Name: 펩타이드 기반 매트릭스 샘플을 고정 하는 포 르 말린의 최적의 준비 지원 레이저 탈 착/이온화 질량 분석 이미징 워크플로 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: 학습하세요 포르말린 고정 조직을 레이저 탈착/이온화 질량 분석 이미징용으로 재현 가능하게 준비하는 방법을. 니트로셀룰로스 코팅 슬라이드와 승화 기법을 사용하여 초보자도 신뢰성 있는 워크플로우를 개발할 수 있습니다.

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저자는 Alzheimer의 질병 연구와 PKW에 게 수 여 한 호 발견 그랜트 (DP160102063)에 대 한 그들의 박사 학위 장학금 프로그램을 통해이 작품의 일부 자금에 대 한 시드니 의료 학교 재단 및 파랑 및 재단을 인정 하 고 싶습니다.

주의: 모든 적용 가능한 안전 주의 사항은 따라야 할 적절 한 개인 보호 장비 (PPE) (예: 실험실 코트, 니트 릴 장갑, 안전 안경, 등)의 사용을 포함 하 여이 절차를 수행할 때
1입니다. 시 약 및 장비 준비
<ol><li>
솔루션의 준비
	<ol>
<li>Carnoy의 액체의 500 mL, 혼합 준비 100% 에탄올 (EtOH), 클로 프롬, 및 6에 빙 초 산: 깨끗 한 유리병 쇼트에서에서 3:1 v/v/v 비율.</li>
		<li>액체 니트로 (NC)을 하려면 부드러운 동요 40 mg/mL의 최종 농도에 의해 NC 멤브레인 (일반적으로 서쪽에 게 더 럽 히기에서 사용 되는) 깔끔한 아세톤에 녹.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
NC의 준비 코팅 슬라이드
	<ol>
<li>조직학 시험20 NC 준비 얼룩 혈액의 준비를 위해 사용 하는 것과 비슷한 기술을 사용 하 여 슬라이드 코팅.</li>
		<li>도전성 인듐 주석 산화물 (ITO) 현미경 슬라이드의 한 가장자리에 액체 NC의 40 µ L 플라스틱 일반 유리 현미경 슬라이드를 사용 하 여도 박막 코팅을 만들 슬라이드 표면 장력에서 NC 끌어 합니다.</li>
		<li>NC 20 s와 다음 스토어 실내 온도에 필요할 때까지 실 온에서 건조를 허용 합니다. 이러한 조건 하에서 샘플 저장 수 있습니다 명확한 조직 유지 및 먼지의 무료 제공. 참고:이 방법을 준비로 더 잘 알려진 "박막" 이며 표면 장력 자동 슬라이드에 레벨의 부족 뿐만 아니라 NC의 점성에 의존 하는 균일 한 코팅을 생산할 예정 이다. 유일한 관리 너무 빨리 이동은 슬라이드를 준비 하는 때 수행 해야 하는 완전 한 범위 보다는 NC의 줄무늬를 생성 합니다. 주의: 액체 NC 매우 빠르게 건조, 그것은 제대로 확산 되었습니다 하기 전에 솔루션을 건조 하지 않도록 신속 하 게 작동에 필수적. 한다 또한 주의 그것의 액체 상태에서 NC 처리는 높게 정력적 인 화합물 이며 소이 폭발을 방지 하기 위해 점화의 소스 문의 하지 때. NC는 또한 발열 전환 때 건조 하면 감기 화상 피부 또는 gloved 손을 장기간 접촉을 허용 하는 경우를 겪 습. 모든 관련 된 위험을 최소화 하기 위해 각 시간에만 소량을 준비 (< 1 mL 권장). 일단 건조 실 온에서 안정적입니다. 그러나, NC 폭발 때 대량에 남아 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
사용자 지정 증기 챔버의 창조
	<ol>
<li>한 조각 잘라 두꺼운 압 지의 하단에 맞게 충분히 큰가 위를 표준 플라스틱 페 트리 접시 (94 m m 직경에서 및 두께 3 m m)의 절반.</li>
		<li>센터, 종이 페 트리 접시 (보충 그림 1)에서 위치를 유지할 것 이다 그래야 충분히 초과 떠나 현미경 슬라이드 같은 크기에에서 사각형 스트립을 떠나 종이 잘라.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2입니다. 조직 단면도의 준비
<ol><li>
FFPE 직물21.
	<ol>
<li>원하는 조직 블록 및 그것 12 µ m 두께 표준 벤치 마운트 톰, 플 로트 마운트에는 NC에 미리 이토 슬라이드 코팅 섹션을 선택 합니다.</li>
		<li>2 분, 잔여 파라핀을 제거 하는 신선한 자일 렌에 슬라이드 잠수함 그리고 두 번 작업을 반복. 참고: 경우 파라핀 블록은 특히 보급 또는 조직을 파라핀 블록에 비해 상대적으로 작습니다, 샘플이 크 실 렌에서 세척 전에 대부분 멀리 녹기 60 ° C에 난방 수 있습니다.</li>
		<li>Deparaffinized 샘플 등급된 용 매 시리즈에 슬라이드를 잠수 하 여 세척: 70 %v / v EtOH/물, 100 %EtOH, Carnoy의 액체, 100 %EtOH, 초 순수한 물, 100 %EtOH. 각 침수 기간 30 이어야 한다 s, Carnoy의 액체를 2 분 마지막 해야 합니다 제외. 주의: Carnoy의 유체 및 크 실 렌 저장 고 사용 증기 두건에서 흡입 하는 경우 그들은 매우 독성이 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
포 르 말린 고정 언된 (FFF) 조직 참고: 샘플 한다 이미 동결, 적절 하 게 샘플 유형.<ol>
<li>20 분22에 대 한 톰의 동작 온도에서 조직 블록 equilibrate 참고: 평형 온도 조직의 종류에 따라 달라 집니다.</li>
		<li>섹션 조직 12 µ m 및 해 동 마운트에는 톰을 사용 하 여 미리 준비 된 NC에 섹션 코팅 이토 슬라이드.</li>
		<li>어둠 속에서 벤치에 진공 desiccator에 슬라이드를 저장 합니다. 참고: 샘플은 이러한 조건에서 몇 주 동안 저장할 수 있습니다.</li>
		<li>FFPE 직물 (2.1.3)에 대 한 명시 된 등급된 용 매 시리즈에서 샘플을 씻으십시오. 참고: 거기 아무 필요도 자일 렌 deparaffinisation 단계에 대 한 샘플 포함 되지.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 메 틸 렌 Crosslink 가수분해
<ol><li>20 mmol tris HCl (pH 8.8)와 함께 상단에 가득 플라스틱 슬라이드 상자 (FFF 또는 FFPE) 샘플 슬라이드를 로드 합니다. 상자를 봉인 하 고 하단 터치 상자를 수 있도록 물 500 mL를 포함 하는 물 목욕에. 다음 70 kPa의 운영 압력을 달성할 수 있는 압력 밥 솥에서 120 ° C에서 15 분 동안 그것을 열.</li>
	<li>슬라이드를 제거 하 고 냉각, 하도록 허용 15 분 동안 주위 온도에 말리.</li>
</ol>4. 조직 소화
<ol><li>일단 분해, 조직 단면도의 가장자리에 솔루션의 pipetting 10 µ L에 의해 매우 순수한 물에 10 µ L의 트립 신 솔루션 (1 mg/mL)와 샘플을 코트 다음, 표면 아래 조직의 전체 표면에 걸쳐 있는 물방울을 끌어 동일한 피 펫 팁을 사용 하 여, 긴장입니다. 참고: 피 펫 팁와 확산 조직의 가장자리의 국경 넘어 효소 이상 조직 표면을 긁는 피하십시오.</li>
	<li>샘플 온도에서 건조를 허용 합니다.</li>
	<li>일단 건조, 슬라이드 (보조 그림 2)의 어느 가장자리에 고압 테이프와 이전 생성 된 증기 챔버 (아래로 조직)의 상단 내부 샘플을 탑재 합니다.</li>
	<li>손가락 균등 하 게 젖은 것 같습니다 때까지 100% 이기와 50 m m 염화 중 탄산염의 페 트리 접시의 하단 부분에 압 지 손가락에 신중 하 게 1:1 v/v 혼합을 포함 하는 솔루션의 600 µ L 플라스틱</li>
	<li>증기 챔버의 상반신 절반, 종이 손가락 및 예제 슬라이드를 보장, 완벽 하 게 정렬 하는 하단에 배치와 파라핀 영화와 그것의 적도 주위 챔버 인감.</li>
	<li>완전 한 소화 수 있도록 37 ° C 배양 기에서 샘플을 하룻밤 둡니다.</li>
</ol>5. 매트릭스 코팅 승화를 통해
<ol><li>일단 소화, 무게 5 자리 microanalytical 균형에 샘플 슬라이드.</li>
	<li>승화 기구 냉각 손가락에 슬라이드를 탑재 하 고 증기 챔버 (보충 그림 3)에 설명 된 대로 동일한 방식으로 구리 테이프를 확보. 참고: 슬라이드 냉각 손가락으로 균등 하 게 연결 되도록 구리 테이프의 레이어 레벨 표면 냉각 손가락의 하단에 배치 됩니다. 이렇게 하면 슬라이드 매트릭스의도 증 착에 이르게 냉각 균등 하 게 된다.</li>
	<li>300 밀리 그램 α-cyano-4-hydroxycinnamic 산 (CHCA) 매트릭스의 아래쪽 챔버와 매트릭스 결정의 얇은 층을 만들 수 균등 하 게 확산의 유리 페 트리 접시에 놓습니다.</li>
	<li>sublimator를 조립 하 고 호스 클램프와 함께 두 개의 반쪽을 확보. 쌈을 스탠드에 연결 된 금속 반지에 그것을 배치 하 여 220 ° C에 미리 데워 모래 목욕 위에 조립 단위 15-20 cm를 일시 중단 합니다.</li>
	<li>챔버 진공 소스에 연결, 진공, 참여 하 고 5 분 동안 25 mTorr로 안정 있습니다.</li>
	<li>얼음 위로 냉각 손가락 팩 고 물 50 mL를 추가 합니다. 진행 하기 전에 추가로 5 분 동안 정착 장치를 허용 합니다.</li>
	<li>낮은 보장 완전히 챔버의 하단을 연결 하는 모래는 모래의 표면에 챔버와 0.22 mg/cm2 의 이상적인 코팅을 만드는 데 45 분 동안 그것을 두고합니다 주의: 한다 주의 때 기구에 어떤 손상으로 높은 진공에서 유리를 처리, 철수 하는 동안 유리 챔버의 치명적인 오류가 발생할 수 있습니다.</li>
	<li>45 분 후 금속 링에 올려서 모래 목욕에서 챔버를 제거 하 고 환기 약 실. 참고: 챔버 통풍 되었습니다 일단 슬라이드 제거 해야 합니다 매우 빠르게 공기에 물 동결 손가락 및 샘플 슬라이드에 응축 하기 시작 합니다.</li>
	<li>슬라이드를 제거 하 고 원하는 코팅 달성 되도록 그것을 무게. 참고: 부족 한 코팅, 달성 하는 경우 단순히 반복 승화 과정 슬라이드에 대 한 원하는 코팅 두께 달성.</li>
</ol>6입니다. recrystallization
<ol><li>승화, 일단 기술된 이전 (조직으로 아래로) 이전 생성 된 증기 챔버의 상단 내부 샘플 슬라이드를 탑재 합니다.</li>
	<li>100% 이기와 0.1 %v / v trifluoroacetic 산도 코팅을 보장 하기 위해 페 트리 접시의 하단 부분에 압 지에 신중 하 게 물에서의 1:1 (v/v) 혼합을 포함 하는 솔루션의 600 µ L 플라스틱</li>
	<li>챔버를 조립, 종이 탭 및 현미경 슬라이드 보장, 완벽 하 게 정렬 하 고 1 시간에 대 한 37 ° C 배양 기에서 두고. 주의: 챔버를 밀봉 하지 마십시오. 참고: 일단 박막, 매트릭스의 일반적으로 노란 색조 해야 흰색으로 변경, 덜 환 나타나고 매우도 있습니다. 이 recrystallization 제대로 수행 되었습니다 나타냅니다.</li>
	<li>이 예제는 이제 분석을 위한 준비.</li>
</ol>7입니다. 계측
<ol><li>디지털 이미지를 만드는 평판 스캐너에서 슬라이드를 검사 합니다.</li>
	<li>질량 분석기에는 샘플을 로드 하 고 적절 한 소프트웨어 플랫폼을 사용 하 여 분석.</li>
	<li>750-3500 다 원하는 결과에 적용 되는 자리 해상도 대량 범위와 긍정적인 이온 reflectron 모드에서 샘플을 분석 합니다. 그러나 대부분의 경우, 20-50 µ m 래스터 폭은 충분 하, 10 µ m로 작은 수 사용된15. 주의: MALDI UV 레이저 이온화 방사선의 원천이 되며, 직접 볼 수 없습니다. 레이저 악기 차폐 작업 이전에 포함 되어 있는지 확인 합니다.</li>
</ol>

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<li>Widlak, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+molecular+signatures+of+oral+squamous+cell+carcinoma+and+normal+epithelium+-+application+of+a+novel+methodology+for+unsupervised+segmentation+of+imaging+mass+spectrometry+data%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Detection of molecular signatures of oral squamous cell carcinoma and normal epithelium - application of a novel methodology for unsupervised segmentation of imaging mass spectrometry data.</a> Proteomics. 16 (11-12), 1613-1621 (2016).</li>
</ol>

저자 상충 또는 공개 상업적인 관심 있다

이 프로토콜은 analytes의 delocalization를 제거 하는 동안 ionizable 분자 종의 생성을 극대화 하도록 설계 되었습니다. 매트릭스, 샘플, 소화 또는 승화24; 후 recrystallizing를 적용할 때 동일한 재정의 원리를 사용 하 여 포함 하는 주요 요인 즉, 그의 증기도 증 착 매트릭스 또는 그렇지 않으면, 창조 되 고 유지 필요. Recrystallization와 소화, 균등 하 게 샘플을 아래에 대 한 용 매 세척 pipetting 곳 보다 더 많은 용 매 증기를 받고 개별 영역을 방지 합니다. 이 보이는 응축의 대형을 방지 하기 위한 중요 한 이며 전반적인 delocalization 샘플은 균등 하 게 소화 하 고 박막 뿐만 아니라 표면 분자를 억제. 그것은 절대적으로 너무 작고 상대적으로 낮은 강도 및 종의 다양성을 보여줄 것이 서 행렬의도 증 착을 달성 하 고 또한 강도와 종25의 다양성을 낮추는 샘플에서...

매트릭스 보조 레이저 탈 착/이온화 질량 분석기 (MALDI MSI) 이미징 대 한 2 년간1,2, 생체 등의 범위를 분석 이미지 기반 기술로 고용 되었다: 지질3, 펩 티 드2 ,4, 단백질2,5, 대사6,7, N-glycans8및 치료 약물9,10같은 합성 분자. 이 기술은의 유틸리티를 시연 하는 간행물의 수는 지난 10 년간6,11,,1213이상 크게 성장 했다. 지질, 같은 특정 분자는 MALDI MSI를 통해 분석 하는 그들은 그들의 화학 특성으로 인해 쉽게 이온화 하 고 따라서 필요한 작은 사전 준비3상대적으로 쉽습니다. 그러나, 펩 티 드와 같은 더 어려운 목표를 위해 효과적으로이 분자를 이온화 하는 데 필요한 단계는 일반적으로 복잡 하 고 광범위 한14. 현재 주소로 목표로 또는 재현성이 독특한 비주얼 기법15조직 준비 하 고용 방법론에서을 설명 하는 거의 게시 있다. 이러한 이유로, 우리는 관찰 컴파일되고 최적화 구현 단일으로 구현 하기 쉬운 방법론은 포름알데히드에서 펩 티 드의 분석에 대 한 더 작은 수정 해야 했더라도 조직 소스14.
이 원고에서 우리 검색 및 포 르 말린 고정 언된 (FFF) 및 포 르 말린 고정 파라핀 포함 (FFPE) 조직 섹션에서 생성 된 펩 티 드의 공간 매핑 확인, 저렴 한 비용 재현할 방법론을 설명 했습니다. 이 방법론 필요 또는 어떤 특수 계측3에 의존 하지 않습니다. 특히, 우리; 펩 티 드를 분석 하는 데 필요한 전문된 샘플 준비의 많은 측면을 해결 antigen 검색16 등 매트릭스 코팅 단계. 우리의 프로토콜은 또한 저렴 한 장비 및 시 약, 그렇지 않으면 수 없습니다 대체 로봇 기구17살 하는 더 넓은 지역 사회에 액세스할 수 하이 방법론을 활용 합니다.
수동 샘플 준비 방법 개발 뒤에 추론 했다 두 배: 첫째,는 sublimator 사용 하 여 만듭니다 ~ 1 µ m 길이18, 뭔가 더 일반적인 분사 unachievable는 매트릭스 결정의 일관성과 균일 코팅 기술입니다. 둘째, 비용의 상대적으로 작은 설정: 사용자 정의 장치의 총 비용은 <$ 1500 AUD. 우리는 비용 효율성 측면에서 샘플 당 가격이 훨씬 저렴 관련 없는 로봇 기계 때 주의. 그러나 승화를 사용 하 여 보고 되었습니다 이전,, 우리의 지식 최선을 다 해 준비 하 고이 과정을 설명 하는 단계별 방법론도 보고 되어 하지 문학에서 설명.
이 프로토콜은 연구자는 MALDI 질량 분석기에 대 한 액세스를가지고 누군지 관심19의 바이오 분자에 관하여 공간 정보 생성에 도움을 것입니다. 본질적으로, MALDI MSI 조직학을 심사의 항 체에 의존 하지 않는 또는2얼룩입니다.

<table><tbody><tr><td>Cryo Microtome</td><td>Leica</td><td>CM3050</td><td>조직 준비 및 절편용.</td></tr><tr><td>인듐 주석 산화물 현미경 슬라이드</td><td>Bruker</td><td>8237001</td><td>조직 준비 및 절편용.</td></tr><tr><td>Coplin Jars</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5516</td><td>조직의 준비 및 단면용.</td></tr><tr><td>압력솥</td><td>Kambrook</td><td>KPR620BSS</td><td>준비 및 조직 절단용.</td></tr><tr><td>Sublimator</td><td>Chem Glass</td><td>NA</td><td>승화 절차용. CG-3038과 디자인이 비슷하지만 맞춤 제작되었습니다&nbsp;</td></tr><tr><td>모래 목욕</td><td>NA</td><td>NA</td><td>승화 절차에. 특정 회사가 아닌 외부에서 공급된 접힌 알루미늄 호일에 담긴 고급 강 모래</td></tr>, <tr><td>유리 페트리 접시</td>, <td>시그마 알드리치</td><td>CLS70165100</td><td>승화 절차용.</td></tr><tr><td>진공 펌프</td><td>NA</td><td>NA</td><td>승화 절차용. 오래된 질량 분석기의 예비 부품으로 공급&nbsp;</td></tr><tr><td>콜드 트랩</td><td>화학 유리</td><td>CG-4510-02</td><td>승화 절차용.</td></tr><tr><td>핫 플레이트</td><td>존 모리스</td><td>EW-15956-32.&nbsp;</td><td>승화 절차용.</td></tr><tr><td>플라스틱 페트리 접시</td><td>시그마 Aldrich</td><td>Z717223</td><td>승화 절차용.</td></tr><tr><td>37 &도; C 인큐베이터</td><td>NA</td><td>NA</td><td>승화 절차용. 해당 없음, 인큐베이터는 비멸균이며 30년 이상 되었습니다&nbsp;</td></tr><tr><td>블로팅 페이</td>퍼 <td>Sigma Aldrich</td><td>P7796</td><td>승화 절차용.</td></tr><tr><td>니트로셀룰로오스&nbsp;</td><td>시그마 알드리치</td><td>N8395</td><td>슬라이드 세척용.</td></tr><tr><td>아세톤</td><td>시그마 알드리치</td><td>650501</td><td>슬라이드 세척용.</td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Sigma Aldrich</td><td>214736</td><td>슬라이드 세척용.</td></tr><tr><td>100% EtOH</td><td>시그마 알드리치</td><td>1.02428</td><td>슬라이드 세척용.</td></tr><tr><td>70% EtOH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>NA</td><td>슬라이드 세척용. 95%의 주식 에탄올로 실험실에서 제작&nbsp;</td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>시그마 알드리치</td><td>C2432</td><td>슬라이드 세척용.</td></tr><tr><td>빙하 아세트산</td><td>시그마 알드리치</td><td>ARK2183</td><td>슬라이드 세척용.</td></tr><tr><td>Tris HCL pH 8.8</td><td>Sigma Aldrich</td><td>TRIS-RO</td><td>단백질 분해 절단용. 1M로 만든 분말, 32% HCl로 평형을 이루어 PH 8.8</td></tr><tr><td>Milli Q 초순수</td><td>시그마 Aldrich</td><td>NA</td><td>단백질 분해 절단용. sartorious 정수 시스템</td></tr><tr><td>암모늄 비르카보네이</td>트 <td>시그마 알드리치</td><td>A6141</td>에 의해 집에서 수행되는 정화 <td>단백질 분해 절단을 위해.&nbsp;</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T0303</td><td>단백질 분해 절단용.&nbsp;</td></tr><tr><td>CHCA 매트릭스</td><td>시그마 Aldrich</td><td>C2020</td><td>재결정용.</td></tr><tr><td>아세토니트릴</td><td>시그마 알드리치</td><td>1.00029</td><td>재결정용.</td></tr><tr><td>트리플루오로아세트산(TFA)&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>302031</td><td>재결정용.</td></tr></tbody></table>

펩타이드 기반 매트릭스 샘플을 고정 하는 포 르 말린의 최적의 준비 지원 레이저 탈 착/이온화 질량 분석 이미징 워크플로

Optimal Preparation of Formalin Fixed Samples for Peptide Based Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging Workflows

매트릭스 보조 레이저 탈 착/이온화를 사용 하 여, 질량 분석 이미징 (MALDI MSI) 급속 하 게 확장 했다, 때문에이 기술은 분석 N-glycans에 약물과 지질에서 생체의 호스트. 다양 한 샘플 준비 기술 존재 감지 포름알데히드 보존 조직에서에서 펩 티 드 대량 spectrometric 분석의이 유형에 대 한 가장 어려운 문제 중 하나 남아 있다. 이러한 이유로, 우리 만든 고 최적화 ionizable 펩 티 드의 가장 큰 수를 도출 하는 동안 샘플에 포함 된 공간 정보를 유지 하는 강력한 방법. 우리는 또한 목적 비용 효과적이 고 간단한 방법으로 이것을 달성 함으로써 계측 자동화를 사용 하 여 때 발생할 수 있는 잠재적인 편견 또는 준비 오류를 제거. 최종 결과 저렴 하 고 재현할 수 프로토콜.

정확 하 게 따라 하는 경우이 프로토콜 명확 하 게 어떤 찰 상 또는 다른 변형 (그림 1) 없이 조직의 심한 형태를 나타내는 이미지를 생성 합니다. 올바르게 수행된 샘플 준비를 위한 이상적인 유효성 검사 되는 분자를 변경 하 여 다른 물리적 구조 사이 구별 하는 기능 (그림 2) 볼 이다.
샘플 제대로 준비 된 하지 하는 경우를 결정 하기 위한 좋은 가이드 delocalization 또는 매트릭스 집계;의 존재를 확인 하는 것입니다. 실제 조직의 경계를 넘어 확장 하는 펩 티 드 시그니처는 분자 견본 준비 동안 이동한 완벽 한 지표. 이것은 오 러키와 Padula에 자세히 설명 (2017)15.
<p cla...

이 프로토콜의 포 르 말린 고정 조직을 이미징 질량 분석에 대 한 운명 승화 기반 준비에 대 한 재현 가능 하 고 신뢰할 수 있는 방법을 설명 합니다.

The use of matrix-assisted laser desorption/ionization, mass spectrometry imaging (MALDI MSI) has rapidly expanded, since this technique analyzes a host ...

이 절차의 전반적인 목표는 펩타이드 질량 분석 이미징을 위해 조직 샘플을 재현성 있게 준비하는 것입니다. 이 방법을 사용하면 초보 질량 분석기 사용자가 장시간의 경험적 결정을 거치지 않고도 자체 이미징 질량 분석 워크플로우를 개발할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 재현성이 높고 구현이 간단하며 비용 효율적인 방법론을 사용한다는 것입니다.니트로셀룰로오스 코팅된 슬라이드를 준비하기 위해 전도성 인듐 주석 산화물 현미경 슬라이드의 한쪽 가장자리에 40마이크로리터의 액체 니트로셀룰로오스를 피펫팅합니다. 일반 유리 현미경 슬라이드를 사용하여 슬라이드를 가로질러 표면 장력 하에서 니트로셀룰로오스를 드래그하여 균일한 박막 코팅을 만듭니다. 니트로셀룰로오스를 실온에서 20초 동안 건조시킨 다음 실온에서 필요할 때까지 보관하십시오.다음으로, 표준 플라스틱 페트리 접시의 아래쪽 절반이 들어갈 만큼 충분히 큰 두꺼운 블로팅 페이퍼 조각을 잘라 맞춤형 증기 챔버를 만듭니다. 종이를 잘라 중앙에 현미경 슬라이드와 같은 크기의 직사각형 스트립을 남깁니다. 종이가 페트리 접시에서 그 위치를 유지할 수 있도록 충분한 여분을 남겨 두십시오.FFPE 조직의 경우, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 니트로셀룰로오스 사전 코팅된 ITO 슬라이드에 섹션을 플로트 장착합니다. 슬라이드를 신선한 자일렌에 담그어 2분 동안 잔류 파라핀을 제거합니다. 부피 에탄올 용수 용액에 대한 70% 부피와 100% 에탄올로 구성된 등급이 매겨진 용매 시리즈에 슬라이드를 30초 동안 담궈 파라핀이 제거된 샘플을 세척합니다.그런 다음 슬라이드를 Carnoy의 액체에 2분 동안 담그십시오. 마지막으로 슬라이드를 일련의 100% 에탄올, 초순수 및 100% 에탄올에 다시 30초 동안 담그십시오. 샘플 슬라이드를 20 밀리몰 트리스 HCO로 맨 위까지 채워진 플라스틱 슬라이드 상자에 넣습니다.상자를 밀봉하고 500ml의 물이 담긴 수조에 넣어 상자가 수조 바닥에 닿도록 합니다. 그런 다음 압력솥에서 섭씨 120도에서 15분 동안 상자를 가열하면 70킬로파스칼의 작동 압력을 달성할 수 있습니다. 슬라이드를 제거하고 식힌 다음 주변 온도에서 15분 동안 건조시킵니다.가수분해가 완료되면 먼저 10마이크로리터의 트립신 용액을 조직 단면의 가장자리에 피펫팅하여 초순수에 10마이크로리터의 트립신 용액을 샘플에 코팅합니다. 그런 다음 동일한 피펫 팁을 사용하여 표면 장력 하에서 조직의 전체 표면을 가로질러 물방울을 드래그합니다. 샘플을 주변 온도에서 건조시킨 후 슬라이드의 양쪽 가장자리에 오토클레이브 테이프를 사용하여 이전에 구성된 증기 챔버 상단 내부에 장착합니다.100% 아세토니트릴과 50밀리몰 중탄산암모늄의 부피 혼합물을 위한 일대일 부피가 포함된 용액 600마이크로리터를 페트리 접시 바닥 부분의 압지 손가락에 손가락이 고르게 젖는 것처럼 보일 때까지 조심스럽게 피펫합니다. 피펫팅은 매우 중요한데, 잘못된 피펫팅은 매트릭스 및 표면 분석기의 비편소화를 초래하여 샘플에 포함된 공간 정보를 파괴하기 때문입니다. 증기 챔버의 위쪽 절반을 아래쪽 절반에 놓고 종이 손가락과 샘플 슬라이드가 완벽하게 정렬되도록 하고 적도 주위의 챔버를 파라핀 필름으로 밀봉합니다.완전한 소화를 위해 샘플을 섭씨 37도의 인큐베이터에 밤새 그대로 두십시오. 분해가 완료되면 샘플 슬라이드를 5자리 마이크로 분석 저울에 그대로 둡니다. 승화 장치의 냉각 핑거에 슬라이드를 장착하고 증기 챔버에 대해 설명한 것과 동일한 방법으로 구리 테이프로 고정합니다.챔버 바닥에 있는 유리 페트리 접시에 CHCA 매트릭스 300mg을 넣고 골고루 펴서 매트릭스 결정의 얇은 층을 만듭니다. 승화기를 조립합니다. 그리고 말굽 cl로 두 반쪽을 고정합니다.amp.조립된 장치를 레토르트 스탠드에 연결된 금속 링에 넣어 섭씨 15도로 예열된 모래 수조 20-220cm 위에 매달아 놓습니다. 챔버를 진공 소스에 연결하고 진공을 작동시킨 다음 5분 동안 약 25밀리토르까지 안정화되도록 합니다. 냉각 된 손가락을 얼음으로 맨 위에 넣고 물 50ml를 넣으십시오.계속하기 전에 장치가 5분 더 안정되도록 합니다. 챔버를 스탠드 표면으로 내려 모래가 챔버 바닥에 완전히 닿도록 합니다. 평방 센티미터당 0.22 밀리그램의 이상적인 코팅을 만들기 위해 45 분 동안 그대로 두십시오.45분 후 금속 링을 들어 올려 모래 수조에서 챔버를 제거하고 챔버를 환기시킵니다. 승화가 완료되면 이전과 같이 이전에 구성된 증기 챔버의 상단 내부에 샘플 슬라이드를 장착합니다. 아세토니트릴과 트리플루오로아세트산의 부피 혼합을 위한 일대일 부피가 포함된 용액 600마이크로리터를 페트리 접시 바닥의 압지에 조심스럽게 피펫팅하여 균일한 코팅을 보장합니다.다음으로, 챔버를 조립하여 종이 탭과 현미경 슬라이드가 완벽하게 정렬되도록 합니다. 챔버를 섭씨 37도의 인큐베이터에 1시간 동안 그대로 두십시오. 평판 스캐너에서 슬라이드를 스캔하여 디지털 이미지를 만듭니다.샘플을 질량분석기에 로드한 다음 적절한 소프트웨어 플랫폼을 사용하여 분석합니다. 마지막으로, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 샘플을 분석합니다. 여기에 표시된 것은 50미크론에서 이미징된 올바르게 처리된 조직 표본이며 양호한 거시 구조와 백질과 회백질 간의 명확한 차이를 보여줍니다.성공적으로 비교된 샘플은 서로 다른 조직 위치에서 명확한 차별화를 보여줍니다. 여기에, 백색 지구에 의해 대표되는 백질 지역에 있는 1, 085의 질량 대 전하 비율에 의해 대표되는 펩티드의 상향 조절의 명확한 region이 있다. 반면, 잘못 준비된 이 샘플은 대규모 수준의 국소화를 보여줍니다.세 패널에 걸쳐 존재하는 분자의 패턴은 생물학적 영역 사이에 명확한 정의가 없거나 표시된 분자의 풍부도에 차이가 없음을 분명히 보여줍니다. 이 동영상을 시청한 후에는 펩타이드 이미징 분석을 위해 자체 샘플을 준비하는 방법에 대해 정말 좋은 아이디어를 얻을 수 있습니다. 적절한 절차를 통해 이 방법은 이틀에 걸쳐 8시간 이내에 수행할 수 있으므로 하룻밤 동안 분해 단계가 가능합니다.이 방법론을 준비하는 동안 각 단계에서 주의를 기울이는 것이 중요합니다. 조직에 물리적 손상이 발생하면 샘플에 포함된 공간 정보가 파괴됩니다. 우리는 자체 IMS 우주 조사를 처음 시작했을 때 이 방법론에 대한 아이디어를 가지고 있었고 다른 확실한 방법론이 발표되지 않았다는 것을 깨달았습니다.약간의 변형으로 당사의 방법론을 단백질, 펩타이드, 지질 및 기타 소분자 분석에 적용할 수 있습니다. 이 절차에 따라 면역형광, 헤마톡실린 및 에오신 염색과 같은 다른 조직학적 기술을 샘플에 적용하여 이미징 질량 분석 데이터에 대한 기준점을 얻을 수 있습니다. 액체 니트로셀룰로오스와 같이 폭발 가능성이 있는 화학 물질로 작업할 때는 올바른 안전 절차를 유지하는 것이 중요합니다.작업량을 최소화하고 폐기물을 즉시 처리하는 것이 매우 중요합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

기록 포르말린 고정 및 (FFPE) 포함 된 파라핀은 임상 시료는 질병의 조사를 위해 가치있는 소재입니다. 여기에서 우리는 microdissected FFPE 조직의 깊이있는 단백체 분석을 허용하는 샘플 준비 워크 플로를 보여줍니다.

포르말린에서 프로테오믹스 샘플 준비 파라핀 조직에게 고정 및

디 트라 놀 (DT; 1,8 - 디 히드 록시 -9,10 - 온라인 dihydroanthracen -9 - 일) 이전에 작은 분자의 티슈 이미징 MALDI 매트릭스로서보고되었다;에서 내인성 지질의 MALDI 이미징 DT의 사용을위한 프로토콜 초고 해상도 극 - FTICR 악기에 긍정적 인 이온 MALDI-MS에 의한 조직 섹션의 표면은 여기에 제공됩니다.

푸리에에 매트릭스 보조 레이저 탈착 / 이온화 이미징 매트릭스 디 트라 놀은 이온 사이클로트론 공명 질량 분석기를 변환

불멸화 암세포 차원 세포 배양, 생물학적 연구를위한 유용한 모델로 성장시킬 수있다. 이 프로토콜은 샘플 제조 플랫폼의 개선을 포함하여 3 차원 세포 배양의 질량 분석 이미징을 설명한다. 이 프로토콜의 목적은 질량 분석 이미징 분석 3D 세포 배양을 준비하도록 지시한다.

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결합 전구체 동위 원소 라벨 및 동중 태그 (cPILOT)은 동중 태그의 샘플 다중화 기능을 향상 정량 프로테오믹스 전략이다. 이 프로토콜은 알츠하이머 병 마우스 모델 및 야생 형 컨트롤에서 조직에 cPILOT의 응용 프로그램을 설명합니다.

향상된 샘플 복합 전구체 동위 원소 표지 및 동중 태그를 사용하여 조직의 다중 (cPILOT)

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학습하세요 포르말린 고정 조직을 레이저 탈착/이온화 질량 분석 이미징용으로 재현 가능하게 준비하는 방법을. 니트로셀룰로스 코팅 슬라이드와 승화 기법을 사용하여 초보자도 신뢰성 있는 워크플로우를 개발할 수 있습니다.

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