Name: 진공 보조 흡착제 추출을 통해 인간 관련 샘플에서 활발히 생산된 미생물 휘발성 유기 화합물 포획 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: 배우세요 진공 보조 흡착제 추출(VASE)과 GC-MS를 활용하여 인간 관련 샘플에서 미생물이 활발히 생산하는 휘발성 유기 화합물을 포착하고 분석하는 방법입니다. 이 기술은 생물학적 표지자 발견과 미생물 대사 연구에 활용됩니다.

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이 원고를 신중하게 편집해 주신 Heather Maughan과 Linda M. Kalikin에게 감사드립니다. 이 작업은 NIH NHLBI (보조금 5R01HL136647-04)가 지원했습니다.

1. 헤드스페이스 흡착펜(HSP) 및 샘플 분석 고려 사항
참고: 흡착제 Tenax TA를 함유하는 HSP는 광범위한 휘발성 물질을 포획하기 위해 선택되었다. Tenax는 다른 흡착제에 비해 물에 대한 친화력이 낮기 때문에 수분이 높은 샘플에서 더 많은 VOC를 포획 할 수 있습니다. Tenax는 또한 불순물 수준이 낮으며 재사용을 위해 컨디셔닝 될 수 있습니다. 흡착제 선택은 또한 GC-MS에 설치된 컬럼을 고려하여 이루어졌다( 물질의 표 참조).
<ol><li>샘플 추출에 사용된 것과 동일한 조건으로 배지 및/또는 샘플 블랭크를 추출하여 음성 대조군을 생성합니다.</li>
	<li>추출된 샘플을 분석하기 전에 GC-MS에서 빈 HSP(이전에 깨끗하고 상당한 배경이 없는 것으로 확인됨)를 분석합니다. 샘플 유형 사이에서 블랭크를 실행한다(예를 들어, 박테리아 모노 컬쳐의 세 번의 반복실험, 블랭크, 박테리아 공동 배양의 세 번의 반복실험, 블랭크 등).</li>
	<li>샘플 추출 및 분석 전에 향기로운 개인 위생 용품의 사용 또는 냄새 나는 음식의 소비를 제한하십시오. 이상적으로는 알코올이나 다른 휘발성 클리너로 세척되지 않은 생물 안전 후드에서 샘플을 적어도 30 분 동안 준비하십시오. 시료 준비 전에 30-60분 동안 생물안전 후드의 공기 흐름을 켭니다.</li>
	<li>샘플을 얼음 위에 보관하여 시료 준비 중 휘발성 방출을 제한하십시오.</li>
</ol>2. 모노 및 공동 문화 준비
<ol><li>생물안전 후드에서, A. baumannii, S. aureus 및 P. aeruginosa 의 배양물을 Todd Hewitt 성장 배지에 접종한다. 200 rpm 교반으로 37°C에서 하룻밤 동안 인큐베이션한다.</li>
	<li>하룻밤 배양 후, 생물안전 후드에서 배양 처리를 수행한다. 각 배양물을 500 nm에서 광학 밀도 0.05로 희석한다.</li>
	<li>200 μL의 대조군 배지, 모노- 또는 공동배양물을 96-웰 플레이트의 각 웰에 넣고 동배양하고, 24시간 동안 37°C 배양기에 넣는다. 48-h 인큐베이션을 위한 두 번째 플레이트를 준비한다.</li>
	<li>잠복기가 끝나면 섹션 4에서 추출을위한 샘플을 준비하십시오. 액체 배양물을 마이크로원심분리 튜브로 피펫하고 -80°C에서 보관한다. 참고: 이 시점에서 샘플은 -80°C에서 보관하여 필요한 경우 나중에 추출할 수 있습니다.</li>
</ol>3. 생물학적 샘플 준비에서 안정적인 동위원소 프로빙
참고 : 대변과 타액 샘플은 캘리포니아 어바인 기관 검토위원회 (HS # 2017-3867)의 승인을 받아 익명의 기증자로부터 기증되었습니다. 하수는 캘리포니아 주 샌디에고에서 나왔습니다. 가래 샘플은 낭포성 섬유증을 앓고있는 피험자로부터 미시간 의과 대학 기관 검토 위원회 (HUM00037056)에 의해 승인 된 더 큰 연구의 일환으로 수집되었습니다.
<ol><li>생물 안전 후드에서 모든 생물학적 샘플 준비를 수행하십시오.<ol>
<li>분변 샘플을 준비하려면 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브에서 100mg의 대변에 탈이온수 1mL를 넣고 3 분 동안 와류하십시오. 사용하지 않을 때는 얼음 위에 올려 놓으십시오.<ol>
<li>15 μL의 분변과 물의 혼합물에, 485 μL의 뇌 심장 주입 (BHI) 배지를 20 mM 13 C 글루코스, 또는 30% 중수소 (D2O)가있는 BHI를 첨가한다. 샘플의 최종 부피가 500 μL인지 확인하십시오. 기술적 인 삼중으로 샘플을 준비하십시오.</li>
		</ol>
</li>
		<li>하수 샘플을 준비하려면 20 mM 13C 글루코스가 있는 BHI 500 μL에 하수 500 μL를 첨가하거나 총 부피 1 mL의 BHI를 30%D2O로 첨가하십시오. 샘플을 세 배로 준비하십시오. 사용하지 않을 때는 얼음 위에 올려 놓으십시오.</li>
		<li>타액 샘플을 준비하려면 50 μL의 타액에 20 mM 13C 글루코스 또는 30% D2O가 있는 BHI를 500 μL의 BHI에 첨가하여 총 부피 550 μL의 시료를 삼중으로 준비한다. 사용하지 않을 때는 얼음 위에 올려 놓으십시오.</li>
		<li>배양 전과 후에 샘플에 존재하는 휘발성 물질을 비교하기 위해 객담 샘플을 준비하려면 15 μL의 가래로 첫 번째 추출을 수행하십시오. 샘플을 세 배로 준비하십시오. 사용하지 않을 때는 얼음 위에 올려 놓으십시오. 샘플 추출을 위해 섹션 4로 진행하고, 200 rpm 교반으로 37°C에서 18시간 동안 추출한다.</li>
		<li>배양되지 않은 객담 샘플의 첫 번째 추출이 완료된 후 바이알을 가래로 저장하십시오. 20 mM 13C 글루코스와 함께 500 μL의 BHI를 3.5.1의 가래가 있는 바이알에 첨가한다. 사용하지 않을 때는 얼음 위에 올려 놓으십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>샘플 추출을 위해 섹션 4로 진행하십시오.</li>
</ol>4. 시료 추출
<ol><li>빈 휘발성 유기 분석(VOA) 바이알(20 mL)을 차가운 플레이트 위에 놓고 차가운 플레이트를 생물안전 후드의 얼음 위에 놓습니다.</li>
	<li>5600 흡착펜 추출 유닛(SPEU)을 켜고, 각 방법에 따라 원하는 온도로 조정한다. 참고: 37°C에서 안정적인 동위원소 프로빙 실험을 위해 설정점에 도달하는 데 최대 15분이 걸릴 수 있습니다. 70°C에서의 모노- 및 공동-배양 실험의 경우, 설정점에 도달하는 데는 최대 60분이 소요될 수 있다.</li>
	<li>배지 또는 샘플 제어를 위한 HSP를 포함하여 준비된 샘플 수와 동일한 깨끗한 HSP를 수집합니다.</li>
	<li>필요에 따라 샘플, 반복실험 및 HSP ID에 따라 20mL VOA 바이알에 라벨을 부착합니다. 얼음 위에서 바이알 외부에 결로가 형성되는 경우 물에 저항하는 마커를 사용하십시오.</li>
	<li>생물 안전 후드 내부에서 바이알의 흰색 캡을 풀고 샘플을 바이알에 신속하게 피펫하고 검은 색 캡, 뚜껑 라이너 및 HSP를 조립하십시오. 참고: 샘플은 HSP와 접촉해서는 안되며 샘플 부피는 샘플 유형에 따라 다릅니다.</li>
	<li>샘플 및 HSP가 들어있는 바이알을 다시 차가운 플레이트 위에 놓습니다.</li>
	<li>각 샘플에 대해 4.5단계와 4.6단계를 반복합니다. 시료 온난화를 방지하고 조기 휘발성 방출을 방지하기 위해 한 번에 이러한 단계를 수행하는 대신 시료 당 이러한 단계를 수행하십시오.</li>
	<li>모든 샘플이 유리 바이알에서 준비되면 벤치의 생물 안전 후드 외부에서 다음 단계를 수행하십시오. 진공 펌프를 켜고 바이알을 진공 하에 30mmHg까지 놓고 진공 소스를 제거하십시오. 참고: 바이알은 진공 적용이 완료된 후 차가운 트레이에 있을 필요가 없습니다.</li>
	<li>압력 게이지를 사용하여 모든 샘플을 진공 하에 놓은 후 압력을 다시 확인하십시오. 바이알에 누출이 있는 경우 뚜껑이 단단히 조여져 있고 HSP 및 뚜껑 라이너의 흰색 O 링이 제대로 제자리에 있는지 확인하십시오. 참고: 씰이 손상되면 진공 상태의 바이알에 비해 휘발성 감지가 감소할 수 있습니다.</li>
	<li>바이알을 200 rpm에서 교반하면서 최적화된 시간과 온도를 위해 SPEU에 넣으세요. 추출물을 70°C에서 1시간 동안 배양하였다. 분변, 하수, 타액 및 객담 샘플을 사용하여 37°C에서 18시간 동안 안정한 동위원소 프로빙 실험을 추출한다.</li>
	<li>추출 기간이 완료된 후 사용하기 위해 차가운 플레이트를 -80°C에 두십시오.</li>
	<li>추출이 완료되면 샘플을 차가운 접시에 15 분 동안 올려 HSP 및 바이알 헤드 스페이스에서 수증기를 추출하십시오.</li>
	<li>HSP를 슬리브로 옮깁니다. 참고 : HSP에서 더 휘발성이 높은 화합물을 잃기 전에 실온에서 최대 ~ 1 주 동안 실험을 일시 중지 할 수 있습니다.</li>
</ol>5. 가스 크로마토그래피에서 샘플 분석 - 질량 분광계 (GC-MS)
<ol><li>다음 GC-MS( 재료 표 참조) 설정을 사용합니다: 5분 홀드가 있는 35°C, 170°C까지 10°C/min 램프, 20:1 분할 비율과 38분의 총 런타임으로 230°C까지 15°C/분 램프.</li>
	<li>탈착 방법을 다음과 같이 설정한다: 2분, 70°C 예열; 2분 260°C 탈착; 34분, 260°C 베이크아웃; 및 2분, 70°C 포스트 베이크.</li>
	<li>샘플 시퀀스를 설정하고 계측에 따라 실행을 시작합니다.<ol>
<li>Entech 소프트웨어에서 시퀀스를 설정하려면 프로그램을 엽니다. 계측기 드롭다운 메뉴 오른쪽에 있는 옵션에서 5800을 선택하| 시퀀스.</li>
		<li>GC-MS 소프트웨어와 유사한 Entech 소프트웨어의 시퀀스 테이블을 관찰하십시오. 현재 date_vial 번호에 따라 샘플 ID 열 의 이름을 지정합니다. 이름은 GC-MS 시퀀스 테이블의 이름과 유사하며 5800 Method 는 온도 램프 속도, 유지 시간 등을 결정합니다 (5.2 단계에서 생성 된 방법을 선택하는 메뉴를 엽니 다).</li>
		<li>트레이 및 위치 열은 샘플 준비 레일(SPR)이 HSP를 픽업하기 위해 이동할 위치를 결정합니다.<ol>
<li>바로 왼쪽에 각각 30 개의 반점이있는 두 개의 쟁반을 관찰하고 각각 다섯 개의 반점이있는 여섯 개의 기둥으로 배치하십시오. 가장 왼쪽이고 사용자(앞)에 가장 가까운 트레이 위치는 위치 1이고, 가장 오른쪽, 가장 멀리 떨어져 있는 트레이 위치는 위치 30입니다.</li>
			<li>이러한 트레이는 HSP A 또는 B이며, 여기서 HSP B는 SPR(가장 안쪽 트레이)에 더 가까운 트레이이고 HSP B 바로 뒤에는 HSP 블랭크가 있습니다. 추출된 샘플을 트레이에 넣고 그에 따라 시퀀스에서 스폿을 선택합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>시퀀스 테이블을 저장하고 왼쪽에서 실행 을 선택한 다음 빈 HSP가 탈착기에 있는 경우 제거기에서 공백으로 시작 (노란색 레이블로 표시된 HSP로 표시됨)을 선택합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>HSP는 시퀀스의 각 샘플에 대해 SPR에 의해 처리됩니다. SPR을 예열하면 화면 상단에 공백이 소거버에 있는지 확인하는 메시지가 나타납니다. 건너뛰 기를 클릭하여 펜이 있는지 확인합니다. SPR이 모든 샘플을 자동으로 실행하도록 허용하면 GC-MS 측의 시퀀스가 자동으로 데이터를 별도의 파일에 기록합니다.</li>
</ol>6. 데이터 분석
<ol><li>GC-MS 소프트웨어의 품질 필터 데이터 (재료 표).<ol>
<li>크로마토그램의 각 피크를 검토하고 NIST(National Institute of Standards & Technology) 라이브러리(또는 사용 가능한 다른 라이브러리)와 일치하는 피크에 주석을 달습니다.</li>
		<li>주석이 달린 크로마토그램 피크를 처리 방법에 추가합니다. 75% 이상의 확률을 갖는 화합물을 포함하도록 피크를 선택하는 기준을 설정하고, 화합물의 각 식별 이온의 정렬이 피크의 중심 내에 있는지 확인하십시오.<ol>
<li>처리 방법에 피크를 추가하려면 | 보정을 선택합니다. 컴파운드 | 편집 이름 | 외부 표준 컴파운드 아래에 화합물을 삽입하십시오. 화합물의 이름, 체류 시간, 양자 신호 대상 이온을 추가하십시오. 세 개의 가장 큰 봉우리를 추가하십시오. 저장하려면 확인을 선택 합| 방법 | 저장.</li>
		</ol>
</li>
		<li>공정 방법이 설정되면 정량화 |로 진행하십시오. | 계산 및 보기 QEdit 양자 결과.</li>
		<li>각 화합물을 검사하여 피크가 예상 보존 시간과 일치하고 배경 소음보다 높은지 확인합니다.</li>
		<li>QEdit이 완료되면 종료를 선택합| 예, QEdits를 저장하고 주 크로마토그램으로 돌아갑니다. 왼쪽에서 파일을 열어 영역 통합을 내보냅니다. | 정량 선택 보고서를 생성합니다.</li>
		<li>DExSI에서 사용할 파일을 내보내려면 파일 |를 선택합니다. 데이터를 AIA 형식 |로 내보내기 새 디렉터리를 만들고 파일의 위치를 선택하거나 기존 디렉터리 사용을 선택합니다.</li>
		<li>새 창이 열리고 내보낼 파일을 선택하는 것을 관찰하십시오. 파일을 창의 오른쪽으로 이동하고 프로세스를 클릭하십시오. 변환되는 파일 수에 따라 몇 초에서 몇 분 정도 기다리십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>DExSI 소프트웨어(https://github.com/DExSI/DExSI)에 대한 지침에 따라 DExSI의 동위원소 풍부도를 수정하고 즐겨찾는 소프트웨어 또는 프로그램(예: R)으로 분석을 수행합니다. 수치를 생성하는 데 사용되는 스크립트는 <a data-saferedirecturl="https://www.google.com/url?q=https://github.com/joannlp/VOC_SIP&source=gmail&ust=1646398895210000&usg=AOvVaw18Jx-lKhdf3eNanCnF4OhQ" href="https://github.com/joannlp/VOC_SIP" target="_blank">https://github.com/joannlp/ VOC_SIP</a>에 있습니다.</li>
</ol>

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V. L. V와 S. J.B. D.는 Entech Instruments Inc.의 전직 직원이었으며 K. W.는 Entech의 University Program의 회원입니다. J. P., J. K., C. I. R.은 선언할 이해상충이 없다.

시험관내 배양 및 인간 관련 샘플에서의 휘발성 생산을 확인하기 위해, P. aeruginosa, S. aureus 및 A. baumanii의 모노- 및 공동 배양물의 휘발성 분석 및 상이한 생물학적 샘플의 안정한 동위원소 프로빙을 수행하였다. 모노- 및 공동-배양물에 대한 분석에서, 휘발성 물질은 70°C에서 1시간 동안 짧은 추출을 수행하여 검출되었다. 모노 및 공동 배양의 휘발성 분석은 개별 종에 의해 그리고 다른 종과의 상호 작용 중에 생성 된 화합물의 조사를 허용했습니다. 다른 문화 유형과 시간대에 걸쳐 상대적 풍부함의 차이가있었습니다. 안정한 동위원소 프로빙 실험에서, 생물학적 샘플은 낭포성 섬유증을 앓고 있는 피험자로부터의 건강한 피험자로부터의 대변과 타액, 하수 및 가래를 포함하였다. 안정한 동위원소 프로파일링은 37°C에서 18시간 동안 추출함으로써 활발하게 생성된 휘발성 분자의 동정을 가능하게 하였다. 더 낮은 온도로 긴 추출 시간은 생물학적 샘플에 존재하는 미...

휘발성 유기 화합물 (VOCs)은 모든 유기체에서 방출되기 때문에 박테리아 검출 및 식별에 큰 약속을 가지고 있으며, 다른 미생물은 고유 한 VOC 서명을 가지고 있습니다. 휘발성 분자는 만성 폐쇄성 폐 질환1, 소변3의 결핵2, 인공호흡기 관련 폐렴4를 포함한 다양한 호흡기 감염을 검출하기 위한 비침습적 측정으로서 활용되었으며, 낭포성 섬유증(CF)을 가진 피험자를 건강한 대조군 피험자(5,6)와 구별하는 것 이외에 활용되었다. 휘발성 서명은 심지어 CF에서 특정 병원체 감염을 구별하기 위해 사용되었다 (스타필로코커스 아우레우스 7, 슈도모나스 aeruginosa 8,9, 및 S. 아우레우스 대 P. aeruginosa10). 그러나, 이러한 생물학적 샘플의 복잡성으로 인해, 특정 VOC의 공급원을 정확히 찾아내는 것은 종종 어렵다.
다수의 감염 미생물로부터 휘발성 프로파일을 분리하기 위한 하나의 전략은 모노- 및 공동-배양11 둘 다에서 미생물의 헤드스페이스 분석을 수행하는 것이다. 헤드스페이스 분석은 샘플 자체에 포함된 분석물이 아닌 샘플 위의 "헤드스페이스"로 방출되는 분석물을 검사합니다. 미생물 대사 산물은 종종 복잡한 임상 샘플에서 미생물 대사 산물의 기원을 결정하는 데 어려움이 있기 때문에 단일 배양에서 특성화되었습니다. 박테리아 모노 배양물로부터의 휘발성 물질을 프로파일링함으로써, 미생물이 시험관내에서 생성하는 휘발성 물질의 유형은 그의 휘발성 레퍼토리의 기준선을 나타낼 수 있다. 박테리아 배양물을 결합, 예를 들어, 공동 배양물을 생성하고, 생성된 휘발성 분자를 프로파일링하는 것은 박테리아(12) 사이의 상호작용 또는 교차-공급을 나타낼 수 있다.
휘발성 분자의 미생물 기원을 확인하기 위한 또 다른 전략은 안정한 동위원소로 표지되는 영양 공급원을 제공하는 것이다. 안정한 동위원소는 자연적으로 발생하며, 중성자의 수가 다른 원자의 비방사성 형태이다. 1930년대 초부터 동물(13)의 활성 대사를 추적하기 위해 활용되어 온 전략에서, 미생물은 라벨이 붙은 영양원을 떼어내고 안정적인 동위원소를 대사 경로에 통합한다. 보다 최근에, 중수 형태의 안정한 동위원소 (D2O)가 임상 CF 객담 샘플14에서 대사적으로 활성인 S. 아우레우스를 확인하기 위해 사용되었다. 또 다른 예에서, 13C표지된 글루코스는 P. aeruginosa와 Rothia mucilaginosa12의 CF 임상 단리물 사이의 대사산물의 교차 공급을 입증하는데 사용되었다.
질량 분광법 기술의 발전과 함께, 휘발성 신호를 검출하는 방법은 질적 관찰에서 더 정량적 측정으로 옮겨갔습니다. 가스 크로마토그래피 질량 분광법 (GC-MS)을 사용함으로써 생물학적 샘플의 처리는 대부분의 실험실 또는 임상 환경에서 도달 할 수있게되었습니다. 휘발성 분자를 조사하기 위한 많은 방법들이 오염을 검출하기 위해 식품, 박테리아 배양물, 및 다른 생물학적 샘플, 및 공기 및 물과 같은 샘플을 프로파일링하는데 사용되어 왔다. 그러나, 높은 처리량을 갖는 휘발성 샘플링의 몇몇 일반적인 방법은 용매를 필요로 하며, 진공 추출에 의해 제공되는 이점으로 수행되지 않는다. 또한 분석 15,16,17,18,19에 더 많은 부피 또는 양(0.5mL 초과)의 샘플링된 물질이 필요한 경우가 많지만, 이는 기판에 따라 다르며 각 샘플 유형 및 방법에 대한 최적화가 필요합니다.
여기서, GC-MS 상에서 열 탈착에 이어 진공 보조 흡착제 추출(VASE)을 사용하여 박테리아 모노 및 공동 배양물의 휘발성 프로파일을 조사하고 인간 분변, 타액, 하수 및 객담 샘플로부터 안정한 동위원소 프로빙을 갖는 활발하게 생성된 휘발성 물질을 확인했다(도 1). 제한된 샘플 수량으로, VOCs는 가래의 최소 15 μL에서 추출되었다. 인간 샘플을 이용한 동위원소 프로빙 실험은 미생물 군집의 성장을 육성하기 위해 13C글루코스와 같은 안정한 동위원소 공급원 및 배지를 첨가하는 것이 필요했습니다. 휘발성 물질의 활성 생산은 GC-MS에 의해 더 무거운 분자로 확인되었다. 정적 진공 하에서 휘발성 분자를 추출하면 감도가 증가한 휘발성 분자를 검출할 수 있었습니다20,21,22.

<table><tbody><tr><td>13C 포도당</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>389374-1G</td><td></td></tr><tr><td>2-Stg 디아프 펌프</td><td>Entech Instruments</td><td>01-10-20030</td><td></td></tr><tr><td>20 mL VOA 바이알</td><td>Fisher Scientific</td><td>5719110</td><td></td></tr><tr><td>24 mm 검은색 구멍이 있는 캡, 격막 없음</td><td>Entech Instruments</td><td>01-39-76044B</td>는 흡착제 펜용 바이알 24mm 바이알 라이너<td>의 뚜껑 라이너를 제자리에 고정합니다</td></tr><tr><td>.</td><td>Entech Instruments</td><td>SP-L024S</td>는 펜이 바이알 5600 흡착 펜 추출 장치(SPEU) <td>상단에 진공 밀봉을 할 수 있도록 합니다</td></tr><tr><td>.</td> <td>Entech Instruments</td><td>5600-SPES</td><td>5600 흡착 펜 추출 장치 -120 VAC</td></tr><tr><td>96-well 분석 플레이트</td><td>Genesee</td><td>25-224</td><td></td></tr><tr><td>뇌 심장 주입(BHI) 매체</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>53286-500G</td><td></td></tr><tr><td>ChemStation 스토웨어</td><td>애질런트</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DB-624 컬럼</td><td>애질런</td>트 <td>122-1364E</td><td>60m, 0.25mm ID, 1.40미크론 필름 두께, GC-MS</td></tr><tr><td>중수소산화물</td><td>시그마-알드리치</td><td>151882-1L</td><td></td></tr><tr><td>Dexsi 소프트웨어</td><td>Dexsi(오픈 소스)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GC-MS(7890A GC 및 5975C 비활성 XL MSD(3축 검출기 포함)</td><td>애질런트</td><td></td><td>7890A GC 및 5975C 비활성 XL MSD(3축 포함) 검출기</td></tr><tr><td>헤드스페이스 번들 HS-B01, 120VA</td><td>Entech Instruments</td><td>SP-HS-B01</td><td>번들에 포함된 실행 헤드스페이스 추출용 항목</td></tr><tr><td>헤드스페이스 흡착 펜(HSP) - 빈</td><td>Entech Instruments</td><td>SP-HS-0</td><td></td></tr><tr><td>헤드스페이스 흡착식 펜(HSP) Tenax TA(35/60 메시)</td><td>Entech Instruments</td><td>SP-HS-T3560</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기 튜브(2mL)</td><td>VWR</td><td>53550-792</td><td></td></tr><tr><td>O-링</td><td>Entech Instruments</td><td>SP-OR-L024</td><td></td></tr><tr><td>샘플 준비 레일</td><td>Entech Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>흡착식 펜 열 조절기</td><td>Entech Instruments</td><td>3801-SPTC</td><td></td></tr><tr><td>Todd Hewitt (TH) 미디어</td><td>Sigma</td><td>T1438-500G</td><td></td></tr></tbody></table>

진공 보조 흡착제 추출을 통해 인간 관련 샘플에서 활발히 생산된 미생물 휘발성 유기 화합물 포획

Capturing Actively Produced Microbial Volatile Organic Compounds from Human-Associated Samples with Vacuum-Assisted Sorbent Extraction

생물학적 샘플로부터의 휘발성 유기 화합물(VOC)은 기원을 알 수 없다. VOCs는 숙주의 미생물 군집 내에서 숙주 또는 상이한 유기체로부터 기원할 수 있다. 미생물 VOCs의 기원을 분리하기 위해, 스타필로코커스 아우레우스, 슈도모나스 aeruginosa , 및 Acinetobacter baumannii의 박테리아 모노 및 공동 배양의 휘발성 헤드 스페이스 분석, 및 배설물, 타액, 하수 및 객담의 생물학적 샘플에서 안정한 동위원소 프로빙을 수행하였다. 모노- 및 공동-배양물을 사용하여 개별 박테리아 종으로부터의 휘발성 생산을 확인하거나 생물학적 샘플로부터 미생물의 활성 대사를 확인하기 위해 안정한 동위원소 프로빙과 조합하였다.
진공-보조 흡착제 추출(VASE)을 사용하여 VOCs를 추출하였다. VASE는 반휘발성 및 휘발성 화합물에 대한 사용하기 쉽고 상용화되고 무용제 헤드스페이스 추출 방법입니다. 추출 중에 사용되는 용매의 부족과 거의 진공 조건은 tert-butylation 및 고상 미세 추출과 같은 다른 추출 옵션과 비교할 때 상대적으로 쉽고 빠른 방법을 개발할 수있게합니다. 여기에 설명된 워크플로는 모노 및 공동 문화권의 특정 휘발성 서명을 식별하는 데 사용되었습니다. 또한, 인간 관련 생물학적 샘플의 안정한 동위원소 프로빙의 분석은 일반적으로 또는 고유하게 생산되는 VOC를 확인했다. 이 백서는 살아있는 미생물 배양물의 안정적인 동위원소 조사와 함께 ASE의 일반적인 워크 플로우 및 실험 고려 사항을 제시합니다.

S. aureus, P. aeruginosa, A. baumannii의 모노 및 공동 문화 모노 및 공동 배양은 박테리아 종 S. aureus, P. aeruginosa, 및 A. baumannii로 구성되었다. 이들은 인간의 상처와 만성 감염에서 발견되는 일반적인 기회 주의적 병원체입니다. 모노- 및 공동-배양물에 존재하는 휘발성 분자를 확인하기 위해, 200 rpm 교반으로 70°C에서 짧은 1-h 추출을 수행하였다. 24- 및 48-h 시점에서의 모노- 및 공동 배양물로부터, 43개의 주석이 달린 휘발성 분자가 검출되었고(도 2), 그 중 알데히드, 케톤, 알코올, 황산 화합물, 탄화수소, 카르복실산 또는...

이 프로토콜은 진공 보조 흡착제 추출 방법을 사용하여 생물학적 샘플에서 휘발성 유기 화합물을 추출하는 방법, Entech 샘플 준비 레일을 사용한 질량 분광법과 결합 된 가스 크로마토그래피 및 데이터 분석을 설명합니다. 또한 생물학적 샘플 및 안정한 동위원소 프로빙의 배양을 기술한다.

Volatile organic compounds (VOCs) from biological samples have unknown origins. VOCs may originate from the host or different organisms from within the ...

이 프로토콜을 통해 우리는 휘발성 대사 산물을 쉽게 농축하고 식별 할 수 있으며 다양한 생물학적 샘플에서 미생물 유기체에서 휘발성 물질을 적극적으로 생산할 수 있습니다. VASE는 저풍부 휘발성 물질을 집중시키는 사용자 친화적 인 방법입니다. 필요한 것은 거의 진공 상태의 샘플이며 물리학이 나머지를 수행하도록하십시오.임상 샘플의 휘발성 분석에 대한 접근은 다수의 상이한 질병 상태에서의 대사 바이오마커 발견에 중요한 함의를 갖는다. 예를 들어, 병원체 운전 및 감염 또는 항균 요법의 성공은 타액, 객담 또는 호흡 샘플의 휘발성 분석으로 검출 될 수 있습니다. 분변 샘플을 준비하려면 1.5 밀리리터 마이크로 원심분리 튜브에서 100 밀리그램의 분변에 1 밀리리터의 탈이온수를 넣고 3 분 동안 와류하십시오.사용하지 않을 때는 샘플을 얼음 위에 보관하십시오. 20 밀리몰 13C 포도당 또는 30 % 중수소의 BHI가있는 BHI 배지 485 밀리리터를 분변 및 물 혼합물 15 마이크로 리터에 첨가하여 샘플의 최종 부피가 500 마이크로 리터가되도록하십시오. 기술 삼중으로 샘플을 준비하십시오.하수 샘플을 준비하려면 1 밀리리터의 총 부피에 대해 13C 포도당 또는 30 % 중수소가있는 BHI 배지 500 마이크로 리터에 500 마이크로 리터의 하수를 첨가하십시오. 샘플을 삼중으로 준비하고 얼음 위에 보관하십시오. 타액 샘플을 준비하려면 50 마이크로 리터의 타액을 13C 포도당이있는 BHI 배지 500 마이크로 리터 또는 30 % 중수소에 첨가하여 총 부피 550 마이크로 리터.샘플을 삼중으로 준비하고 얼음 위에 보관하십시오. 가래 샘플을 준비하려면 가래 15 마이크로 리터를 바이알에 넣으십시오. 샘플을 삼중으로 준비하고 얼음 위에 보관하십시오.차가운 접시에 빈 VOA 바이알을 놓고 차가운 접시를 생물 안전 후드의 얼음 위에 놓습니다. 5600 SPEU를 켜고 필요한 온도로 조정하십시오. 샘플, 반복실험 및 HSP ID에 따라 20밀리리터 VOA 바이알에 라벨을 붙이고, 얼음 위에서 바이알 외부에 결로가 형성될 경우 물에 저항하는 내수 마커를 사용합니다.생물 안전 후드 내부에서 바이알의 흰색 캡을 풀고 신속하게 피펫 샘플을 바이알에 넣고 뚜껑 라이너, 블랙 캡 및 HSP를 조립하십시오. 샘플 및 HSP가 들어있는 바이알을 다시 차가운 플레이트 위에 놓습니다. 모든 샘플이 유리 바이알에 준비되면 진공 펌프를 켜고 바이알을 진공 아래에 놓고 진공 소스를 제거하십시오.압력 게이지를 사용하여 모든 샘플을 진공 하에 놓은 후 압력을 다시 확인하십시오. 바이알이 새는 경우 뚜껑이 단단히 조여져 있고 HSP 및 뚜껑 라이너의 흰색 O 링이 올바르게 제자리에 있는지 확인하십시오. 바이알을 200RPM에서 교반하면서 최적화된 시간과 온도를 위해 SPEU에 넣습니다.섭씨 70도에서 1시간 동안 배양물을 추출하고 섭씨 37도에서 18시간 동안 분변, 하수, 타액 및 객담 시료로 안정한 이소타입 프로빙 실험을 추출한다. 추출 기간이 완료된 후 사용하기 위해 차가운 접시를 영하 80도에 놓습니다. 추출이 완료되면 샘플을 차가운 접시에 15 분 동안 올려 HSP 및 바이알 헤드 스페이스에서 수증기를 뽑은 다음 HSP를 슬리브로 옮깁니다.Entech 소프트웨어에서 샘플 시퀀스를 설정합니다. 프로그램을 열고 계측기 드롭다운 메뉴의 오른쪽에 있는 옵션에서 5800 및 시퀀스를 선택합니다. 시퀀스 테이블을 저장하고 왼쪽에서 실행을 선택한 다음 빈 HSP가 탈솔버가 아닌 경우 Desorber에서 공백으로 시작을 선택합니다.HSP는 시퀀스의 각 샘플에 대해 SPR에 의해 처리됩니다. SPR을 예열하십시오. SPR이 모든 샘플을 자동으로 실행하도록 허용합니다.GC-MS 측의 시퀀스는 자동으로 별도의 파일에 데이터를 기록합니다. 보정을 선택한 다음 외부 표준 컴파운드 아래에서 컴파운드, 이름 및 삽입 컴파운드 편집을 선택하여 처리 방법에 피크를 추가합니다. 화합물의 이름, 체류 시간 및 양자 신호 표적 이온을 추가하십시오.75% 이상의 확률을 갖는 화합물을 포함하는 세 개의 가장 큰 피크를 추가하여 화합물의 각 식별 이온의 정렬이 피크의 중심 내에 위치하도록 합니다. 확인을 선택한 다음 방법 및 저장을 선택하여 저장합니다. 프로세스 메소드가 설정되면 정량 및 계산으로 진행한 다음 결과 보기 및 QEDIT 수량 결과로 진행하여 데이터를 정량화합니다.여기에서, 진공 보조 흡착제 추출에 이어 GC-MS에서 열 탈착하여 박테리아 모노 및 공동 배양의 휘발성 프로파일을 조사하고 인간 분변, 타액, 하수 및 객담 샘플로부터 안정한 동위원소 프로빙을 통해 활발히 생산된 휘발성 물질을 확인했다. 모노 및 공동 배양은 박테리아 종 포도상 구균, 슈도모나스 aeruginosa, 및 acinetobacter baumannii로 구성되었습니다. 43개의 주석이 달린 휘발성 분자가 24시간 및 48시간 시점에서 모노- 및 공동-배양물로부터 검출되었다.중수소에 비해 완전히 표지된 휘발성 분자에 13C가 더 많이 혼입되었다. 13C를 모든 분변, 하수 및 타액 샘플에 대해 2-부타논, 3-히드록시, 2,3-부탄디온 디아세틸, 아세트산 및 페놀에 혼입시켰다. 아세톤, 부탄산 및 프로파노산은 타액 및 하수구에서 표지된 것으로 검출되었다.반면 디메틸 트리설파이드 및 디술피드 디메틸은 분변 및 타액 샘플 둘 다에서 풍부하였다. 휘발성 물질을 1-프로판올, 2-부타논, 벤조페논, 에탄올 및 메틸티올 아세테이트는 하수에만 농축하고 타액에서 2,3-펜탄디온을 농축하였다. 중수소는 타액 또는 하수 샘플로부터 휘발성 아세트산, 벤즈알데히드, 4-메틸디메틸트리설파이드 및 페놀에 혼입되었다.아세트산, 디메틸트리설파이드, 아세톤, 및 프로판올 2-메틸은 배양되지 않은 객담 샘플보다 배양된 객담 샘플에서 더 풍부하였다. 변이체, PERMANOVA의 순열 다변량 분석을 낭포성 섬유증 객담 샘플로부터의 휘발성 풍부도의 브레이-커티스 거리 매트릭스 상에서 수행하였다. 우리는 샘플을 기증 한 피험자가 13C 표지 된 배양 객담의 변이의 51 %와 배양되지 않은 가래의 변이의 33 %를 설명한다는 것을 발견했습니다.여기에서, 낭포성 섬유증을 앓고 있는 일곱 명의 사람들로부터 수집된 배양된 객담 샘플로부터의 휘발성 물질에서 13C 글루코스로 안정한 동위원소 표지의 성공이 보여진다. 대부분의 샘플에 대해 더 높은 13C 혼입을 갖는 휘발성 물질은 패널 5A에 도시되어 있고, 대부분의 객담 샘플에서 더 낮은 퍼센트 13C 혼입을 갖는 휘발물질은 패널 5B에 있고, 가래 샘플의 소수에서 더 낮은 13C 퍼센트 변환을 갖는 분자는 패널 5C에 도시되어 있다. 항상 약 분 후에 바이알 압력을 다시 확인하십시오.깨진 진공은 VASE 방법의 감도와 속도를 무너뜨립니다. 이 절차에 따라, 안정한 동위원소 프로빙이 수행되면, DNA는 휘발성 분자의 생산에 기여했을 수 있는 미생물 유기체 또는 종을 확인하기 위해 나머지 물질로부터 추출될 수 있다. 이 방법은 동위원소 프로빙이 없는 모든 샘플 유형으로부터 휘발성 물질을 검출하는데 또한 유용하다.감도와 낮은 샘플 부피의 장점으로 많은 응용 프로그램이이 기술의 이점을 누릴 수 있습니다.

capturing-actively-produced-microbial-volatile-organic-compounds-from

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

보조 전기 분무 이온화 질량 분석계 (SESI - MS)은 샘플 전처리가 필요하지 않고 휘발성 유기 화합물 (휘발성 유기 화합물)의 검출이 가능합니다. 이 프로토콜은 SESI - MS를 사용하여 세균 휘발성 유기 화합물의 급속한 (분 이내) 특성화하기위한 지침을 제공합니다.

보조 전기 분무 이온화 질량 분석법 (SESI - MS)를 사용하여 특성화 세균 휘발성 물질

Proton Transfer Reaction Time of Flight 질량 분석기를 사용하면 휘발성 유기 화합물의 고감도, 신속 및 비침습적 분석을 수행할 수 있습니다. 그 잠재력을 입증하기 위해 요구르트의 젖산 발효(온라인 바이오프로세스 모니터링), 다양한 사과 유전자형(대규모 스크리닝) 및 커피 마신 후 후비강 공간(노즈스페이스 분석)의 세 가지 예를 제공합니다.

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우리는 동물 통신에서 어떻게 사용될 수 있는지 이해하기 위해 악취 신호를 샘플링하고 분석하기위한 효과적인 방법론을 개발했습니다. 특히, 우리는 동물 냄새와 향기 표시의 휘발성 성분을 분석하기 위해 가스 크로마토그래피 질량 분석과 결합 된 헤드 스페이스 고체 위상 미세 추출을 사용합니다.

동물 향 신호 샘플링 및 분석

총 기화 고체 위상 미세 추출(TV-SPME)은 액체 샘플을 완전히 기화하고 분석체는 SPME 섬유에 스며들게 됩니다. 이를 통해 용매 증기와 SPME 섬유 코팅 사이에만 해석물을 분할할 수 있습니다.

가스 크로마토그래피 질량 분광법은 토탈 기화 고체-위상 미세 추출과 결합하여 법의학 도구로 사용됩니다.

헤드스페이스 고형 미세 추출 가스 크로마토그래피 플랫폼은 잘 익은 블랙커런트 과일의 빠르고 신뢰할 수 있으며 반자동 휘발성 식별 및 정량화를 위해 여기에 설명되어 있습니다. 이 기술은 과일 향에 대한 지식을 높이고 번식을 목적으로 향상된 맛으로 품종을 선택하는 데 사용할 수 있습니다.

헤드스페이스 고체-위상 미세 추출을 사용하여 블랙커런트 과일의 휘발성 화합물 프로파일링

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배우세요 진공 보조 흡착제 추출(VASE)과 GC-MS를 활용하여 인간 관련 샘플에서 미생물이 활발히 생산하는 휘발성 유기 화합물을 포착하고 분석하는 방법입니다. 이 기술은 생물학적 표지자 발견과 미생물 대사 연구에 활용됩니다.

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