펩타이드 기반 매트릭스 샘플을 고정 하는 포 르 말린의 최적의 준비 지원 레이저 탈 착/이온화 질량 분석 이미징 워크플로

이 절차의 전반적인 목표는 펩타이드 질량 분석 이미징을 위해 조직 샘플을 재현성 있게 준비하는 것입니다. 이 방법을 사용하면 초보 질량 분석기 사용자가 장시간의 경험적 결정을 거치지 않고도 자체 이미징 질량 분석 워크플로우를 개발할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 재현성이 높고 구현이 간단하며 비용 효율적인 방법론을 사용한다는 것입니다.

니트로셀룰로오스 코팅된 슬라이드를 준비하기 위해 전도성 인듐 주석 산화물 현미경 슬라이드의 한쪽 가장자리에 40마이크로리터의 액체 니트로셀룰로오스를 피펫팅합니다. 일반 유리 현미경 슬라이드를 사용하여 슬라이드를 가로질러 표면 장력 하에서 니트로셀룰로오스를 드래그하여 균일한 박막 코팅을 만듭니다. 니트로셀룰로오스를 실온에서 20초 동안 건조시킨 다음 실온에서 필요할 때까지 보관하십시오.

다음으로, 표준 플라스틱 페트리 접시의 아래쪽 절반이 들어갈 만큼 충분히 큰 두꺼운 블로팅 페이퍼 조각을 잘라 맞춤형 증기 챔버를 만듭니다. 종이를 잘라 중앙에 현미경 슬라이드와 같은 크기의 직사각형 스트립을 남깁니다. 종이가 페트리 접시에서 그 위치를 유지할 수 있도록 충분한 여분을 남겨 두십시오.

FFPE 조직의 경우, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 니트로셀룰로오스 사전 코팅된 ITO 슬라이드에 섹션을 플로트 장착합니다. 슬라이드를 신선한 자일렌에 담그어 2분 동안 잔류 파라핀을 제거합니다. 부피 에탄올 용수 용액에 대한 70% 부피와 100% 에탄올로 구성된 등급이 매겨진 용매 시리즈에 슬라이드를 30초 동안 담궈 파라핀이 제거된 샘플을 세척합니다.

그런 다음 슬라이드를 Carnoy의 액체에 2분 동안 담그십시오. 마지막으로 슬라이드를 일련의 100% 에탄올, 초순수 및 100% 에탄올에 다시 30초 동안 담그십시오. 샘플 슬라이드를 20 밀리몰 트리스 HCO로 맨 위까지 채워진 플라스틱 슬라이드 상자에 넣습니다.

상자를 밀봉하고 500ml의 물이 담긴 수조에 넣어 상자가 수조 바닥에 닿도록 합니다. 그런 다음 압력솥에서 섭씨 120도에서 15분 동안 상자를 가열하면 70킬로파스칼의 작동 압력을 달성할 수 있습니다. 슬라이드를 제거하고 식힌 다음 주변 온도에서 15분 동안 건조시킵니다.

가수분해가 완료되면 먼저 10마이크로리터의 트립신 용액을 조직 단면의 가장자리에 피펫팅하여 초순수에 10마이크로리터의 트립신 용액을 샘플에 코팅합니다. 그런 다음 동일한 피펫 팁을 사용하여 표면 장력 하에서 조직의 전체 표면을 가로질러 물방울을 드래그합니다. 샘플을 주변 온도에서 건조시킨 후 슬라이드의 양쪽 가장자리에 오토클레이브 테이프를 사용하여 이전에 구성된 증기 챔버 상단 내부에 장착합니다.

100% 아세토니트릴과 50밀리몰 중탄산암모늄의 부피 혼합물을 위한 일대일 부피가 포함된 용액 600마이크로리터를 페트리 접시 바닥 부분의 압지 손가락에 손가락이 고르게 젖는 것처럼 보일 때까지 조심스럽게 피펫합니다. 피펫팅은 매우 중요한데, 잘못된 피펫팅은 매트릭스 및 표면 분석기의 비편소화를 초래하여 샘플에 포함된 공간 정보를 파괴하기 때문입니다. 증기 챔버의 위쪽 절반을 아래쪽 절반에 놓고 종이 손가락과 샘플 슬라이드가 완벽하게 정렬되도록 하고 적도 주위의 챔버를 파라핀 필름으로 밀봉합니다.

완전한 소화를 위해 샘플을 섭씨 37도의 인큐베이터에 밤새 그대로 두십시오. 분해가 완료되면 샘플 슬라이드를 5자리 마이크로 분석 저울에 그대로 둡니다. 승화 장치의 냉각 핑거에 슬라이드를 장착하고 증기 챔버에 대해 설명한 것과 동일한 방법으로 구리 테이프로 고정합니다.

챔버 바닥에 있는 유리 페트리 접시에 CHCA 매트릭스 300mg을 넣고 골고루 펴서 매트릭스 결정의 얇은 층을 만듭니다. 승화기를 조립합니다. 그리고 말굽 cl로 두 반쪽을 고정합니다.amp.

조립된 장치를 레토르트 스탠드에 연결된 금속 링에 넣어 섭씨 15도로 예열된 모래 수조 20-220cm 위에 매달아 놓습니다. 챔버를 진공 소스에 연결하고 진공을 작동시킨 다음 5분 동안 약 25밀리토르까지 안정화되도록 합니다. 냉각 된 손가락을 얼음으로 맨 위에 넣고 물 50ml를 넣으십시오.

계속하기 전에 장치가 5분 더 안정되도록 합니다. 챔버를 스탠드 표면으로 내려 모래가 챔버 바닥에 완전히 닿도록 합니다. 평방 센티미터당 0.22 밀리그램의 이상적인 코팅을 만들기 위해 45 분 동안 그대로 두십시오.

45분 후 금속 링을 들어 올려 모래 수조에서 챔버를 제거하고 챔버를 환기시킵니다. 승화가 완료되면 이전과 같이 이전에 구성된 증기 챔버의 상단 내부에 샘플 슬라이드를 장착합니다. 아세토니트릴과 트리플루오로아세트산의 부피 혼합을 위한 일대일 부피가 포함된 용액 600마이크로리터를 페트리 접시 바닥의 압지에 조심스럽게 피펫팅하여 균일한 코팅을 보장합니다.

다음으로, 챔버를 조립하여 종이 탭과 현미경 슬라이드가 완벽하게 정렬되도록 합니다. 챔버를 섭씨 37도의 인큐베이터에 1시간 동안 그대로 두십시오. 평판 스캐너에서 슬라이드를 스캔하여 디지털 이미지를 만듭니다.

샘플을 질량분석기에 로드한 다음 적절한 소프트웨어 플랫폼을 사용하여 분석합니다. 마지막으로, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 샘플을 분석합니다. 여기에 표시된 것은 50미크론에서 이미징된 올바르게 처리된 조직 표본이며 양호한 거시 구조와 백질과 회백질 간의 명확한 차이를 보여줍니다.

성공적으로 비교된 샘플은 서로 다른 조직 위치에서 명확한 차별화를 보여줍니다. 여기에, 백색 지구에 의해 대표되는 백질 지역에 있는 1, 085의 질량 대 전하 비율에 의해 대표되는 펩티드의 상향 조절의 명확한 region이 있다. 반면, 잘못 준비된 이 샘플은 대규모 수준의 국소화를 보여줍니다.

세 패널에 걸쳐 존재하는 분자의 패턴은 생물학적 영역 사이에 명확한 정의가 없거나 표시된 분자의 풍부도에 차이가 없음을 분명히 보여줍니다. 이 동영상을 시청한 후에는 펩타이드 이미징 분석을 위해 자체 샘플을 준비하는 방법에 대해 정말 좋은 아이디어를 얻을 수 있습니다. 적절한 절차를 통해 이 방법은 이틀에 걸쳐 8시간 이내에 수행할 수 있으므로 하룻밤 동안 분해 단계가 가능합니다.

이 방법론을 준비하는 동안 각 단계에서 주의를 기울이는 것이 중요합니다. 조직에 물리적 손상이 발생하면 샘플에 포함된 공간 정보가 파괴됩니다. 우리는 자체 IMS 우주 조사를 처음 시작했을 때 이 방법론에 대한 아이디어를 가지고 있었고 다른 확실한 방법론이 발표되지 않았다는 것을 깨달았습니다.

약간의 변형으로 당사의 방법론을 단백질, 펩타이드, 지질 및 기타 소분자 분석에 적용할 수 있습니다. 이 절차에 따라 면역형광, 헤마톡실린 및 에오신 염색과 같은 다른 조직학적 기술을 샘플에 적용하여 이미징 질량 분석 데이터에 대한 기준점을 얻을 수 있습니다. 액체 니트로셀룰로오스와 같이 폭발 가능성이 있는 화학 물질로 작업할 때는 올바른 안전 절차를 유지하는 것이 중요합니다.

작업량을 최소화하고 폐기물을 즉시 처리하는 것이 매우 중요합니다.