CRISPR/Cas9 Dpy-10 공동 CRISPR 스크리닝 마커 및 조립된 리보뉴클레오단백질 복합체를 사용하여 C. elegans rbm-3.2 유전자의 편집.

이 기술은 짧은 시간 내에 CRISPR/Cas9 게놈 편집을 통해 예쁜꼬마선충에 정확한 돌연변이를 도입하는 데 유용합니다. 이 기술은 Co-CRISPR 마커를 사용하면 긍정적으로 편집된 웜을 식별할 확률이 크게 향상되기 때문에 C.elegans 게놈 편집을 위한 효율적이고 간소화된 방법을 제공합니다. 미세주입을 수행하는 연습을 하고 가능한 한 많은 벌레의 생식선 팔 모두를 주입하여 원하는 편집을 얻을 가능성을 높입니다.

이 절차를 시연하는 사람은 Amy Smith, Mary Bergwell, Danita Mathew, Ellie Smith 및 Carter Dierlam으로, 모두 제 연구실의 학부생입니다. 어린 성충을 주사할 준비를 하려면 L2, L3 단계 예쁜꼬마선충을 MYOB 플레이트의 신선한 박테리아 잔디밭에 놓고 섭씨 20도에서 밤새 플레이트를 배양합니다. 다음 날 아침, 표에 설명된 대로 멸균 뉴클레아제가 없는 튜브에 주입 혼합물을 준비하고 피펫팅으로 혼합합니다.

주입 혼합물을 섭씨 37도에서 15분 동안 배양하여 리보핵단백질 복합체를 조립한 후 원심분리로 혼합물을 회전시킵니다. 다음으로, 해부 현미경을 사용하여 자궁에 배아가 10개 미만인 약 30마리의 젊은 성충을 선택하고 각 벌레의 양쪽 생식선 팔에 팔당 몇 피코리터의 주입 혼합물을 주입합니다. 미세주입 후 회수 장치를 사용하여 주입 패드에서 피펫으로 주입된 벌레를 OP50 E.coli가 파종된 60mm MYOB 플레이트에 부드럽게 입으로 주입합니다.

주입된 벌레가 실온에서 1시간 동안 회복되도록 합니다. 회수 기간이 끝나면 백금 와이어 픽을 사용하여 주입된 각 벌레를 파종된 단일 35mm MYOB 한천 플레이트에 옮기고 벌레가 섭씨 20도에서 알을 낳을 수 있도록 합니다. 24시간 후, 주입된 웜을 새로운 개별 35mm 플레이트로 옮깁니다.

주사 후 3-4일 동안 해부 현미경을 사용하여 동물이 원형 패턴으로 움직일 때 긴 축을 중심으로 회전하는 동물의 몸체에서 알 수 있듯이 롤러 표현형을 나타내는 F1 자손과 동일한 발달 단계에 있는 대조 동물에 비해 더 짧고 튼튼한 생리학에서 알 수 있듯이 덤불같은 표현형을 보이는 플레이트를 식별합니다. 50-100마리의 F1 롤러 웜을 개별 플레이트로 옮기고 지렁이가 하루에서 이틀 동안 알을 낳을 수 있도록 합니다. F2 웜 생산의 1-2 일 후, 번호가 매겨진 플레이트에서 각 단일 F1 롤러 마더를 밀리리터 단백질 분해 효소 K.Freeze 당 20 밀리그램의 1:100 희석으로 보충 된 2.5 마이크로 리터의 용해 버퍼를 포함하는 해당 번호가 매겨진 PCR 튜브로 옮기십시오. 표시된 대로.

주기가 끝나면 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트, DNA 중합효소, 염화마그네슘 및 로딩 염료를 포함하는 2X PCR 혼합물 12.5마이크로리터, 10마이크로몰 전방 프라이머 1마이크로리터, 10마이크로몰 역 프라이머 1마이크로리터 및 반응 혼합물을 용해된 각 웜 샘플당 25마이크로리터로 끌어올리기에 충분한 멸균수를 추가합니다. 그런 다음 표시된 대로 thermocycler에서 샘플을 실행합니다. 길이가 50개 미만인 염기쌍의 편집을 스크리닝하려면 각 PCR 반응의 10마이크로리터를 새 튜브로 옮기고 각 튜브에 5마이크로리터의 제한 분해 마스터 믹스를 추가합니다.

소화 반응을 섭씨 37도에서 2시간 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 섭씨 65도에서 10-15분 배양으로 가열하고 소화를 활성화합니다. 그런 다음 각 튜브의 전체 반응을 1%-2% 아가로스 겔의 단일 웰에 로드하고 적절한 밴드 분리가 달성될 때까지 110밀리암페어에서 겔을 실행합니다.

실행이 끝나면 UV 광선 아래에서 아가로스 겔을 시각화하여 DNA 띠 크기를 검출합니다. 긍정적으로 편집된 웜은 복구 템플릿을 사용한 편집으로 인해 예상되는 크기로 여분의 DNA 밴드를 표시하며, 웜 게놈 내의 원하는 자리에서 제한 부위를 운반합니다. 각각의 긍정적으로 편집된 F1 롤러 웜 플레이트에서 8-12개의 야생형처럼 보이는 비롤링 F2 웜을 선택하고 웜이 알을 낳고 하루에서 이틀 동안 자손을 생산할 수 있도록 합니다.

그런 다음 양성 편집된 웜에 대해 입증된 동형접합 웜 라인을 식별하고 염기서열 분석 소프트웨어를 사용하여 염기서열분석 결과를 분석하여 표준 프로토콜에 따라 편집의 존재를 확인합니다. 여기에서 게놈 DNA와 설계된 CRISPR RNA 및 C.elegans rbm-3.2 유전자에 대한 복구 주형을 관찰할 수 있습니다. 이 대표적인 분석에서 73개의 F1 웜 중 7개가 편집에 긍정적인 것으로 밝혀졌습니다.

편집되지 않은 웜은 EcoRI 분해 시 445 염기쌍의 단일 DNA 단편을 나타낸 반면, rbm-3.2 유전자에서 조기 정지 코돈을 가진 웜은 EcoRI 분해 시 265 및 166 염기쌍에서 두 개의 단편을 나타냈습니다. 이형접합 편집된 웜은 EcoRI 분해 시 3개의 단편을 표시했습니다. 확인된 양성 F1 이형접합자(heterozygote)의 F2 웜 12개 중 6개는 관심 편집을 위해 동형접합적(homozygous)인 것으로 밝혀졌습니다.

그런 다음 식별된 동형접합 편집 웜 라인의 게놈 DNA를 사용하여 DNA 염기서열분석 반응을 설정할 수 있으며, 이를 통해 동형접합 상태에서 편집의 존재를 확인할 수 있습니다. 편집 시약과 스크리닝 프라이머가 올바르게 설계되었는지, 주입 혼합물이 적절하게 준비되었는지 확인하십시오. 정확한 미세주입도 중요합니다.

이러한 절차에 따라, 유전체 편집의 정확성을 검증하기 위해 편집의 표현형 검증(해당되는 경우) 및 유전자 및 단백질 발현 분석을 수행할 수 있습니다.