생체외 전사에 대한 활성 Caenorhabditis elegans 핵 추출물 및 재구성의 고립

여기서는 애벌레 4C. 예르간 에서 활성 핵 추출물을 분리하고 체외 시스템에서 전사 활동을 시각화하기 위한 상세한 프로토콜을 설명합니다.

이 프로토콜은 C.elegans의 생화학 연구를 위한 기술적인 격차를 채우고 모형 유기체로 그들의 유용성을 확장합니다. 이 기술은 간단하고 견고하며 기능적으로 활성 C.elegans 핵 추출물을 일관되게 격리할 수 있습니다. 먼저 동기화된 L1 동물을 10 150mm 선충 성장 미디어 함유 플레이트에 Escherichia coli OP50으로 시드하고, 동물이 L4 단계에 도달할 때까지 섭씨 20도에서 48시간 동안 성장할 수 있도록 합니다.

저근상 및 고독 완충제가 준비되면 70%에탄올로 분쇄챔버를 범람하여 발치 균질화제를 청소하십시오. 그런 다음 여분의 에탄올을 제거하기 위해 탈이온 된 물로 챔버를 헹구는 다. 텅스텐 초경 공을 연삭 챔버에 삽입합니다.

발치 균질화의 배럴 의 끝을 캡, 제공된 엄지 나사와 캡을 확보. 그런 다음 텍스트 원고에 설명된 대로 샘플당 완전한 저혈압 및 고독 버퍼 5밀리리터를 준비합니다. 다음으로 멸균, 완전한 저혈압 완충제 1밀리리터로 2밀리리터 주사기를 채우고 발치 균질화제의 연삭 챔버를 부드럽게 플러시하여 약 500마이크로리터의 완전한 저혈압 버퍼를 챔버에 남깁니다.

플러시 균질화제를 얼음위에 보관하고 30분 동안 식힙니다. 15밀리리터 원물 튜브에서 M9 버퍼로 잘 먹인 L4 동물을 수집하고, 동물을 3분 동안 1, 000배 g에서 원심분리합니다. 상체를 제거하고, 상체가 명확해질 때까지 동물 펠릿을 계속 씻는다.

다음으로 차가운 저혈압 완충제 의 세 밀리리터와 원심 분리기로 동물을 씻어 설명대로 다시 씻어. 상체 저혈압 버퍼를 제거한 후 동물 펠릿에 완전한 저혈압 버퍼 1 밀리리터를 추가하고 동물 현탁액을 새로운 멸균 2 밀리리터 주사기로 옮직합니다. 얼음 위에 보관된 동물을 균질화하기 위해 텅스텐 볼이 들어있는 발치 균질화제의 분쇄 챔버를 부드럽게 밀어 넣습니다.

그런 다음 동물을 주사기에 다시 모으고이 절차를 30 번 반복하십시오. 30사이클의 균질화 후 발치 균질화로부터 최대 동물 현탁액을 수집하고, 1.7밀리리터 마이크로튜브 내부에 아래쪽으로 배치된 팁으로 주사기를 보관한다. 텅스텐 공을 제거하고, 탈이온 물로 분쇄 챔버를 청소합니다.

건조하고 각각의 레이블튜브에 공을 반환합니다. 그런 다음 7.9880 밀리미터 직경과 12 마이크로미터 갭 클리어런스를 연삭 챔버에 삽입하고 균질화기를 다시 밀봉합니다. 얼음 차가운 완전한 저혈압 버퍼 1 밀리리터로 분쇄 챔버를 다시 플러시하십시오.

현탁액을 25회 갈아도. 동물 현탁액을 깨끗한 1.7 밀리리터 마이크로튜브로 옮기고 서스펜션을 얼음 위에 보관합니다. 원심분리에 의해 동물의 몸과 파편을 아래로 펠릿.

피펫 40 마이크로리터는 입력 분수로 표시된 튜브에 상체40 마이크로리터를 저장하고 얼음에 분획을 저장합니다. 펠릿을 방해하지 않고 새로운 1.7 밀리리터 튜브로 남은 상체를 옮기고, 원심분리기를 핵을 펠릿으로 옮기다. 그런 다음 펠릿 핵을 방해하지 않고 체세포 분획으로 표시된 새로운 1.7 밀리리터 튜브로 체상화를 전달합니다.

핵 펠릿을 세척하려면 펠릿에 완전한 저혈압 완충제 500 마이크로리터를 추가하고 펠릿을 중단하고 원심분리기를 섭씨 4도에서 000배 에서 5분간 첨가합니다. 원심분리가 끝나면, 500마이크로리터의 핵펠릿을 신선한 완전한 저혈압 완충제로 재보중단하고, 다시 시료를 원심분리한다. 그런 다음 펠릿을 완전한 고원완의 40 마이크로리터에 녹입니다.

핵 현탁액을 핵 분획으로 표시된 새로운 1.7 밀리리터 튜브로 옮기고 얼음 위에 보관하십시오. 형광 정량화 키트를 사용하여 3분분의 단백질 농도를 결정합니다. 핵 분획을 핵 단백질 6마이크로그램을 포함하는 일회용 튜브에 알리쿼트하고 드라이 아이스와 에탄올 욕조에서 동결을 스냅합니다.

추가 사용까지 샘플을 영하 80도까지 보관하십시오. 대표적인 젤 이미지는 CMV 프로모터 DNA 템플릿을 이용한 Caenorhabditis elegans L4 애벌레 핵 추출물의 전사 산물을 보여줍니다. 활성 핵 단백질의 성공적인 격리는 시험관 내 전사 후 132 개의 베이스 페어 밴드가 발생했으며, 실패한 격리는 약한 밴드 또는 밴드의 부재를 초래했습니다.

전체 버퍼에 명확하게 레이블을 지정해야 합니다. 부적절한 완충제는 핵 단백질의 기능에 해를 끼칠 수 있습니다. 또한 균질화 얼음을 차갑게 유지하여 단백질의 데마징을 방지합니다.

이 기술을 개발하면 연구자들은 스트레스가 많은 조건 동안 C.elegans의 RNA 전사 속도를 측정할 수 있게 되어 환경 조건에 따라 동물의 전사 율이 변경될 수 있음을 보여 주어 있습니다.