를 초점 평면보다 약간 위로 밀어 올렸기 때문에 초점이 약간 맞지 않는 상태입니다.Aspergillus를 원하는 생세포 옆에 배치될 때까지 이동시켰습니다. 병원균이 세포와 접촉하자 트랩을 껐습니다. 이후 식세포 작용 과정이 활성화되었으며, 타임랩스 이미징을 통해 이어지는 세포 내 사건들을 관찰하였습니다.30초에 생세포의 막이 변화하기 시작하며 입자 주변으로 컵 모양의 구조를 형성했습니다. 60초에 컵 모양이 완전히 형성되었습니다. 90초부터 150초까지 Afu Gotti가 입자를 감싸 안았으며, 180초에 입자가 완전히 내부로 섭취되었습니다.이 영상을 시청한 후, 회전 디스크 광학 트랩 장치를 제작하는 방법과 이러한 장치를 통해 생세포 이미징을 위해 병원균을 비침습적으로 제어하는 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 기술은 숙주-병원균 상호작용 분야의 연구자들이 숙주 세포와 병원균 간의 공간적 관계의 역할 및 그것이 이후의 면역 반응에 미치는 영향을 조사할 수 있는 길을 열어주었습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이러한 세포 마이 그 레이션으로 세포 프로세스 전통적으로 2 차원, 딱딱한 플라스틱 표면에 연구하고 있습니다. 이 보고서는 직접 단백질 지방화를 시각화하고보다 생리학 관련, 3 차원 매트릭스에서 마이 그 레이션 세포의 단백질 역학을 분석하는 기술을 설명합니다.

3 차원 매트릭스에서 찬란 태그가 추가된 단백질을 표현 마이 그 레이션 전지의 라이브 세포 이미징

여기에 설명 된 시스템은 여러 개의 트랩을 생성하고 조작 할 수있는 기존의 광학 트랩뿐만 아니라 독립적 인 홀로그램 광학 트래핑 라인을 사용합니다. 또한 생물 효소의 활동을 동시에 고속, 고해상도 측정을 허용하는 동안이 굴절 입자의 복잡한 기하학적 배열을 만들 수 있습니다.

기존 및 홀로 그래픽 광학 트래핑 기능과 고해상도 현미경의 구조

alphaherpes 바이러스 감염의 라이브 셀 이미징 직접 수송 및 간 스프레드의 동적 이벤트 분석을 할 수 있습니다. 여기, 우리는 차 신경의 감염시 바이러스 어셈블리의 시각화를 촉진하기 위해 형광 융합 단백질을 발현하는 재조합 바이러스의 변종을 활용 방법론을 제시한다.

Alphaherpes 바이러스 선행 성 전송 및 확산의 라이브 셀 이미징

여기에서 우리는이 광학적으로 포획 된 마이크로 스피어 사이 일시 중지 하나의 DNA 분자와 상호 작용하는 하나의 형광 표지 단백질 분자를 검출하기위한 장비 및 방법에 대해 설명합니다.

단백질-DNA 상호 작용의 연구에 대한 단일 분자 조작 및 이미지를 결합

선물이 빛 시트 현미경을 초파리 태아에 구슬 없이 셀 역학을 구현 결합 광학 족집게의 설치.

초파리 배아에 구슬 없는 광학 핀셋으로 셀 역학 조사

우리는 거꾸로 회전 디스크 공초점 현미경 검사법에 의해 뮤린 소장의 내장 영상을 사용하여 GFP 표지된 γδ IELs를 구상하는 방법을 기술합니다. 이 기술은 최대 4 시간 동안 점막 내의 살아있는 세포의 추적을 가능하게하고 장 내 면역 상피 상호 작용의 다양한 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

뮤린 소장에서 상피 내 림프구의 활력 영상

이 살아있는 세균성 세포 화상 진찰 프로토콜은 시간이 지남에 따라 단세포 수준에서 다중 세균성 종 사이 상호 작용의 시각화를 허용합니다. 시간 경과 화상 진찰은 개별 세포 운동성 및 생존성을 포함하여 다종 세균성 지역 사회에서 종 간 상호 작용을 심문하기 위하여 단배문화 또는 공동 문화에서 각 세균성 종의 관찰을 허용합니다.

단세포 종 간 세균성 상호 작용의 운동 시각화

여기서, 우리는 광학 트랩에 의한 직접 힘 측정을 통해 3차원 감금에서 격리된 배아 제브라피쉬 세포의 세포내 기계적 특성을 조사하는 프로토콜을 제시한다.

광학 핀셋을 사용하여 감금된 세포 전 역학의 직접 힘 측정

시험관 내에서 액토미오신 다발의 형성 및 광학 핀셋을 사용한 미오신 앙상블 힘 생성 측정이 제시되고 논의됩니다.

광학 핀셋을 사용하여 액틴 필라멘트 번들에서 미오신 앙상블 역학 조사

미세 유체 챔버를 통해 연구 된 시각적 단일 분자 생화학은 유리 배럴, 기밀 주사기, 튜브와 플로우 셀의 안정적인 연결 및 주사기와 튜브 사이에 스위칭 밸브를 배치하여 기포 제거를 사용하여 크게 촉진됩니다. 이 프로토콜은 DNA 거래 및 분자간 상호 작용의 시각화를 가능하게 하는 이중 광학 트랩을 설명합니다.

단일 분자 연구를 위한 이중 광학 핀셋 및 미세 유체 공학 사용

배우세요 광학 트랩과 회전 디스크 공초점 현미경을 활용한 실시간 숙주 병원체 상호작용 관찰 기법을 통해 세포 내 동적 과정을 최소한의 간섭으로 연구하는 방법을 익히세요.

동적 라이브 셀 이미징에 대한 호스트 병원체 상호 작용 연구를위한 광학 트랩의 사용

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