동적 라이브 셀 이미징에 대한 호스트 병원체 상호 작용 연구를위한 광학 트랩의 사용

다음 실험의 전반적인 목표는 회전 디스크 컨포칼 현미경과 결합된 광학 트래핑을 사용하여 숙주 병원체 상호 작용을 실시간으로 관찰하는 것입니다. 이것은 먼저 챔버 커버 유리에 관심 병원체를 추가함으로써 달성됩니다. 다음으로, 입자를 선택하고 광학 트랩으로 캡처합니다.

마지막으로, 입자는 관심 세포로 향합니다. 여기에서 볼 수 있듯이. 광학 트래핑은 세포 내 동적 상호 작용을 관찰하기 위해 두 입자를 제어하는 효과적인 방법이 될 수 있습니다.

이 방법은 숙주 세포와 병원체 사이의 공간적 관계를 완전히 제어할 때 식세포작용에 미치는 영향은 무엇인지, 식세포세포가 흡수하는 병원체의 순서가 pha somal 성숙에 영향을 미치는지 여부를 포함하여 감염성 질환 및 면역학 분야의 숙주 병원체 상호 작용에 대한 중요한 질문에 답할 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 사용하는 개인은 다양한 세포 및 비드 유형에 맞게 트래핑 조건을 최적화해야 하기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. 이 방법의 시각적 시연은 회전하는 디스크를 설정하고 통합하는 프로세스로 매우 중요합니다.

광학 트랩에 대한 공초점은 모든 광학 구성 요소에 필요한 정확한 정렬로 인해 개념화하기 어렵습니다. 관심 병원체를 수확합니다. 예를 들어, 여기에서 육수에서 하룻밤 동안 자란 캐나다 알비칸스 300마이크로리터를 배양물에서 제거하고 병원균을 1.5ml 반응 튜브로 옮깁니다.

그런 다음 실온에서 약 1300Gs로 5분 동안 병원체를 3회 세척하여 상층액을 흡인하고 PBS 및 초음파 처리를 재현탁할 때마다 펠릿을 방해하지 않고 그대로 둡니다. 세 번째 세척 후 resus는 펠릿을 500마이크로리터의 PBS에 현탁시킵니다. 다음으로, 100마이크로리터의 디메틸포름아미드에 엔트러스트의 염료 1밀리그램을 용해시켜 밀리리터당 10밀리그램의 최종 농도를 만듭니다.

그런 다음 세척된 병원체가 들어 있는 반응 튜브에 염료 혼합물 3마이크로리터를 추가합니다. 염료가 빛에 민감하기 때문에 튜브 주위에 호일을 놓고 섭씨 37도에서 1시간 동안 샘플을 흔든 다음 펠릿으로 만들고 이전과 같이 PB S3에서 샘플을 세척합니다. 마지막 세척 후 펠릿을 300마이크로리터의 PBS에 재현탁합니다.

수조에서 섭씨 37도까지 매체 시도와 PVS를 따뜻하게 세척합니다. 원료 2, 6, 4, 0.7 대식세포를 2회 코팅한 10cm 조직 배양 플레이트로, PBS가 세척할 때마다 PBS를 흡인합니다. 다음으로, 플레이트 표면을 5ml의 트립신으로 덮고 섭씨 37도에서 5분 동안 플레이트를 배양합니다.

그런 다음 플레이트 측면을 부드럽게 두드려 플레이트 표면에서 셀을 분리합니다. 트립신이 플레이트 밖으로 튀지 않도록 주의합니다. 이제 플레이트에 5ml의 매체를 추가하고 혼합물을 반응 튜브로 옮깁니다.

펠릿화 후, 세포는 펠릿을 방해하지 않도록 주의하면서 배지를 흡인하고 펠릿을 10ml의 배지에 재현탁합니다. 챔버 슬라이드의 각 챔버에 400마이크로리터의 매체를 추가한 다음 각 챔버에 5마이크로리터의 세포 현탁액을 추가합니다. 세포가 섭씨 37도의 인큐베이터에서 5%CO2로 밤새 자라도록 합니다.

인큐베이터 피펫에서 챔버 슬라이드를 5-10마이크로리터의 이전에 준비된 형광 표지된 관심 병원체를 대식세포의 각 챔버로 회수합니다. 위아래로 피펫팅하여 대식세포와 병원체를 철저히 혼합하되, 챔버 바닥을 만지거나 부착된 대식세포를 방해하지 않도록 주의하십시오. 회전 디스크 컨포칼 현미경의 모든 구성 요소를 켭니다.

오일 이멀젼 대물 렌즈에 오일을 추가하여 현미경을 준비합니다. 챔버 슬라이드를 특수 스테이지에 삽입한 다음 DIC 이미징을 위해 챔버 슬라이드 정렬 현미경의 상단을 제거합니다. 광학 트랩과 IR 레이저의 셔터를 켭니다.

그런 다음 레이저의 셔터를 광학 트랩으로 엽니다. IR 카드로 확인하여 IR 레이저 앞의 셔터가 닫혀 있는지 확인합니다. 이제 부착된 슬라이드의 대식세포에 초점을 맞춥니다.

그런 다음 대식세포에 인접한 용액에서 자유롭게 떠다니는 병원체를 찾으십시오. 이 절차에서 가장 어려운 부분은 시료 챔버의 물체와 커버 유리 사이의 접착력으로 인해 시료 챔버에서 추적할 올바른 물체를 찾는 것입니다. 해당 물체를 이동하려면 물체가 교통 레이저에 의해 유지되는 동안 무대를 이동해야 하며, 무대의 항력이 트랩에 의한 최대 트래핑 힘을 초과하지 않도록 충분히 느린 위치에서 무대를 이동해야 한다는 점에 유의하는 것도 중요합니다.

병원체가 트랩 근처에 있도록 스테이지를 이동합니다. 그런 다음 셔터를 열고 트랩을 작동시킵니다. 샘플을 이동하여 대식세포가 고정된 포획된 병원체 이미지와 접촉

DIC 형광 또는 일반적으로 약 5미크론 크기의 캐나다 알비칸의 두 개별 개체군의 조합에서 회전 디스크 컨포칼 현미경을 사용한 병원체는 녹색, 파란색 및 빨간색으로 표시되었습니다. 이미징을 설명하기 위해 단일 C 알비칸스(albicans)가 갇혀 회색 화살표로 표시된 다른 효모 클러스터를 통해 사각형 패턴으로 이동했으며, 이는 붐비는 환경에서도 작업자가 선택한 단일 병원체의 특정 위치를 포착하고 조작할 수 있는 능력을 보여주었습니다. 이 그림에서 병원성 유기체가 나타내는 다양한 형태를 포착하기 위한 이 시스템의 유연성을 더 자세히 설명하기 위해 광학 핀셋을 사용하여 의사 hyphy로 C albicans 입자를 고정하고 배치했습니다.

C albicans는 빨간색 염료로 표지되고 흰색 화살표로 표시된 궤적을 따라 이동하여 형광 GFPL C3 원시 세포 옆에 배치됩니다. 녹색으로. 알비칸스(albicans)의 효모 부분은 유사 히피(pseudo hyphy)가 따라가면서 갇혔습니다.

Aspergillus fum 여신은 또한 이 특정 세포주와 병원체에 대한 식세포작용의 절대 기간을 분석하기 위해 원시 마우스 대식세포 세포 옆에 배치되었습니다. 이 그림에서 명시야 이미지는 흰색 화살표로 표시된 것처럼 갇힌 아스페르길루스가 어떻게 이동되고 빨간색 화살표로 표시된 경로를 따라 배치되었는지 보여줍니다. 갇힌 병원체는 트랩으로 인해 유기체를 초점면보다 약간 위로 밀어 넣기 때문에 초점에서 약간 벗어납니다.

Aspergillus는 원하는 원시 세포에 인접하게 배치될 때까지 이동시켰습니다. 일단 병원체가 세포와 접촉하면, 트랩이 꺼졌습니다. 식세포작용(phagocytosis) 과정이 활성화되고 타임랩스 이미징(time-lapse imaging)이 사용되어 후속 세포 이벤트를 관찰했습니다.

30초가 지났을 때, 원시 세포의 막이 변하기 시작했고 입자 주위에 컵을 형성하기 시작했습니다. 60초가 되었을 때, 컵이 완전히 형성되었습니다. 90초에서 150초까지 아푸 고티는 변하고 집어삼켜졌고, 180초가 지나면 입자가 완전히 내재화되었습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 회전 디스크 광학 트랩 장치를 만드는 방법과 이러한 장치를 통해 개발 후 라이브 셀 이미징을 위해 병원체를 비침습적으로 제어할 수 있는 방법에 대해 잘 이해하게 될 것입니다. 이 기술은 숙주 병원체 상호 작용 분야의 연구자들이 숙주 세포와 병원체 사이의 공간적 관계의 역할과 그에 따른 면역 반응에 미치는 역할을 조사할 수 있는 길을 열었습니다.