Name: 의 유전자 표현 프로필 결정 C. 엘레간스 Microarray 및 실시간 PCR을 사용하여 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: 배우세요 C. elegans 유전자 발현 프로파일링을 마이크로어레이와 실시간 PCR로 수행하는 방법을. 이 기술은 후보 유전자를 식별하고 생물학적 현상을 검증하는 데 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 작품은 사우스 웨스턴 오클라호마 주립 대학, 웨더 확인에서 학부 학생들이 수행되었다. 이 작품은 루이 NSF - 0963258, NIH OK - INBRE 2P20RR016478, GCAT 및 OCAST HR09 - 137S에 의해 지원되었다. vsm1 (ok1468) 돌연변이가 오클라호마 진 넉아웃 컨소시엄에 의해 고립되었다. 저자는 프로젝트 수행 중에 귀중한 도움을 댄 Stefanovic와 태너 휠러 감사드립니다.

<ol><li>Chai, A., Withers, J., Koh, Y. H., Parry, K., Bao, H., Zhang, B., Budnik, V., Pennetta, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hVAPB%2C+the+causative+gene+of+a+heterogeneous+group+of+motor+neuron+diseases+in+humans%2C+is+functionally+interchangeable+with+its+Drosophila+homologue+DVAP-33A+at+the+Neuromuscular+Junction%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">hVAPB, the causative gene of a heterogeneous group of motor neuron diseases in humans, is functionally interchangeable with its Drosophila homologue DVAP-33A at the Neuromuscular Junction.</a> Hum Mol Genet. 17, 266-280 (2008).</li>
<li>Tsuda, H., Han, S. M., Yang, Y., Tong, C., Lin, Y. Q., Mohan, K., Haueter, C., Zoghbi, A., Harati, Y., Kwan, J., Miller, M., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Amyotrophic+Lateral+Sclerosis+8+protein+VAPB+is+cleaved%2C+secreted%2C+and+acts+as+a+ligand+for+Eph+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Amyotrophic Lateral Sclerosis 8 protein VAPB is cleaved, secreted, and acts as a ligand for Eph receptors.</a> Cell. 133, 963-977 (2008).</li>
<li>Dresbach, T., Torres, V., Wittenmayer, N., Altrock, W. D., Zamorano, P., Zuschratter, W., Nawrotzki, R., Ziv, N. E., Garner, C. C., Gundelfinger, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+Active+Zone+Precursor+Vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Assembly of Active Zone Precursor Vesicles.</a> Journal of Biological Chemistry. 281, 6038-6047 (2005).</li>
<li>Lustgarten, V., Gerst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+VSM1+Encodes+a+v-SNARE+Binding+Protein+That+May+Act+as+a+Negative+Regulator+of+Constitutive+Exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Yeast VSM1 Encodes a v-SNARE Binding Protein That May Act as a Negative Regulator of Constitutive Exocytosis.</a> Molecular and Cellular Biology. 19, 4480-4494 (1999).</li>
<li>Viñuela, A., Snoek, L., Riksen, J., Kammenga, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-Wide+Gene+Expression+Analysis+in+Response+to+Organophosphorous+Pesticide+Chlorpyrifos+and+Diazinon+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Genome-Wide Gene Expression Analysis in Response to Organophosphorous Pesticide Chlorpyrifos and Diazinon in C. elegans.</a> PloS one. 5, 1-8 (2010).</li>
<li>Niwa, R., Hada, K., Moliyama, K., Ohniwa, R., Tan, Y., Olsson-Carter, K., Chi, W., Reinke, V., Slack, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((elegans+sym-1+is+downstream+target+of+the+hunchback-like-1+developmental+timing+transcription+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">elegans sym-1 is downstream target of the hunchback-like-1 developmental timing transcription factor.</a> Cell Cycle. 8, 4147-4154 (2009).</li>
<li>Kershner, A., Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+mRNA+targets+for+Caenorhabditis+elegans+FBF%2C+a+conserved+stem+cell+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of mRNA targets for Caenorhabditis elegans FBF, a conserved stem cell regulator.</a> PNAS. 107, 3963-3941 (2010).</li>
<li>Hammock, E., Eagleson, K., Barlow, S., Earls, L., Miller, D., Levitt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homologs+of+genes+expressed+in+Caenorhabditis+elegans+GABAergic+neurons+are+also+found+in+the+developing+mouse+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Development%22%5BJournal%5D)">Homologs of genes expressed in Caenorhabditis elegans GABAergic neurons are also found in the developing mouse forebrain.</a> Neural Development. 5, 1-14 (2010).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

본 연구에서는 다양한 생물 학적 현상을 기본 결정 유전자 발현 프로필을 사용할 수있는 쉽고 사용자 친화적인 프로토콜을 개발했습니다. 이 프로토콜에서 총 RNA가 먼저 격리와 RNA의 분리 우리의 방법은 크게 페놀 extractions를 생략하고 5,6 정리를위한 화성 수지를 사용하여 간단하게되었습니다 DNase I.를 사용하여 치료했습니다. 간단히, C. 엘레간스의 cuticule 및 세포 세포막은 액체 질소와 분자 수지로 분쇄와 냉동 nematodes에 의해 금이 - 오픈되었습니다. 다음 추출된 RNA는 cDNA 합성 전에 DNase I로 치료했다. 나중에 단계는 unspecific hybridizations을 최소화하기 위해 추가되었다; 게놈 DNA와 RNA 오염된 샘플 간섭을 소개하고 많은 거짓 - 반응을 생산 수 있습니다. 그런 다음, 야생 입력하고 vsm - 1 (ok1468) 돌연변이의 cDNAs은 Cy3와 Cy5 캡처 시퀀스 태그와 C.로 hybridized되었다 엘레간스의 microarrays은 GCAT 프로그램을 통해 얻은. 이 시스템은 유사 제품보다 더 민감하고, 그 두 색상의 디자인은 큰 시간과 비용 효율 7,8의 결과, 필요한 배열의 수를 감소시킵니다. 또한이 시스템은 다른 유사한 시스템의 전문 장비가 필요하지 않으므로,이 절차는 표준 실험실 설정 7 수행할 수 없습니다. 셋째, 형광 hybridized 배열 이미지는 오픈 소스 소프트웨어 MAGICTool를 사용하여 분석되었고, 유전자 발현 프로파일이 만들어졌습니다. MAGICTool은 학부에서 포스트 박사로, 쉽게 모든 경험 수준의 개인에 의해 활용되는 사용자 친화적인 프로그램입니다. 그러나, 최적의 성능은 대용량 메모리 가용성을 필요로합니다. 마지막으로, 후보 유전자 실시간 PCR과 검증되었습니다 microarray 분석을 사용하여 획득하였습니다. 게놈 접근 방식이 생물 학적 현상을 연구를위한 효율적인 방법에도 불구하고, 하나는 고려 소요됩니다 몇 가지 제한이있다. 인쇄 oligonucleotide가 보존 시퀀스에서 가져온 경우 첫째,이 microarray 프로토콜의 특이성에도 불구하고, 가족 내에서 성적은 서로 구별할 수 있습니다. 실시간 PCR은 유전자 가족 내에서 공통점에 대한 보상, 심지어 같은 유전자의 특정 isoforms 구별 수 있습니다. 그러나, 실시간 PCR과 동일하게 생명체의 수명에 걸쳐 표현 진정한 컨트롤을 찾기 위해 도전입니다. 이 때문에, 결과는 상대적인 것입니다. proteomic 접근은 우리의 기술을 하나의 대안입니다. 개별 단백질은 2D 겔 전기 영동과 질량 분석계로 확인을 사용하여 격리 수 있습니다. 우리의 연구는 특히 주요 정자 단백질 (MSP) 가족의 여러 구성원이 향상된 시냅스 밀도 vsm - 1 돌연변이 nematodes에서 유도되는 보여줍니다. MSPs는 C.에 고유한 엘레간스 및 oocyte의 성숙과 배란에 대한 책임이 있습니다. 차이 1 과일 파리의 신경근육학 교차점에서 presynaptic 부통 번호 및 크기의 조절 가능성이 주요 정자 단백질 도메인을 포함하는 분자에 의해 제어됩니다 것을 보여주었다. 쓰다 및 동료에 의해 ​​연구는 2 개의 주요 정자 단백질 도메인 수용체 티로신 키나제 신호 폭포를 실행, Ephrine 수용체에 대한 리간드 역할을 수 증명하고있다. 또한, 실시간 PCR 분석 확인 및 MSP 가족, MSP - 32 중 하나를 회원에게 microarray 결과를 좁혀. 함께 촬영, 여기에서 제시한 작품은 중앙 신경 과학의 딜레마의 게놈 차원의 분석뿐만 아니라 과학적 노력의 학부 연구의 파워를 나타냅니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 구성 요소 </td><td> 카탈로그 # </td><td> 회사 </td></tr><tr><td> RNA 나중 </td><td> AM7020 </td><td> 앰비온 </td></tr><tr><td> 분자 연삭 수지 </td><td> 786-138 </td><td> Gbiosciences </td></tr><tr><td> RNeasy 미니 키트 </td><td> 74,104 </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> Rnase없는 아가로 오스 LE </td><td> AM9040 </td><td> 앰비온 </td></tr><tr><td> NorthernMax Gly 10X 젤 준비 / 실행 버퍼 </td><td> 8678 </td><td> 앰비온 </td></tr><tr><td> RNA 밀레니엄 마커 </td><td> AM7150 </td><td> 앰비온 </td></tr><tr><td> Glyoxal 샘플 로딩 다이 </td><td> 8551 </td><td> 앰비온 </td></tr><tr><td> DNase 세트 </td><td> 79,254 </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> RNeasy MinElute 키트 </td><td> 74,204 </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> RT 효소와 배 반응 완충액 </td><td> RT300320 </td><td> Genisphere </td></tr><tr><td> 배열 350 </td><td> W300180 </td><td> Genisphere </td></tr><tr><td> QIAquick PCR의 정제 키트 </td><td> 28,104 </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> 20X SSC </td><td> 82021-4846 </td><td> VWR </td></tr><tr><td> 가지각색 연어 정자 DNA </td><td> AM9680 </td><td> 앰비온 </td></tr><tr><td> SDS 솔루션 </td><td> V6551 </td><td> Promega </td></tr><tr><td> DTT EM </td><td> 3860 </td><td> VWR </td></tr><tr><td> iScript cDNA 합성 키트 </td><td> 170-8890 </td><td> BioRad </td></tr><tr><td> IQ SYBR 그린 Supermix </td><td> 170-8880 </td><td> BioRad </td></tr></tbody></table>

의 유전자 표현 프로필 결정 c. 엘레간스 microarray 및 실시간 pcr을 사용하여

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

시냅스는 대상 세포에 신호 세포와 postsynaptic 터미널에서 presynaptic 활성 영역으로 구성되어 있습니다. 화학 시냅스의 경우, 메시지는 presynaptic 터미널에서 발표하고 postsynaptic 수용체 세포에 신경 전달 물질에 의해 접수 실시하고 있습니다. Caenorhabditis 엘레간스에있는 우리 이전의 연구는 VSM - 1 부정 exocytosis을 조절하는 것으로 나타났습니다. 또한 vsm - 1 돌연변이에 시냅스의 분석 보여준 완벽한 기능 VSM - 1 증가 시냅스 연결을 부족한 동물. 이러한 예비 조사 결과를 바탕으로, 우리는 가상 그 C. 엘레간스 VSM - 1 synaptogenesis에서 중요한 역할을 수 있습니다. 이 가설을 테스트하려면 두 번 표시 microarray 분석이 수행되었고, 유전자 발현 프로파일이 결정됩니다. 첫째, 총 RNA는 고립되었다, reversely cDNA로 베꼈는데하고, DNA를 microarrays에 hybridized. 그런 다음, 형광 프로브 하이브 리다이 제이션의 인 silico 분석 향상된 synaptogenesis과 돌연변이의 주요 정자 단백질 가족 (MSP)의 회원 코딩 많은 유전자의 중요한 유도을 공개했다. MSPs는 C로 정자의 주요 구성 요소입니다 엘레간스 및 선충류의 oocyte의 성숙과 배란 신호를 나타납니다. 과일 파리에서 차이와 동료 1 MSP 같은 분자가 신경근육학 교차로에서 presynaptic 부통 번호와 크기를 규제 것을 보여주었다. 또한, 쓰다 및 동료에 의해 ​​수행 분석 2 MSPs는 에프 수용체와 트리거 수용체 티로신 키나제의 신호 폭포에 대한 리간드 역할을 수 있습니다 것을 제안했습니다. 마지막으로, 실시간 PCR 분석 MSP - 32에 대한 코딩 유전자가 vsm - 1 (ok1468) 돌연변이의 유발 것을 뒷받침. 함께 찍은, 우리 실험실에 의해 수행 연구 vsm - 1 돌연변이 MSP - 32 신호에 의해 중재 수 시냅스 밀도에 상당한 증가를 가지고 나타났습니다.

Microarray 분석은 유전자 표현의 프로필을 결정하기 위해 실시되었다<em&gt; C. 엘레간스</em&gt; 실시간 PCR은 microarray 데이터를 확인하고 수치로 사용되었습니다.

의 유전자 표현 프로필 결정 C. 엘레간스 Microarray 및 실시간 PCR을 사용하여

시냅스는 신호 전달 세포의 시냅스 전 활성 구역과 표적 세포의 시냅스 후 단말로 구성됩니다. 화학적 시냅스의 경우, ...

이 프로시저의 전체적인 목적은 수많은 표현형 또는 대사 경로의 기초가 되는 유전자 발현 프로필을 조사하는 것입니다. 이는 먼저 대조되는 두 가지 선충 균주로부터 mRNA를 분리함으로써 수행됩니다. 프로시저의 두 번째 단계는 S SI three 또는 SFI 캡처 서열을 포함하는 cDNA를 합성하고 이를 마이크로어레이에 하이브리드화하는 것입니다.절차의 세 번째 단계는 S SI 3 및 SCIFI 형광체가 포함된 항-포획 서열로 마이크로어레이를 하이브리드화하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 마이크로어레이를 스캔하고 magic tool 소프트웨어와 같은 생물정보학 도구를 사용하여 데이터를 분석하는 것입니다. 최종적으로, 조사 중인 생물학적 현상을 매개하는 후보 유전자가 식별되며, 이는 real-time PCR과 같은 대안적 기술을 통해 검증 및 정량화될 수 있습니다.일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 사용자는 스팟팅된 뉴클레오타이드가 눈에 보이지 않아 23,000개 이상의 고유하게 프린팅된 뉴클레오타이드 위에 균질한 하이브리다이제이션 혼합물을 겹쳐 올리는 데 어려움을 겪을 수 있습니다. 먼저 동기화된 건강한 선충으로부터 RNA를 수집하는 것부터 시작하십시오. 우선, 선충을 세척하여 15 mL 튜브에 재현탁시킨 후 펠릿화합니다. 생성된 선충 펠릿은 0.1 M NaCl 7 mL와 얼음처럼 차가운 60% w/v sucrose 7 mL에 재현탁합니다.얼음 위에서 15분 동안 배양한 후, 벌레들을 다시 원심분리하여 침전시킵니다. 이제 박테리아가 제거된 벌레들이 위로 떠오르면, 이를 수집하여 RNAse-free water로 세척하고 다시 침전시킵니다. 다시 한번, 깨끗하고 느슨하게 뭉쳐진 침전물을 마이크로 원심분리 튜브로 옮겨 최대 속도로 30초 동안 원심분리합니다.흡입하여 4 °C에서 10 부피의 RNA later에 보관하며, 다음 단계를 진행할 때까지 유지합니다. 총 RNA 샘플을 준비하려면, 준비된 펠렛을 최대 속도로 원심분리하고 상층액을 제거한 뒤 펠렛에 분자 분쇄용 레진을 소량 첨가합니다. 그 후 액체 질소를 이용해 혼합물을 동결시키고 유발(pestle)을 사용하여 분쇄합니다.냉동된 벌레 현탁액을 곱게 갈아 분말로 만들고, 분쇄 후 분말의 저온 상태를 유지하기 위해 필요에 따라 액체 질소를 추가합니다. 추출물을 얼음 위에 5분 동안 둡니다. 5분 후, 추출물을 총 700 µL의 R-L-T-B-M-E 및 472 µL의 100% ethanol과 혼합합니다.상용 키트를 사용하여 생물학적 샘플당 최종 부피 60 µL의 분리된 RNA를 얻을 수 있습니다. 다음 단계로 넘어가기 전, DNAse I로 처리하여 잠재적인 게놈 DNA 오염을 제거한 후 상용 RNA 정제 키트를 사용하십시오. 최종 부피를 60 µL로 맞추어 키트 절차를 완료하십시오.마지막으로, 마이크로어레이 하이브리드화 전에 글리옥살 샘플 로딩 염료 처리 및 겔 분석을 통해 RNA 농도를 측정하고 RNA의 무결성을 평가합니다. 일반적인 방법을 사용하여 정제된 RNA를 상보적 DNA로 역전사하며, 시판 키트를 사용하여 분해된 템플릿으로부터 이를 정제한 후 60 µL 부피로 조절합니다. 초음파 처리된 연어 정자 DNA로 마이크로어레이 슬라이드를 블로킹하여 마이크로어레이 하이브리드화를 시작합니다. 한 시간이 지나면 블로킹된 슬라이드를 2회 증류수에 담가 헹군 후 스핀 건조합니다.Kimwipe로 감싼 50 mL 원뿔형 튜브 안에서 슬라이드를 건조합니다. 이제 2x formamide 기반으로 하이브리다이제이션 완충액을 준비합니다. 먼저, 결정이 완전히 용해되도록 55 °C에서 10분 동안 가온합니다.그 다음 10,000 gs에서 1분 동안 원심분리합니다. 다음으로 25 µL의 CD NA와 25 µL의 hybridization buffer를 혼합하고, 혼합물을 가볍게 튕겨 섞어줍니다. 이제 혼합물을 빠르게 스핀 다운한 후 80 °C에서 10분 동안 배양합니다.배양 후, 슬라이드에 닿지 않도록 주의하며 모든 cDNA 샘플을 마이크로어레이 슬라이드 위에 피펫으로 옮깁니다. 샘플이 마이크로어레이 슬라이드 위에 균일하게 퍼지도록 합니다. 주사바늘을 사용하여 커버슬립을 슬라이드 위에 조심스럽게 내립니다. 커버슬립이 완전히 내려가기 전에 다시 들어 올렸다가 바늘로 다시 내리면서 커버슬립이 부드럽게 안착하도록 합니다.이 기술은 기포 형성을 최소화합니다. 이제 슬라이드를 50 mL 코니칼 튜브에 수평으로 넣고, 슬라이드 아래에 50 µL의 2차 증류수를 넣은 후 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 슬라이드를 세척한 후 짧게 2차 하이브리다이제이션을 수행합니다.SSC 과정에서 빛에 민감한 캡처 시약과 Antifa 시약이 포함된 두 번째 버퍼를 동일한 기술로 여러 번 적용한 후, 짧은 배양, 추가 세척 및 건조 과정을 거칩니다. 그 후 슬라이드를 스캔할 수 있습니다. 이미지는 오픈 소스 magic tool이 포함된 무료 소프트웨어를 사용하여 분석할 수 있습니다.Project 탭에서 Build Expression Profile 탭 아래에 새 프로젝트를 생성하고 저장하십시오. Load Image Pair를 선택한 후, red 이미지 파일을 red로, green 이미지 파일을 green으로 선택하십시오. 그 다음 Build Expression Profile 탭을 선택하십시오. Load Gene List를 선택하여 GCAT 웹사이트에서 얻은 C elegance 유전자 목록 파일을 업로드하여 마이크로어레이 이미지를 지정하고 그리드를 설정하십시오.'build expression profile' 탭을 선택하고 'create edit grid' 옵션을 생성합니다. 이제 그리드를 편집하십시오. 설정 대화 상자에서 그리드 수를 48로, 각 그리드의 행과 열을 각각 22행 22열로 설정하고, 스팟 번호 매기기 방식을 왼쪽에서 오른쪽으로, 위에서 아래로 선택합니다.대조도 변경 백분율을 높이고 개별 스폿이 쉽게 구별될 때까지 그리드를 확대합니다. 왼쪽 패널에서 왼쪽 상단 스폿 설정을 선택한 다음, 왼쪽 상단 스폿의 중심을 클릭하고, 이어서 오른쪽 상단 스폿과 첫 번째 그리드의 하단 행을 클릭하여 그리드를 생성합니다. 이 그리드 설정 절차를 48개 그리드 전체에 대해 왼쪽에서 오른쪽으로, 그리고 위에서 아래 방향으로 반복합니다.그 다음 'file' 탭을 선택하고 'save current grid as'를 클릭하여 저장합니다. 'finished' 탭을 선택하여 분석과 관련 없는 스폿을 제거합니다. 'build expression profile' 탭을 열고 'addressing gridding' 옵션에서 'spot flagging'을 선택합니다.이제 스트릭 스폿(streak spots)이나 배경 형광을 플래그로 표시하고, 'save current flags'를 선택하여 저장하십시오. 'file' 탭에서 플래그가 표시된 파일들이 세그멘테이션(segmented)되어야 합니다. 마지막으로, 'expression' 탭에서 'explore'를 선택하여 특정 인자에 의해 유도되거나 억제된 유전자를 분석하십시오.탐색 대화 상자에서 정밀 유전자 일치 기준을 설정하십시오. 발현의 2배 증가 또는 감소 횟수를 설정합니다. 강도를 x라고 하며, X의 값은 발현 변화의 기준이 됩니다.유도된 유전자의 경우 X보다 큰 최대값을, 억제된 유전자의 경우 X보다 작은 최소값을 입력합니다. 본 실험에서는 염료 교환(dye swap) 대조군 실험을 수행하며, 3단계 및 4단계 유충에서 독립적으로 분리한 두 가지 총 RNA를 녹색 돌연변이 대 적색 야생형, 또는 적색 돌연변이 대 녹색 야생형으로 하이브리드화하여 유전자 발현 변화를 확인합니다. 동일한 절차를 사용하여 세 가지 독립적인 총 RNA 분리를 수행하고, 상용 키트를 이용해 cDNA를 합성하며, 각 cDNA 샘플에 대해 세 가지 하우스키핑 유전자를 대조군으로 하여 실시간 PCR을 3반복으로 수행합니다. 시연을 위해, VSM one에서 유도된 유전자 발현에 대한 다음 결과들을 살펴봅니다.마이크로어레이 분석을 수행하기 전, 시냅스 강화 특성을 가진 선충 균주인 AK 1468 돌연변이체에서 추출한 RNA의 품질을 겔 전기영동으로 확인합니다. dase one 처리 전후로 두 개의 온전한 리보솜 소단위체가 관찰되는 것은 RNA 샘플의 상태가 양호함을 나타냅니다. 마이크로어레이에서 야생형 cDNA는 빨간색으로, VSM one 돌연변이 cDNA는 초록색으로 표지합니다. 마이크로어레이당 분석된 48개 그리드 중 하나에서, 각 작은 사각형은 프린팅된 단일 올리고뉴클레오타이드를 나타내며, 각 어레이에는 고유한 올리고뉴클레오타이드가 표시되어 있습니다.4단계 유충에서 분리한 전사체의 마이크로어레이 분석 결과, 주요 정자 단백질(major sperm proteins, MSP)을 코딩하는 유전자들이 VSM one 돌연변이체에서 유도되었으며, 3단계 유충의 마이크로어레이 분석에서도 돌연변이체의 동일한 유전자 가족 내에서 발현 변화가 나타났습니다. 마이크로어레이의 예측 결과를 실시간 PCR 분석으로 검증한 결과, MSP 유전자 가족의 구성원 중 하나인 MSP 32가 VSM one 돌연변이체에서 유도됨을 확인하였습니다. 해당 데이터는 동일한 RNA 수집본을 이용한 실시간 PCR 3회 반복 실험의 평균값을 나타냅니다.이 영상을 시청한 후에는 과학계에서 사용할 수 있는 수많은 오픈 소스 생물정보학 소프트웨어 프로그램들이 있다는 점을 고려하여, 전장 유전체 분석을 위한 생물정보학 도구를 다루는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

determining-genetic-expression-profiles-c-elegans-using-microarray

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

정량 실시간 PCR (qRT - PCR)은 다른 곤충의 조직 및 발달 단계에서 mRNA 수준을 진단하는 효과적인 도구입니다. 이 보고서에서 우리는 다른 애벌레 조직에서 확인할 mRNA 레벨 및 침입 곤충의 종, 에메랄드 애쉬 송곳의 발달 단계에 qRT - PCR의 사용을 보여줍니다.

에메랄드 애쉬 보러에서 유전자 발현 분석 ( Agrilus planipennis)를 사용하여 정량 리얼 타임 PCR

우리는 사전 microRNA의 설정 및 분석 서비스를 선보일 예정 써모 과학 매트릭스 멀티채널 피펫과 수작업으로뿐만 아니라 로봇을 사용하여 QPCR위한 96 잘 배열.

정량 실시간 PCR (qPCR) 배열을 사용하여 사전 마이크로 RNAS과 microRNAs의 프로 파일링

우리가 사용하는 프로토콜을...

의 정량 및 자동화된 고속 처리량 게놈 전체의 RNAi 화면 C. elegans</em

이 비디오는 PCR 스크리닝을 통해 단일 선충에서 유전자 마커를 빠르게 스크리닝하는 기술을 설명합니다. 예시 프로토콜에서는 CRISPR 기반 게놈 편집을 스크리닝합니다.

Single Worm PCR: 게놈 DNA를 추출하고 증폭하는 방법

이 프로토콜은 자외선(UV) 조사를 사용하여 형질전환 염색체 외 배열을 Caenorhabditis elegans 게놈에 통합하기 위한 빠르고 낮은 재료 소모 절차를 설명합니다. 또한, 이 프로토콜은 염색체 외 어레이를 높은 비율로 전송하는 형질전환 라인에 특히 적합합니다.

높은 투과 속도를 가진 염색체 외 배열을 예쁜꼬마선충 게놈에 통합하기 위한 빠른 프로토콜

여기, 우리는 넓은-범위 식이 제한 유전자 발현 및 수명에 관련 된 프레임 워크 제시. 우리는 넓은-범위 식이 제한 및 유전자 발현이이 패러다임에서의 양적 이미징에 대 한 프로토콜 설명합니다. 우리는 더 이상 음식 감지에 관여 유전자 회로의 정보 처리 기능 기본 공개 전산 분석 개요.

C. 선 충 에서 광범위 한 범위 식이 제한 유전자 식 수준 동안 수명 변조에서 인코딩된 정보의 정량화

이 작품은 한 번의 하룻밤 실행에 80-100 C. 예쁜 꼬마 배아에서 배아의 동시 3D 시간 경과 영상을 허용하는 반 높은 처리량 프로토콜을 설명합니다. 또한 데이터 분석을 간소화하기 위해 이미지 처리 및 시각화 도구가 포함되어 있습니다. 사용자 정의 리포터 균주와 이러한 방법의 조합은 배아 발생의 상세한 모니터링을 가능하게.

C. elegans 배아 개발을 분석하는 세미 고처리량 이미징 방법 및 데이터 시각화 툴킷

이 문서에서는 단일 또는 벌크 C. elegans 샘플에서 유전자 발현 수준의 빠르고 신뢰할 수 있는 측정을 위한 고처리량 프로토콜이 설명되어 있다. 이 프로토콜은 RNA 절연을 필요로하지 않으며 샘플에서 직접 cDNA를 생성합니다. 고처리량 멀티플렉션 나노유체 실시간 qPCR 플랫폼과 함께 사용할 수 있습니다.

단일 및 벌크 C.의 고처리량 정량적 RT-PCR. 나노 유체 기술을 사용하여 샘플

이 프로토콜은 예쁜꼬마선충(C. elegans)에서 RNAi 유도 침묵 및 관련 염색질 변형의 후성유전학적 유전을 연구하기 위한 RNA 간섭 및 ChIP 분석을 설명합니다.

형광 리포터 및 ChIP(Chromatin Immunoprecipitation)를 사용한 예쁜꼬마선충(C. elegans )의 세대 간 후성유전학적 유전 분석

이 프로토콜은 Caenorhabditis elegans에서 감수분열 동안 교차 빈도 및 분포를 측정하는 방법을 제공합니다. 염색체의 기원을 결정하기 위해 Real-time PCR을 사용한 single-nucleotide polymorphism genotyping을 사용했습니다. 4점 매핑을 통해 각 염색체의 왼쪽, 중앙 및 오른쪽 팔 영역의 교차 분포를 결정할 수 있었습니다. ...

Real-time PCR을 이용한 SNP 유전형 분석에 의한 Caenorhabditis elegans 감수분열의 교차 빈도 및 분포

배우세요 C. elegans 유전자 발현 프로파일링을 마이크로어레이와 실시간 PCR로 수행하는 방법을. 이 기술은 후보 유전자를 식별하고 생물학적 현상을 검증하는 데 활용됩니다.

의 유전자 표현 프로필 결정 C. 엘레간스 Microarray 및 실시간 PCR을 사용하여

더 많은 동영상 탐색