의 유전자 표현 프로필 결정 C. 엘레간스 Microarray 및 실시간 PCR을 사용하여

이 절차의 전반적인 목표는 수많은 표현형 또는 대사 경로의 기저에 있는 유전자 발현 프로파일을 조사하는 것입니다. 이는 먼저 두 개의 대조되는 선충 균주에서 mRNA를 분리함으로써 달성됩니다. 절차의 두 번째 단계는 S, SI 3 또는 SFI 캡처 서열을 포함하는 CD NA를 합성하고 이를 마이크로어레이로 하이브리드화하는 것입니다.

절차의 세 번째 단계는 마이크로어레이를 S, SI 3 및 SCIFI 플루오로 4를 포함하는 안티 포획 서열과 하이브리드화하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 매직 툴 소프트웨어와 같은 생물 정보학 도구를 사용하여 마이크로어레이를 스캔하고 데이터를 분석하는 것입니다. 궁극적으로 조사 중인 생물학적 현상을 매개하는 후보 유전자가 확인되고 Real-Time PCR과 같은 대체 기술로 검증 및 정량화될 수 있습니다.

일반적으로, 이 방법을 처음 접하는 개인은 점박이 뉴클레오티드가 사용자에게 보이지 않기 때문에 어려움을 겪을 것입니다, 그래서 23, 000 플러스에 균질한 혼성화 혼합물을 겹쳐 놓는 것은 어렵습니다. 고유하게 인쇄된 뉴클레오티드: 건강하게 동기화된 선충에서 RNA를 수집하는 것으로 시작합니다. 첫째, 그들은 15 밀리리터 튜브에 다시 현탁 세척되고 펠릿 웜 펠릿은 0.1 몰 염화나트륨 7 밀리리터와 얼음 차가운 7 밀리리터, 부피 자당 60 % 중량에 재현탁됩니다.

얼음 위에서 15분 동안 배양한 후 벌레를 다시 펠릿으로 만듭니다. 이제 박테리아가 없는 벌레가 헤엄쳐 올라가 수집되고 RNA에서 씻겨지고 자유수이며 펠릿화됩니다. 다시, 깨끗하고 느슨하게 압축된 펠릿은 30초 동안 최대 속도로 회전하는 마이크로 원심분리기 튜브로 옮겨집니다.

흡인하고 나중에 섭씨 4도에서 진행할 준비가 될 때까지 10 부피의 RNA에 보관합니다. 총 RNA 샘플을 준비하려면 준비된 펠릿을 최대 속도로 원심분리하고 슈퍼nat를 버리고 펠릿에 분자 분쇄 수지 한 꼬집을 추가합니다. 그런 다음 유봉을 사용하여 액체 질소를 사용하여 혼합물을 얼립니다.

냉동 웜 현탁액을 미세한 분말 광고로 분쇄하고 연삭 후 분말을 차갑게 유지하기 위해 필요에 따라 액체 질소를 분쇄합니다. 추출물을 얼음 위에 5분 동안 넣습니다. 5분 후, 추출물을 700마이크로리터의 R-L-T-B-M-E 및 472마이크로리터의 100% 에탄올과 혼합합니다.

이제 RNA는 시판되는 키트를 사용하여 생물학적 샘플당 60마이크로리터의 분리된 RNA의 최종 부피까지 분리할 수 있습니다. 진행하기 전에 DNA one으로 처리한 다음 시판되는 RNA 클린업 키트를 사용하여 잠재적인 게놈 DNA 오염을 제거합니다. 60마이크로리터 부피를 암시하여 키트를 완성합니다.

마지막으로, RNA 농도를 결정하고 마이크로어레이 혼성화 전에 글리옥살 샘플 로딩, 염료 및 겔 분석으로 처리하여 RNA의 무결성을 평가합니다.기존의 방법을 사용하여 정제된 RNA를 상용 DNA로 역전사하고, 이는 상업적으로 이용 가능한 키트로 분해된 템플릿에서 정제되고 60마이크로리터의 부피로 암시됩니다. 바다의 우아함을 차단하여 마이크로어레이 혼성화를 시작합니다. 초음파 처리된 연어 정자 DNA가 있는 마이크로어레이 슬라이드 한 시간 후, 막힌 슬라이드를 이중 증류수에 넣고 회전시킵니다.

김 물티슈로 덧대어진 50ml 원뿔형 튜브에서 슬라이드를 말리십시오. 이제 2개의 x 형태 아미드 기반 혼성화 버퍼를 준비합니다. 먼저 섭씨 55도로 10분 동안 예열하여 결정을 완전히 녹입니다.

다음 10, 000 gs에 1 분 동안 그것을 원심분리기하십시오. 다음으로, 25마이크로리터의 CD NA와 25마이크로리터의 혼성화 완충액을 혼합하고 혼합물을 부드럽게 튕깁니다. 이제 믹스를 빠르게 회전시키고 섭씨 80도에서 10분 동안 배양합니다.

배양 후 슬라이드를 건드리지 않고 전체 CDNA 샘플을 마이크로어레이 슬라이드에 조심스럽게 피펫팅합니다. 샘플을 마이크로어레이 슬라이드에 균일하게 퍼뜨립니다. 커버 슬립이 완전히 내려가기 전에 주사기 바늘을 사용하여 커버 슬립을 슬라이드에 부드럽게 내리고 바늘로 다시 위로 당겼다가 내리면 커버 슬립이 부드럽게 제자리에 떨어질 수 있습니다.

이 기술은 기포의 형성을 최소화합니다. 이제 50마이크로리터의 이중 증류수에서 슬라이드 아래의 50리터 원추형 튜브에 슬라이드를 수평으로 놓고 다음날 섭씨 37도에서 밤새 배양하도록 합니다. 두 번째 혼성화는 슬라이드를 세척한 후 잠시 수행됩니다.

SSC에서 여러 번 빛에 민감한 포획 시약과 Antifa 시약을 포함하는 두 번째 버퍼를 동일한 기술을 사용하여 적용한 다음 짧은 배양, 더 많은 세척 및 건조를 수행합니다. 그런 다음 슬라이드를 스캔할 수 있습니다. 이미지는 오픈 소스 매직 도구와 함께 무료 소프트웨어를 사용하여 분석할 수 있습니다.

프로젝트 탭에서 빌드 표현식 프로필 탭 아래에 새 프로젝트를 만들고 저장하고, 이미지 쌍 로드를 선택하고, 빨간색 이미지 파일을 빨간색으로 선택하고 녹색 이미지 파일을 녹색으로 선택합니다. 그런 다음, 빌드 표현식 프로필 탭을 선택합니다. load gene list를 선택하여 GCAT 웹 사이트에서 얻은 C elegance 유전자 목록 파일을 업로드하여 마이크로어레이 이미지를 처리하고 그리드화합니다.

빌드 표현식 프로필 탭을 선택하고 편집 그리드 옵션을 만듭니다. 이제 그리드를 편집합니다. 그리드 수에 48을 사용하고, 각 그리드에 대해 22개 행과 22개의 열을 사용하여 대화 상자를 설정하고, 왼쪽에서 오른쪽으로, 위에서 아래로 지점 번호를 매기도록 선택합니다.

퍼센트 대비 변경을 늘리고 개별 지점을 쉽게 구별할 수 있을 때까지 그리드를 확대합니다. 왼쪽 패널에서 set left top spot(왼쪽 위 지점 설정)을 선택한 다음 왼쪽 위 지점의 중앙을 클릭한 다음 그리드 1에서 오른쪽 위 지점과 맨 아래 행을 클릭하여 그리드를 만듭니다. 왼쪽에서 오른쪽으로, 위에서 아래로 진행하는 48개의 그리드 각각에 대해 이 그리드 절차를 반복합니다.

그런 다음 파일 탭을 선택하여 저장하고 현재 그리드를 한 번 저장된 것으로 저장합니다. 완료됨 탭을 선택하여 해석에서 관련 없는 점을 제거합니다. 빌드 표현식 프로필 탭을 열고 주소 지정 그리드 옵션에서 스팟 플래그 지정을 선택합니다.

이제 줄무늬 반점 또는 배경 형광에 플래그를 지정하고 현재 플래그 저장을 선택하여 저장합니다. 파일 탭에서와 같이 플래그가 지정된 파일은 세그먼트화되어야 합니다. 마지막으로, Expression 탭에서 explore를 선택하여 지정된 인자에 의해 유도되거나 억제된 유전자를 분석합니다.

탐색 대화 상자에서 미세한 유전자 일치 기준을 설정합니다. 2배의 수는 표현이 증가하거나 감소합니다. intensity는 x로 알려져 있으며 X의 값은 표현식 변경의 기준입니다.

X는 유도 유전자에 대해 X보다 큰 최대 값, 억제 유전자에 대해 x보다 작은 최소값 이하로 입력됩니다. 이 실험에서는 염료 스왑 제어가 수행됩니다: 3기 및 4기 유충에서 2개의 독립적인 총 RNA 분리는 녹색 돌연변이 대 적색 야생형으로 교잡되는 반면, 유전자 발현 변화를 확인하기 위해 적색 돌연변이 대 녹색 야생형으로 교잡됩니다. 동일한 절차를 사용하여 3개의 독립적인 총 RNA 분리를 만듭니다. 각 CD NA 샘플에 대해 Real-Time PCR을 수행하고 3개의 하우스키핑 유전자를 대조군으로 사용하여 삼중화합니다. 시연을 위해 다음 결과는 VSM one에서 유도된 유전자 발현을 조사합니다.

AK 1468 돌연변이는 향상된 시냅스를 특징으로 하는 선충 균주로, 마이크로어레이 분석을 수행하기 전에, 추출된 RNA의 품질을 겔 전기영동을 사용하여 확인한다. dase 1 처리 전후에 2개의 온전한 리보솜 소단위체가 존재한다는 것은 마이크로어레이 야생형 CDNA가 빨간색으로, VSM 1 돌연변이 CD NA가 녹색으로 표시된다는 점에서 양호한 RNA 샘플을 나타냅니다. 마이크로어레이당 분석된 48개의 그리드 중 하나에서 각 작은 사각형은 각 어레이에서 단일 인쇄된 올리고뉴클레오티드를 나타내며 각 고유한 올리고뉴클레오티드가 표시됩니다.

4단계 유충에서 분리된 전사체의 마이크로어레이 분석에서 주요 정자 단백질 또는 MSP를 암호화하는 유전자가 VSM 1 돌연변이에서 유도된다는 것이 밝혀지면, 3단계 유충에 대한 마이크로어레이 분석에서도 돌연변이의 동일한 유전자군 내에서 발현 변화가 드러납니다. 테스트. 실시간 PCR 분석에 의한 마이크로어레이의 예측은 M ms P 유전자 계열 MS P 32의 한 구성원이 VSM 1 돌연변이체에서 유도된다는 것을 보여줍니다. 이 데이터는 동일한 RNA 컬렉션에서 Real-Time PCR의 3회 반복 평균을 나타냅니다.

이 비디오를 시청한 후에는 특히 과학계에서 사용할 수 있는 많은 오픈 소스 생물정보학 소프트웨어 프로그램이 있다는 점을 고려할 때 게놈 전체 분석을 위한 생물정보학 도구를 처리하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.