IRE / IRP 예 : RNA - 단백질 상호 작용의 연구에 대한 전기 이동 기동성 교대 분석 실험 (EMSA)

다음 실험의 전반적인 목표는 전기영동 이동성 이동 분석을 사용하여 세포 추출물의 RNA 단백질 상호 작용을 분석하는 것입니다. 이는 먼저 세포나 조직에서 추출한 단백질을 별도의 단계로 준비하여 유전자 특이적 무선 표지 RNA 프로브를 합성하고 정제함으로써 달성됩니다. 그런 다음 단백질 추출물을 표지된 RNA 프로브와 혼합하여 특정 RNA 단백질 복합체를 형성할 수 있습니다.

마지막으로, 반응 생성물은 비 변성 폴리 아크릴아미드 겔에 적재되고 전기영동이 없는 RNA 프로브로 분석되어 더 빠른 이동성 덕분에 RNA 단백질 복합체에서 분리됩니다. 전기영동 이동성 이동 분석은 RNA 단백질 상호 작용을 분석하는 데 널리 사용됩니다. 우리는 철 조절 단백질인 IRP 1과 IRP 2가 표적 RNA 요소에 결합하는 것을 분석할 수 있었습니다.

그러나이 방법은 또한 다른 RNA 결합 단백질의 연구에 적용 할 수 있으며,이 절차는 내 실험실의 Dr.Kain 필리핀 연구원과 박사후 연구원 인 Dr.Nicole Wilkinson에 의해 수행 될 것임을 보여줍니다. 얼음처럼 차가운 PBS로 세포를 두 번 씻은 다음 얼음처럼 차가운 PBS 1ml를 넣고 플라스틱 세포 스크레이퍼로 세포를 수확합니다. 느슨한 셀 현탁액을 새로운 1.5ml 원심분리기 튜브로 옮깁니다.

미리 냉각된 섭씨 4도의 마이크로 원심 분리기에 튜브를 놓습니다. 5분 동안 저속으로 스핀다운하고 수프 나탄트를 흡입합니다. 세포는 튜브 바닥에 흰색 펠릿으로 나타납니다.

1,000만 개의 세포를 채취할 때마다 100마이크로리터의 얼음처럼 차가운 세포질 용해 완충액을 추가합니다. 여러 번 위아래로 피펫팅하여 세포 펠릿을 느슨하게 한 다음 얼음 위에서 20분 동안 현탁액을 배양합니다. 이것은 세포막을 용해시키고 모든 세포질 함량을 완충액으로 방출합니다.

용해된 세포질 분획을 분리하려면 섭씨 4도의 원심분리기에서 튜브를 최대 속도로 10분 동안 회전시킨 다음, 정화된 스내트를 얼음 위의 새 1.5ml 튜브로 옮기고 펠릿을 버립니다. 다음으로, Bradford assay를 사용하여 생성된 세포질 추출물의 총 단백질 농도를 측정합니다. 생성된 세포질 추출물을 더 작은 튜브로 분취하고 신선한 조직에서 세포질 추출물을 생산하는 데 사용할 때까지 섭씨 영하 80도에서 보관합니다.

안락사된 동물을 해부판 위의 깨끗한 패드에 눕혀 수확 과정을 시작합니다. 가위로 복부를 엽니다. 가위와 집게를 사용하여 간과 비장을 제거합니다.

조직 분해를 방지하기 위해 약 50ml의 얼음처럼 차가운 PBS로 각 조직을 헹굽니다. 즉시 메스로 조직을 약 1-2입방 밀리미터의 작은 조각으로 지체 없이 자릅니다. 새 극저온 튜브에 티슈를 넣고 스냅합니다.

샘플을 액체 질소에 동결시킵니다. 냉동 조직은 필요할 때까지 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 이전에 냉동된 조직 샘플을 250-500마이크로리터의 얼음 저온 용해 완충액이 들어 있는 평평한 바닥의 2밀리리터 튜브로 옮겨 세포질 추출물을 만들기 시작합니다.

조직 균질화 팁을 튜브에 넣고 중간 전력으로 장치를 켭니다. 균질화 10초 후 즉시 튜브를 얼음 위에 20분 동안 올려 놓아 단백질 변성을 방지합니다. 세포질 분획을 분리하려면 섭씨 4도의 원심분리기에서 10분 동안 최대 속도로 튜브를 회전시키고 정화된 상등액을 얼음 위의 새 1.5ml 튜브로 옮기고 펠릿을 버립니다.

생성된 세포질 추출물의 총 단백질 농도를 Bradford assay를 사용하여 측정합니다. 생성된 세포질 추출물을 더 작은 튜브에 Aqua 넣고 필요할 때까지 섭씨 영하 80도에서 보관합니다. 프로토콜을 계속하기 전에 플렉시글라스 실드 가이거 계수기가 있는 방사선 안전 작업대를 설정하십시오.

실험실 가운의 세포 분석 모니터링 태그와 적절한 방사선 특정 날카로운 물건 및 날카롭지 않은 폐기물 용기를 사용하십시오. 복제된 철 반응 요소를 포함하는 선형화된 DNA 플라스미드로 시작합니다. 템플릿으로, 템플릿 반응 버퍼, 부분 방사성 뉴클레오티드 및 RNA 중합효소를 실온에서 피펫과 혼합하여 20마이크로리터 in vitro RNA 전사 반응을 설정합니다.

RNA 합성을 시작하려면 섭씨 40도에서 1시간 동안 샘플을 배양합니다. 1마이크로리터의 0.5몰 EDTA pH 8.0을 첨가하여 시험관 내 전사 반응을 종료합니다. 위아래로 피펫팅하여 EDTA를 혼합합니다.

이제 표준 알코올 침전 프로토콜을 사용하여 RNA 산물을 정제합니다. 시작하려면 pH 5.2에서 10마이크로리터의 TRNA와 82.5마이크로리터의 3몰 아세트산나트륨을 합성 후 혼합물과 와류에 추가합니다. 혼합하기 위해 TRNA는 침전 운반체로 작용하고 최종 RNA 수율을 증가시켜 RNA를 침전시킵니다.

273 마이크로 리터의 95-100 % 에탄올을 넣고 볼텍싱으로 혼합합니다. RNA를 분리하기 위해 실온에서 10분 동안 튜브를 벤치에 그대로 두어 침전 반응을 진행하고 실온 원심분리기에서 튜브를 10분 동안 최고 속도로 회전시켜 침전 반응을 진행하도록 합니다. 피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 버리고 펠릿을 방해하지 마십시오.

침전된 RNA는 튜브 바닥 근처에 작은 흰색 펠릿으로 존재하거나 육안으로 보이지 않을 수 있습니다. 100-500 마이크로 리터의 70 % 에탄올을 첨가하여 펠릿을 세척하십시오. 실온에서 10분 동안 최고 속도로 샘플을 회전시킨 다음 뚜껑으로 스내트를 디캔팅합니다.

튜브를 벤치에 10-15분 동안 열어 두어 RNA 펠릿을 열어서 건조시킵니다. 100마이크로리터의 뉴클레아제 자유수를 첨가하여 고체 방사 표지 RNA를 재구성합니다. RNA 용액을 액체 sation counter Eloqua에 배치하여 방사성 뉴클레오티드 통합 정도를 정량화합니다.

라디오는 RNA 프로브를 더 작은 튜브에 넣고 필요할 때까지 섭씨 영하 80도에서 보관합니다. 냉동 분취액은 전기영동 이동성 전환 분석을 시작하기 전에 최대 3주 동안 사용할 수 있으며, 레인당 더 많은 시료 부피를 용이하게 하기 위해 최소 16 x 16cm 크기의 표준 6% 비변성 아크릴아마이드 겔을 준비할 수 있습니다. 그리고 이 크기의 젤의 기계적 안정성을 향상시키기 위해.

최소 1mm 두께의 유리 스페이서와 빗을 사용하십시오. 먼저 전기영동 이동성 이동 분석을 진행하기 위해 이전에 동결된 세포질 용해물과 무선 표지된 RNA가 눈에서 실험의 단백질 성분을 탐사합니다. 세포질 추출물 25마이크로그램을 세포질 용해 완충액으로 최종 총 부피 10마이크로리터로 희석합니다.

필요한 경우 혼합물에 1마이크로리터의 2개의 미스톡 용액을 첨가하고 단백질 샘플을 얼음 위에 보관합니다. RNA 분대의 경우, 방사 표지를 붙인 RNA 프로브를 뉴클레아제가 없는 물에 200, 마이크로리터 당 분당 000 카운트로 희석하여 섭씨 95도의 RNA를 1분 동안 자연화하고 용액을 실온에서 최소 5분 동안 냉각시킵니다. 단백질 RNA 결합 반응을 시작하려면 단백질 추출물에 1마이크로리터의 무선 표지 RNA 프로브를 추가하여 실온에서 20분 동안 결합이 일어나도록 합니다.

전기영동 이동성 이동 분석의 특이성을 높이려면 1마이크로리터의 헤파린 스톡을 반응에 첨가합니다. 방사성 표지된 RNA 프로브가 60개의 뉴클레오티드보다 긴 경우 1마이크로리터의 RNA T 1을 추가로 추가합니다. 실온에서 결합 반응을 10분 더 계속하여 특이성을 더욱 높이고 RNA 단백질 복합체를 더 잘 분리할 수 있도록 합니다.

3마이크로리터의 로딩 버퍼와 피펫을 위아래로 추가하여 혼합합니다. 그런 다음 6%아크릴아미드 겔에 전체 반응을 로드하고 60분 동안 센티미터 당 5볼트로 겔을 실행합니다. 적절한 방사선 차폐로 장치를 덮으십시오.

겔 장치를 분해하고 겔을 큰 여과지에 옮깁니다. 어두운 방에서 젤 건조 진공 장치를 사용하여 젤을 건조시킵니다. 젤과 여과지 조합을 조각 위에 놓습니다.

노출 후 필름을 현상하고 자연 건조합니다. 최적의 노출 시간은 1시간에서 하룻밤까지 다양할 수 있습니다. 철 함량이 다양한 조직 배양 세포에서 방사성 IRE 프로브에 대한 I RRP 1 및 I RRP 2의 철 의존성 결합 능력을 평가할 수 있습니다.

따라서, IRE 결합 활성은 이전에 K 나중에 데페록사민으로 처리된 철이 고갈된 세포에서 유도됩니다. 반대로, IRE 결합 활성은 이전에 철이 적재된 세포에서 헤만으로 처리된 철이 적재된 세포에서 억제됩니다. I RRP 1의 IRE 결합 활성은 철 황 클러스터의 조립 후 손실되는 반면 I RRP 2는 철 의존성 분해를 겪습니다.

IRP one의 철세포 클러스터는 휴면 IRE 결합 활성을 모니터링 할 수있는 2 % 2 me로 세포 추출물을 처리하여 파괴 할 수 있습니다. I RRP 2의 활동은 2 me에 의해 회복되지 않습니다. 이 다음 실험에서, 세포 철 농도의 함수로서 I RRP 1 및 IRP 2의 IRE 결합 활성은 야생형 I RRP 1 녹아웃 및 I RRP 2 녹아웃 마우스의 신선한 간 조직의 맥락에서 평가됩니다.

여기서 데이터는 간 철분 부하를 증가시키는 것으로 알려진 높은 철분 식단을 마우스에게 먹이면 야생형 마우스의 간 추출물에서 I RRP 1 및 IRP 2의 IRE 결합 활성이 감소하는 것을 촉진한다는 것을 보여줍니다. I rrp 두 개의 IRE 복합체는 I RRP 1의 존재에 의해 편향됩니다. 그들은 I RRP one 녹아웃 마우스의 간 추출물에서 쉽게 시각화됩니다.

여기서 높은 철분 다이어트는 IRP 2의 완전한 비활성화로 이어집니다. 이 동영상을 시청한 후에는 전기영동 이동도 이동 분석법으로 RNA 단백질 상호 작용을 분석하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. RNA 프로브의 품질이 성공에 매우 중요하다는 점을 기억하십시오.