Modellering van hersenmetastase via staartaderinjectie van inflammatoire borstkankercellen

We gebruikten de staartadermethode om hersenmetastase te genereren in muismodellen met behulp van cellijnen afgeleid van patiënten met inflammatoire borstkanker, of IBC, een zeer agressieve vorm van primaire borstkanker. Het genereren van hersenmetastase in muismodellen omvat meestal intracardiale of intracarotis arteriële injecties. De staartadermethode biedt echter voordeel ten opzichte van deze technieken, omdat het de stappen van hersenmetastasekolonisatie beter nabootst en relatief eenvoudig uit te voeren is.

Dokters Xiaoding Hu en Emilly Villodre, beiden instructeurs in mijn laboratorium, zullen de procedure demonstreren. Om hersenmetastasen te detecteren door GFP-beeldvorming acht tot 10 weken na tumorcelinjectie, desinfecteert u de muis met 70% ethanol en verwijdert u de vacht van het hoofd en de oren. Snijd het cervicale gebied van de nek af.

Snijd en verwijder de schedel om de hersenen te kunnen oogsten. Plaats de hersenen in een weefselcassette en plaats de cassette in een container met koude DPBS voor niet meer dan een uur. Voor beeldvorming door stereomicroscopie brengt u de hersenen over in een weefselschoteldeksel van 100 centimeter onder een stereomicroscoop die is uitgerust met een UV-licht en selecteert u het 0,5x-objectief om visualisatie van de hele hersenen mogelijk te maken.

Druk op live view en focus de weergave terwijl de hersenen zich in de ventrale positie bevinden. Selecteer het juiste filter in de software en microscoop voor de fluorescerende marker in de cellen en maak een foto. Zonder het monster te verplaatsen, schakelt u over naar brightfield-beeldvorming en selecteert u het brightfield-filter.

Maak een foto. Stel je vervolgens de hersenen in de dorsale positie voor zoals eerder aangetoond. Om de hele hersenbeelden te analyseren, converteert u eerst de afbeeldingsbestanden van TIFF naar JPEG, zodat ze kunnen worden geopend met elke computer die niet over de bijbehorende software beschikt.

Open vervolgens een paar brightfield- en fluorescerende afbeeldingen en selecteer bestands- en samenvoegkanalen. Selecteer de juiste componenten, klik op OK en sla de samengevoegde afbeelding op. Om het hersentumorgebied in het fluorescerende beeld te kwantificeren, selecteert u automatische selectie.

Verplaats de pijl naar het GFP-positiegebied en klik om automatisch een selectie te maken. Klik vervolgens nogmaals om de selectie te bevestigen. Alle metingen worden getoond.

Als meer dan één GFP-positief gebied kan worden waargenomen, herhaalt u de meting met het volgende gebied. Hersenmetastatische laesies kunnen al acht weken na injectie worden gedetecteerd door luciferasebeeldvorming en stereofluorescerende microscopie. Na beeldvorming kunnen delen van de hersenmetastasen worden gefixeerd en verwerkt voor hematoxyline- en eosinekleuring om de aanwezigheid van hersenmetastaselaesies te valideren, en voor immunohistochemische kleuring om specifieke eiwitmarkers van belang te detecteren.

Bij het proberen van dit protocol is het belangrijk om de levensvatbaarheid van de cel te behouden door de cellen niet langer dan een uur op ijs te houden en om luchtbellen in de celsuspensie te vermijden om embolievorming en muizensterfte te voorkomen. Na injectie van de staartader monitoren we hersenmetastasegroei en progressie met luciferasebeeldvorming. Na euthanasie bevestigden stereofluorescerende microscopie en histologie metastaseringslaesies.