Name: 생체외 전사에 대한 활성 Caenorhabditis elegans 핵 추출물 및 재구성의 고립 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 9 s
Description: 배우세요 Caenorhabditis elegans에서 기능적으로 활성화된 핵 추출물을 분리하는 생화학적 방법을. Balch 균질화기를 사용하여 생체외 전사 활성을 시각화하고 유전자 발현 연구에 활용할 수 있습니다.

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<ol><li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Transparent+window+into+biology%3A+A+on+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A Transparent window into biology: A on Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).</li>
<li>Blackwell, T. K., Walker, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%3A+The+Online+Review+of+C.+elegans+Biology%22%5BJournal%5D)">Transcription mechanisms.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , Pasadena, CA. 1-16 (2006).</li>
<li>Page, A. P., Johnstone, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cuticle%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%3A+The+Online+Review+of+C.+elegans+Biology%22%5BJournal%5D)">The cuticle.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , Pasadena, CA. 1-15 (2007).</li>
<li>Lichtsteiner, S., Tjian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+properties+of+the+Caenorhabditis+elegans+TATA-box-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cloning and properties of the Caenorhabditis elegans TATA-box-binding protein.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (20), 9673-9677 (1993).</li>
<li>Lichtsteiner, S., Tjian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+activation+of+transcription+by+UNC-86+and+MEC-3+in+Caenorhabditis+elegans+embryo+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Synergistic activation of transcription by UNC-86 and MEC-3 in Caenorhabditis elegans embryo extracts.</a> EMBO Journal. 14 (16), 3937-3945 (1995).</li>
<li>Shan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isotope-labeled+immunoassays+without+radiation+waste%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Isotope-labeled immunoassays without radiation waste.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (6), 2445-2449 (2000).</li>
<li>Voss, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel%2C+non-radioactive+eukaryotic+in+vitro+transcription+assay+for+sensitive+quantification+of+RNA+polymerase+II+activity%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A novel, non-radioactive eukaryotic in vitro transcription assay for sensitive quantification of RNA polymerase II activity.</a> BMC Molecular Biology. 15, 7(2014).</li>
<li>Wibisono, P., Liu, Y., Sun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+in+vitro+Caenorhabditis+elegans+transcription+system%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Molecular+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A novel in vitro Caenorhabditis elegans transcription system.</a> BMC Molecular and Cell Biology. 21 (1), 87(2020).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%3A+The+Online+Review+of+C.+elegans+Biology%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , Pasadena, CA. 1-11 (2006).</li>
<li>Zbacnik, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+buffers+in+protein+formulations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Role of buffers in protein formulations.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 106 (3), 713-733 (2017).</li>
</ol>

저자는 공개 할 경쟁 이익이 없습니다.

C. elegans 는 저비용 유지 보수와 유전 조작의 용이성 으로 인해 진핵 전사 시스템을 연구하는 매력적인 모델 유기체입니다. 여기서 L4 C. elegans 로부터 기능적으로 활성 핵 추출물의 일관된 절연을 위한 프로토콜이 설명된다. 이 프로토콜은 전사 활성을 시각화하는 데 초점을 맞추고 있지만, 전사 후 생성된 cDNA는 RT-qPCR을 사용하여 전사 활성8의 보다 정밀한 측정을 얻을 수 있다. C. elegans 에서 핵 단백질을 분리하는 이 방법은 진핵 전사 기계의 연구를 확장하는 데 도움이 될 수 있습니다. C. elegans 는 요리나 효모 식민지에 있는 세포의 문화가 아니라 자유 로밍 동물이기 때문에 핵 추출물을 고립시키고 연구하는 것은 전사 기계가 시간이 지남에 따라 또는 다양한 환경에서 어떻게 변할 수 있는지에 대한 명확한 통찰력을 줄 수 있습니다. 이를 통해 연구자들은 C. elegans</em...

작고 자유로운 선충 인 Caenorhabditis elegans 는 광범위한 생물학적 질문을 해결하기위한 간단하면서도 강력한 모델 유기체입니다. 1963년에 도입된 이래, 선충은 신경생물학, 신진대사, 노화, 발달, 면역 및 유전학1에 있는 질문에 대답하는 데 귀중했습니다. 이상적인 모델 유기체를 만드는 동물의 많은 특성 중 일부는 짧은 세대 시간, RNA 간섭의 효과, 투명한 신체 및 세포 혈통과 신경계 의 완성 된지도를 포함합니다.
과학에 대한 선충의 기여는 광대하지만, 그들은 효모, 과일 파리 및 포유류 세포 배양2에서 핵 추출물을 사용하여 연구에서 오는 이러한 메커니즘에 대한 우리의 이해의 대부분과 함께, 진핵 전사 시스템을 해명하기 위해 활용되었습니다. 기능성 핵 추출물추출에서 연구원을 설득하는 가장 큰 장애물은 선충의 거친 외부 표피입니다. 이 외골격은 교차 연결된 콜라겐, 큐티클린, 당단백질 및 지질을 포함하며, 화학적 또는 기계적 힘을 통한 단백질 추출에 내성이 있는 성년기에 이르기까지 C. 엘레간을 만듭니다3. C. elegans 핵 추출물을 이용한 체외 전사 시스템은 한때 개발되었지만 시스템의 제한된 범위로 인해 널리 채택되지 않았으며, 추출물을 준비하기 위한 두스균제의 사용은 단백질 불안정성으로 이어질 수 있다4,5.
C. elegans를 깨기 위해 Dounce 균질화제를 활용한 핵 추출물 격리를 위한 이전 프로토콜과 달리 이 프로토콜은 발치 균질화제를 사용합니다. 발치 균질화는 텅스텐 초경 공과 한쪽 끝에서 다른 끝까지 지루하게 채널이있는 스테인레스 스틸 블록의 두 가지 주요 구성 요소로 구성됩니다. 발치 균질화는 텅스텐 초경 공으로 로드되고 분쇄 챔버를 밀봉하기 위해 양쪽에 덮여있다. 주사기는 연삭 챔버로 이어지는 두 개의 수직 포트에 로드할 수 있습니다. 재료가 분쇄 챔버를 통해 다른 주사기에서 다른 주사기에서 전달될 때, 주사기의 압력은 공과 챔버의 벽 사이의 좁은 간격을 통해 재료를 강제로. 이 느리고 일정한 압력은 좁은 틈새를 쉽게 통과할 수 있는 일관된 크기에 도달할 때까지 재료를 분해합니다. 일정한 압력을 통해 좁은 간격을 통해 C. elegans를 강제로 동물을 열어, 주변 버퍼로 자신의 내용을 해제. 볼 크기를 전환하면 간격이 더욱 강화되어 새로 방출된 세포를 깨고 핵을 완충제로 풀어 놓습니다. 원심분리의 여러 인스턴스는 핵을 세포 잔해의 나머지 부분과 분리하여 깨끗한 핵 추출물의 수집을 허용합니다. 발치 균질화는 여러 가지 이유로 Dounce 균질화보다 선호됩니다 : 시스템은 한 번의 시도에서 높은 양의 활성 단백질을 추출 할 수 있도록 많은 수의 동물을 처리 할 수 있습니다. 공과 강철 블록의 정확한 가공은 여러 샘플 사이의 일관된 연삭을 허용합니다. 무거운 강철 블록은 방열판 역할을하며 연삭 챔버에서 균일하게 열을 끌어 들여 데칭을 방지합니다.
격리 후, 핵 추출물 전사 활성은 생화학 적 실험에 사용되기 전에 검증되어야합니다. 전통적으로, 전사 활성은 방사성 표지된 뉴클레오티드를 사용하여 측정하여 새로 합성된 RNA를 추적하고 시각화하였다. 그러나 방사성 라벨은 사용 및 폐기 시 예방 조치가 필요하기 때문에 부담스러울 수 있습니다6. 기술 발전은 오늘날 연구원들이 훨씬 덜 유해하거나 번거로운 방법을 사용하여 정량적 실시간 PCR (qRT-PCR)7과 같은 기술을 사용하여 소량의 RNA 양을 측정 할 수 있게합니다. 여기서, 프로토콜은 애벌레 단계 4 (L4) C. elegans 에서 활성 핵 추출물을 분리하고 체외 시스템에서 전사 활성을 시각화하는 방법을 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>Consumables and reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2 mL 8-Strip 튜브 & 플랫 스트립 캡, 클리어</td><td>Genesee Scientific</td><td>&nbsp; 24-706</td><td></td></tr><tr><td>0.2 mL 개별 PCR 튜브</td><td>Genesee Scientific</td><td>&nbsp; 24-153G</td><td></td></tr><tr><td>1.7 mL 멸균 마이크로튜브</td><td>Genesee Scientific</td><td>24-282S</td><td></td></tr><tr><td>100% 절대 분자 등급 에탄올</td><td>Fisher Scientific</td><td>&nbsp; BP2818</td><td></td></tr><tr><td>100% 에탄올, Koptec</td><td>Decon Labs</td><td>&nbsp; V1001</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 혈청학적 피펫</td><td>VWR international</td><td>&nbsp; 89130-898</td><td></td></tr><tr><td>150mm 페트리 플레이트</td><td>Tritech Research</td><td>&nbsp; T3325</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 원추형 원심분리기 튜브</td><td>Genesee Scientific</td><td>&nbsp; 28-103</td><td></td></tr><tr><td>20 mL 플라스틱 주사기</td><td>Fisher Scientific</td><td>14955460</td><td></td></tr><tr><td>2 mL Norm-Ject 주사기</td><td>Henke-Sass Wolf GmbH</td><td>4020</td><td></td></tr><tr><td>500 mL 진공 필터 컵 0.22 &micro; m PES, Stericup Millipore Express Plus</td><td>Millipore Sigma</td><td>SCGPU10RE</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 원추형 원심분리기 튜브</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 혈청학 피펫</td><td>VWR international</td><td>&nbsp; 89130-902</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 혈청학적 피펫</td><td>VWR 국제</td><td>&nbsp; 89130-896</td><td></td></tr><tr><td>한천, Criterion</td><td>VWR International</td><td>&nbsp; C7432</td><td></td></tr><tr><td>아가로스</td><td>덴빌 사이언티픽</td><td>&nbsp; CA3510-6</td><td></td></tr><tr><td>알코올 방지 마커</td><td>VWR International</td><td>&nbsp; 52877-310</td><td></td></tr><tr><td>Bacto 펩톤</td><td>VWR International</td><td>&nbsp; 90000-264</td><td></td></tr><tr><td>Caenorhabditis elegans</td><td>CGC</td><td>N2</td><td></td></tr><tr><td>칼슘 디클로라이드</td><td>Millipore Sigma</td><td>&nbsp; C4901</td><td></td></tr><tr><td>콜레스테롤</td><td>밀리포어 시그마</td><td>&nbsp; C8667</td><td></td></tr><tr><td>통제 DNA 사원 클로닝 뇌관, 앞으로 5'- ctc atg ttt gac agc tta tcg atc cgg gc -3'</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>통제 DNA 사원 클로닝 뇌관, 앞으로 5' - aca gga cgg gtg tgg tcg cca tga t -3'</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>탈이온수</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Invitrogen</td><td>&nbsp; 15508-013</td><td></td></tr><tr><td>DNA 겔 염색, SYBR 안전</td><td>Invitrogen</td><td>&nbsp; S33102</td><td></td></tr><tr><td>DNA 래더 믹스, O' 유전자 통치자</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>&nbsp; SM1173</td><td></td></tr><tr><td>DNA 로딩 염료, 6x TriTrack</td><td>Fisher Scientific</td><td>&nbsp; </td><td></td>FERR1161</tr><tr><td>DNase, Baseline-ZERO</td><td>Lucigen</td><td>&nbsp; </td><td></td>DB0715K</tr><tr><td>드라이 아이스</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli OP50 균주</td><td>CGC</td><td>OP50</td><td></td></tr><tr><td>빙하 아세트산</td><td>Fisher Scientific</td><td>&nbsp; A38</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>밀리포어 시그마</td><td>&nbsp; G6279</td><td></td></tr><tr><td>HeLa 핵 추출물 체외 전사 시스템, HeLaScribe</td><td>Promega</td><td>&nbsp; E3110</td><td></td></tr><tr><td>헤페스 용액, 1 M Gibco</td><td>밀리포어 시그마</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>염산 37%</td><td>밀리포어 시그마</td><td>&nbsp; P0662</td><td></td></tr><tr><td>차아염소산염 표백제</td><td>Clorox</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB 육수</td><td>Millipore 시그마</td><td>&nbsp; L3022</td><td></td></tr><tr><td>마그네슘 디클로라이드</td><td>밀리포어 시그마</td><td>&nbsp; M8266</td><td></td></tr><tr><td>황산 마그네슘</td><td>밀리포어 시그마</td><td>&nbsp; M7506</td><td></td></tr><tr><td>중형 접시</td><td>Fisher Scientific</td><td>&nbsp; 02-202-101</td><td></td></tr><tr><td>현미경 슬라이드, Vista vision</td><td>VWR International</td><td>16004-368</td><td></td></tr><tr><td>분자 등급 물, Hypure</td><td>Hyclone Laboratories</td><td>&nbsp; </td><td></td>SH30538</tr><tr><td>니스타틴</td><td>밀리포어 시그마</td><td>&nbsp; N1638</td><td></td></tr><tr><td>PCR 시스템, 프리믹스 A Lucigen을 사용한 FailSafe</td><td></td><td>&nbsp; </td><td></td></tr><tr><td>FS99100 염화칼</td>륨 <td>Millipore Sigma</td><td>&nbsp; P39111</td><td></td></tr><tr><td>인산칼륨 이염기성</td><td>밀리포어 시그마</td><td>&nbsp; P3786</td><td></td></tr><tr><td>인산칼륨 일염기성</td><td>밀리포어 시그마</td><td>&nbsp; P0662</td><td></td></tr><tr><td>프로테아제 억제제, 일회용 칵테일 100x</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>78430</td><td></td></tr><tr><td>단백질 분석 키트, Qubit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>&nbsp; Q33211</td><td></td></tr><tr><td>역전사 키트, Sensiscript</td><td>Qiagen</td><td>205211</td><td></td></tr><tr><td>RNA 추출 키트 RNeasy 마이크로 키트</td><td>Qiagen</td><td>74004</td><td></td></tr><tr><td>RNase 억제제</td><td>응용 바이오시스템</td><td>&nbsp; </td><td></td>N8080119</tr><tr><td>염화나트륨</td><td>VWR International</td><td>&nbsp; BDH9286-12KG</td><td></td></tr><tr><td>수산화나트륨</td><td>밀리포어 시그마</td><td>&nbsp; 1-09137</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &micro를 이용한 멸균 주사기 필터; m 폴리에테르설폰 멤브레인</td><td>VWR 국제</td><td>28145-501</td><td></td></tr><tr><td>자당</td><td>VWR 국제</td><td>&nbsp; 200-334-9</td><td></td></tr><tr><td>전사 프라이머, 앞으로 5'- gcc ggg cct ctt gcg gga tat -3'</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>전사 프라이머, 리버스 5'- cgg cca aag cgg tcg gac agt-3'</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>트리스 베이스</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>&nbsp; BP152</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>밀리포어 시그마</td><td>&nbsp; P2287</td><td></td></tr><tr><td>장비</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>-20 &deg; C 인큐베이터</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 &deg; C 인큐베이터</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 &deg; C 인큐베이터</td><td>Forma Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 &deg; C 냉장고</td><td>ThermoFisher Scientific-80</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>&deg; C freezer</td>, <td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Autoclave</td>, <td>Sanyo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Balch, 균질화기, isobiotec 세포 균질화기,</td><td>Isobiotec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Benchtop Vortexer</td>, <td>Fisher</td><td>Scientific</td> 2215365 <td></td></tr><tr><td>원심분리기, Eppendorf 5418 R</td>, <td>Eppendorf</td><td>5401000013</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기, VWR Clinical 50</td>, <td>VWR International</td><td>82013-800</td><td></td></tr><tr><td>해부 현미경, Leica M80</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>형광계, Qubit 2.0</td><td>Invitrogen</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>Gel 이미징 시스템, iBright FL1500</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>&nbsp; A44241</td><td></td></tr><tr><td>젤 시스템</td><td>, ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>열 블록</td>, <td>VWR International</td><td>, 12621-048</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기, Eppendorf 5424</td>, <td>Eppendorf</td><td>22620401</td><td></td></tr>, <tr><td>PIPETBOY acu 2</td>, <td>Integra</td><td>155017</td><td></td></tr>, <tr><td>피펫, L-1000, XLS+, Pipet-Lite LTS</td>, <td>Rainin</td><td>17014382</td><td></td></tr><tr><td>피펫 L-10 XLS+, Pipet-Lite LTS</td>, <td>Rainin</td><td>17014388</td><td></td></tr><tr><td>, 피펫 L-200 XLS+, Pipet-Lite LTS</td>, <td>Rainin</td><td>17014391</td><td></td></tr>, <tr><td>피펫 L-20 XLS+, Pipet-Lite LTS</td>, <td>Rainin</td><td>17014392</td><td></td></tr><tr><td>Rocking platform</td><td>VWR International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler, Eppendorf Mastercycler Pro</td>, <td>Eppendorf</td><td>950030010</td><td></td></tr></tbody></table>

생체외 전사에 대한 활성 caenorhabditis elegans 핵 추출물 및 재구성의 고립

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Caenorhabditis elegans는 1963년에 도입된 이래 생물학 연구를 위한 중요한 모형 시스템이었습니다. 그러나, C. elegans는 체외 전사 및 DNA 복제와 같은 핵 추출물을 사용하여 생물학적 반응의 생화학 연구에서 완전히 활용되지 않았습니다. 생화학 연구에서 C. elegans를 사용 하 여 중요 한 장애물은 핵 추출 물의 활동을 희생 하지 않고 선충의 두꺼운 외부 큐 티 클을 방해. 여러 가지 방법은 Dounce 균질화 또는 초음파 처리와 같은 표피를 깨는 데 사용되지만 종종 단백질 불안정으로 이어질 수 있습니다. 체외 반응에 대한 애벌레 또는 성인 C. elegans에서 활성 핵 단백질을 격리하기위한 확립 된 프로토콜이 없습니다. 여기서, 프로토콜은 발치 균질화제를 사용하여 애벌레 단계 4 C. elegans의 균질화를 자세히 설명합니다. 발치 균질화는 압력을 사용하여 동물을 천천히 좁은 틈새를 통해 동물을 강제로 밀어 내어 그 과정에서 큐티클을 깨뜨린다. 발치 균질화제의 균일한 디자인과 정밀한 가공은 실험 사이에 동물의 일관된 분쇄를 가능하게 합니다. 발치 균질화로부터 얻은 균질화는 C. 예르건의 전사 활성을 속이는 시험관 내 방법으로 사용될 수 있는 기능적으로 활성 핵 추출물을 산출한다.

설명된 단계에 따라 기능성 핵 추출물 (그림 1)을 산출해야 하며, 연삭 또는 세척 단계의 편차는 활동이 좋지 않거나 수율이 낮을 수 있습니다. 기능성 C. elegans 핵 추출물이 얻어지면, 이전에 기술된 시험관 분석 에 추가될 때 DNA 템플릿상CMV 프로모터의 하류 영역을 전사한다. 결과 RNA 전사체는 종래의 방법을 사용하여 핵 단백질 및 DNA 템플릿으로부터 정제될 수 있다. 템플릿 DNA없이, 역 전사 및 후속 PCR 제품은 핵 추출물에 의해 전사 된 RNA의 결과일 수 있습니다. PCR 제품은 아가로즈 젤상에서 시각화될 수 있으며, DNA 대역의 강도는 핵단백질 및 RNA 절연의 품질을 나타낼 수 있다. 약한 대역 강도는 열 또는 완충 제고불량에 의해 핵 추출물의 불활성화에 의해 발생할 수 있다. 지나치게 강한 대역 강도는 RNA 정화 불량 또는 부적절한 DNase 소화...

여기서는 애벌레 4C. 예르간 에서 활성 핵 추출물을 분리하고 체외 시스템에서 전사 활동을 시각화하기 위한 상세한 프로토콜을 설명합니다.

생체외 전사에 대한 활성 Caenorhabditis elegans 핵 추출물 및 재구성의 고립

Caenorhabditis elegans has been an important model system for biological research since it was introduced in 1963. However, C. elegans has not been fully ...

이 프로토콜은 C.elegans의 생화학 연구를 위한 기술적인 격차를 채우고 모형 유기체로 그들의 유용성을 확장합니다. 이 기술은 간단하고 견고하며 기능적으로 활성 C.elegans 핵 추출물을 일관되게 격리할 수 있습니다. 먼저 동기화된 L1 동물을 10 150mm 선충 성장 미디어 함유 플레이트에 Escherichia coli OP50으로 시드하고, 동물이 L4 단계에 도달할 때까지 섭씨 20도에서 48시간 동안 성장할 수 있도록 합니다.저근상 및 고독 완충제가 준비되면 70%에탄올로 분쇄챔버를 범람하여 발치 균질화제를 청소하십시오. 그런 다음 여분의 에탄올을 제거하기 위해 탈이온 된 물로 챔버를 헹구는 다. 텅스텐 초경 공을 연삭 챔버에 삽입합니다.발치 균질화의 배럴 의 끝을 캡, 제공된 엄지 나사와 캡을 확보. 그런 다음 텍스트 원고에 설명된 대로 샘플당 완전한 저혈압 및 고독 버퍼 5밀리리터를 준비합니다. 다음으로 멸균, 완전한 저혈압 완충제 1밀리리터로 2밀리리터 주사기를 채우고 발치 균질화제의 연삭 챔버를 부드럽게 플러시하여 약 500마이크로리터의 완전한 저혈압 버퍼를 챔버에 남깁니다.플러시 균질화제를 얼음위에 보관하고 30분 동안 식힙니다. 15밀리리터 원물 튜브에서 M9 버퍼로 잘 먹인 L4 동물을 수집하고, 동물을 3분 동안 1, 000배 g에서 원심분리합니다. 상체를 제거하고, 상체가 명확해질 때까지 동물 펠릿을 계속 씻는다.다음으로 차가운 저혈압 완충제 의 세 밀리리터와 원심 분리기로 동물을 씻어 설명대로 다시 씻어. 상체 저혈압 버퍼를 제거한 후 동물 펠릿에 완전한 저혈압 버퍼 1 밀리리터를 추가하고 동물 현탁액을 새로운 멸균 2 밀리리터 주사기로 옮직합니다. 얼음 위에 보관된 동물을 균질화하기 위해 텅스텐 볼이 들어있는 발치 균질화제의 분쇄 챔버를 부드럽게 밀어 넣습니다.그런 다음 동물을 주사기에 다시 모으고이 절차를 30 번 반복하십시오. 30사이클의 균질화 후 발치 균질화로부터 최대 동물 현탁액을 수집하고, 1.7밀리리터 마이크로튜브 내부에 아래쪽으로 배치된 팁으로 주사기를 보관한다. 텅스텐 공을 제거하고, 탈이온 물로 분쇄 챔버를 청소합니다.건조하고 각각의 레이블튜브에 공을 반환합니다. 그런 다음 7.9880 밀리미터 직경과 12 마이크로미터 갭 클리어런스를 연삭 챔버에 삽입하고 균질화기를 다시 밀봉합니다. 얼음 차가운 완전한 저혈압 버퍼 1 밀리리터로 분쇄 챔버를 다시 플러시하십시오.현탁액을 25회 갈아도. 동물 현탁액을 깨끗한 1.7 밀리리터 마이크로튜브로 옮기고 서스펜션을 얼음 위에 보관합니다. 원심분리에 의해 동물의 몸과 파편을 아래로 펠릿.피펫 40 마이크로리터는 입력 분수로 표시된 튜브에 상체40 마이크로리터를 저장하고 얼음에 분획을 저장합니다. 펠릿을 방해하지 않고 새로운 1.7 밀리리터 튜브로 남은 상체를 옮기고, 원심분리기를 핵을 펠릿으로 옮기다. 그런 다음 펠릿 핵을 방해하지 않고 체세포 분획으로 표시된 새로운 1.7 밀리리터 튜브로 체상화를 전달합니다.핵 펠릿을 세척하려면 펠릿에 완전한 저혈압 완충제 500 마이크로리터를 추가하고 펠릿을 중단하고 원심분리기를 섭씨 4도에서 000배 에서 5분간 첨가합니다. 원심분리가 끝나면, 500마이크로리터의 핵펠릿을 신선한 완전한 저혈압 완충제로 재보중단하고, 다시 시료를 원심분리한다. 그런 다음 펠릿을 완전한 고원완의 40 마이크로리터에 녹입니다.핵 현탁액을 핵 분획으로 표시된 새로운 1.7 밀리리터 튜브로 옮기고 얼음 위에 보관하십시오. 형광 정량화 키트를 사용하여 3분분의 단백질 농도를 결정합니다. 핵 분획을 핵 단백질 6마이크로그램을 포함하는 일회용 튜브에 알리쿼트하고 드라이 아이스와 에탄올 욕조에서 동결을 스냅합니다.추가 사용까지 샘플을 영하 80도까지 보관하십시오. 대표적인 젤 이미지는 CMV 프로모터 DNA 템플릿을 이용한 Caenorhabditis elegans L4 애벌레 핵 추출물의 전사 산물을 보여줍니다. 활성 핵 단백질의 성공적인 격리는 시험관 내 전사 후 132 개의 베이스 페어 밴드가 발생했으며, 실패한 격리는 약한 밴드 또는 밴드의 부재를 초래했습니다.전체 버퍼에 명확하게 레이블을 지정해야 합니다. 부적절한 완충제는 핵 단백질의 기능에 해를 끼칠 수 있습니다. 또한 균질화 얼음을 차갑게 유지하여 단백질의 데마징을 방지합니다.이 기술을 개발하면 연구자들은 스트레스가 많은 조건 동안 C.elegans의 RNA 전사 속도를 측정할 수 있게 되어 환경 조건에 따라 동물의 전사 율이 변경될 수 있음을 보여 주어 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

남성에서 spermatids을 분리하고 활성화하기위한...

분리 및 체외에서</em의> 활성화 Caenorhabditis 엘레간스 정자

이 프로토콜은의 합성 tRNA 기판의 준비에 대해...

Entamoeba histolytica DNA와 tRNA Methyltransferase Dnmt2 (Ehmeth) 효소를 체외 tRNA의 Methylation 분석에서

Microarray 분석은 유전자 표현의 프로필을 결정하기 위해...

의 유전자 표현 프로필 결정 C. 엘레간스 Microarray 및 실시간 PCR을 사용하여

여기에서 우리는 RNA / 단백질 상호 작용을 분석하는 프로토콜을 제시한다. 전기 영동 이동성 변화 분석 (EMSA)이 네이티브 겔 전기 영동시 RNA / 단백질 복합체 및 무료 RNA의 차분에 기초하여 이동된다. 방사성 표지 된 RNA 프로브를 사용함으로써, RNA / 단백질 복합체는 오토 라디오 그래피에 의해 시각화 될 수있다.

IRE / IRP 예 : RNA - 단백질 상호 작용의 연구에 대한 전기 이동 기동성 교대 분석 실험 (EMSA)

이 프로토콜에는 꼬마 선 충에서 vivo에서 세포 운명 변환 중 세포질 과정을 공부 하는 방법을 설명 합니다. 유전자 변형 동물, 신경 운명을 유도 하는 전사 인자 체 1의 열 충격 발기인 구동 overexpression와 염색 질 조절 요소 린-53 세균 세포의 신경 프로그래밍을 고갈 RNAi 중재를 사용 하 여 관찰 될 수 있다 vivo에서.<br...

C. 선 충 에서 신경 세포를 세균 세포를 재 설 정할 RNAi 및 열 충격 유도 하는 전사 인자 식의 적용

Endogenously 구성 된 mRNA 단백질 복합물의 복구에 대 한 협동 RNA 격리 절차 (여행) 설명 되어 있습니다. 특히, RNA-단백질 복합물 가교 된에서 vivo에서, polyadenylated RNAs는 격리 oligo(dT) 구슬, 추출 물 이며 특정 한 mRNAs와 수정 된 RNA 센스 oligonucleotides 캡처됩니다. 단백질 mRNAs에 바인딩된 immunoblot 분석에 의해 검색 됩니다.

진 핵 세포 mRNA 단백질 복합물을 복구 하는 Oligonucleotide 기반 협동 RNA 격리 절차

여기, 선물이 편차를 줄이기 위해, 재현성, 개선 및 해석을 용이 하 게 하기 위해에서 RNA, DNA, 그리고 동일한 샘플에서 단백질의 격리에 대 한 프로토콜.

결합 된 뉴클레오티드와 꼬마 선 충 의 단백질 추출

여기에서, 우리는 형질전환 성 외피염 예쁜꼬마선에서 녹색 형광 단백질을 발현하는 살아있는 뉴런 세포의 특정 그룹의 단순 분리를 위한 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 특정 뉴런에 초점을 맞춘 다양한 생체 내 연구를 가능하게하고 추가 단기 배양세포를 분리 할 수있는 능력을 갖는다.

둥근 벌레 예쁜꼬마선충에서 특정 신경 인구의 격리

이 방법은 Caenorhabditis elegans 샘플 및 후속 공동 면역 침전에서 고처리량 단백질 추출물 제조를 위한 프로토콜을 설명합니다.

카노르하비티스 예르간에서 단백질 추출물 제제 및 공동 면역 침전

여기에 제시된 것은 시판되는 조직 키트를 사용하여 하나 또는 몇몇 동물로부터 예 쁜꼬마선충 게놈 DNA의 간단하고 비교적 신속한 분리에 대한 설명이다. 생성된 gDNA 제제는 PCR에 적합한 주형이다.

Caenorhabditis elegans Genomic DNA의 소규모 추출

본 프로토콜은 Caenorhabditis elegans에 대한 액체 및 온플레이트 배양에서 지질 보충 방법을 설명하고 벌크 또는 소수의 웜 및 웜 조직으로부터의 종단 연구 및 유전자 전사 분석과 결합합니다.

Caenorhabditis elegans의 수명 및 유전자 전사 분석을위한 지질 보충

배우세요 Caenorhabditis elegans에서 기능적으로 활성화된 핵 추출물을 분리하는 생화학적 방법을. Balch 균질화기를 사용하여 생체외 전사 활성을 시각화하고 유전자 발현 연구에 활용할 수 있습니다.

생체외 전사에 대한 활성 Caenorhabditis elegans 핵 추출물 및 재구성의 고립

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