Name: IRE / IRP 예 : RNA - 단백질 상호 작용의 연구에 대한 전기 이동 기동성 교대 분석 실험 (EMSA) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-03T16:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 44 s
Description: 배우세요 전기 이동 기동성 교대 분석(EMSA)을 이용하여 세포 추출물에서 RNA-단백질 상호작용을 분석하는 방법입니다. 이 기법은 철 조절 단백질의 결합 역학 연구에 활용됩니다.

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이 연구는 캐나다 보건 연구소(Canadian Institutes for Health Research)의 보조금(MOP-86514)으로 지원되었습니다.

쥐 실험 절차는 맥길 대학 (프로토콜 4966)의 동물 관리위원회에 의해 승인되었다. 배양 된 세포에서 단백질 추출물 1. 준비 <ol><li> 얼음처럼 차가운 인산 완충 생리 식염수 10 ㎖ (PBS)로 두 번 배양 세포를 씻으십시오. </li><li> 고무 경찰관 또는 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 얼음처럼 차가운 PBS, 전송 현탁액 1 ㎖의 플라스틱 셀 스크레이퍼 중 하나에 부착 된 세포를 다 쳤어요. </li><li> 4 ° C에서 700 XG에 5 분의 microcentrifuge에 스핀. 대기음 PBS. </li><li> 10 7 세포 당 얼음처럼 차가운 세포질 용해 버퍼 100 ㎕ (표 1)를 추가하고 아래로 피펫. </li><li> 얼음에서 20 분 동안 인큐베이션. </li><li> 4 ° C에서 마이크로 원심에서 최고 속도로 10 분 동안 스핀. </li><li> 취소 펠렛. 새로운 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 뜨는을 전송하고 얼음에 보관하십시오. </li><li> DET브래드 포드 분석 (23)를 사용하여 - (10 ㎍ / μL 일반적으로 1) 순백의 단백질 농도. </li><li> 사용할 때까지 -80 ° C에서 나누어지는 및 저장 세포 추출합니다. </li></ol> 마우스 간 및 비장에서 단백질 추출물 2. 준비 <ol><li> CO 2 흡입으로 마우스를 안락사. </li><li> 해부 보드 위에 깨끗한 패드의 안락사 동물을 놓습니다. 가위로 복부를 엽니 다. </li><li> 가위 집게를 사용하여 간 및 비장을 해부하고, 약 50 ml의 빙냉 PBS에서 각 조직을 헹군다. </li><li> 즉시 메스 작은 조각으로 조직을 절단 (예 : 약 1-2mm 3). </li><li> 지체없이 신선한 cryotube에 조직의 조각을 넣고 액체 질소를 고정 스냅. 스토어 스냅인 냉동 조직 씩을 사용할 때까지 -80 ° C에서. </li><li> 0.5 ㎖의 - 0.25 - (2 내지 3mm 정도 1) 동결 조직의 한 조각 균질화세포질 빙냉 용해 완충액 (표 1) 10 초 동안 조직 균질화. </li><li> 20 분 동안 얼음에 1.5 ml의 microcentrifuge 관과 진정으로 균질을 전송합니다. </li><li> 4 ° C에서 마이크로 원심에서 최고 속도로 10 분 동안 스핀. </li><li> 새로운 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 펠렛 및 전송 상층 액을 제거한다. 얼음에 보관하십시오. </li><li> 브래드 포드 분석 (23)를 사용하여 - (10 ㎍ / μL 일반적으로 1) 단백질 농도를 결정합니다. </li><li> 사용할 때까지 -80 ° C에서 나누어지는 및 저장 세포 추출합니다. </li></ol> 방사성 표지 IRE 프로브 3. 준비 <ol><li> 제한 효소 XbaI으로 (플라스미드 당 1 μg의 U), IRE 서열의 하류로 절단하여, 1 시간 동안 37 ° C에서 배양하여 IRE 함유 플라스미드 I-12.CAT 22 선형화. 선형화 된 플라스미드는 시험 관내 전사를위한 템플릿으로 사용됩니다. </li><li> 설정N 체외 20㎕의 전체 부피에서 전사 반응. 표 2에 나타낸 스톡 솔루션을 사용하고 추가 1 μL 선형화 된 플라스미드 주형 4 μL 전사 버퍼; ATP / CTP / GTP 믹스 1 ㎕를 혼합, 10 ㎕의 [α- 32 P] -UTP, 2 μL 디티 오 트레이 톨, 1 ㎕의 RNA 분해 효소 억제제 및 1 μL의 T7 RNA 폴리머 라제. 로 pipetting 아래로 섞는다. </li><li> 1 시간 24 40 ° C에서 품어. </li></ol> 방사성 표지 IRE 프로브 4. 정제 <ol><li> 피펫 팅 아래로 0.5 M EDTA, pH가 8 믹스 1 μl를 추가하여 시험 관내 전사 반응을 종료합니다. </li><li> 더 나은 침전 캐리어로, 10 ㎎ / ㎖의 tRNA의 10 μl를 추가합니다. 로 pipetting 아래로 섞는다. </li><li> 3 M 암모늄 아세테이트 82.5 μl를 추가합니다. 와동에 의해 섞는다. </li><li> 에탄올 273 μl를 추가합니다. 와동에 의해 섞는다. </li><li> 5 분 동안 RT에 서 보자. </li><li> RT에서 마이크로 원심에서 최고 속도로 10 분 동안 스핀. 취소 상층 액. </li><li> 워시는 70 % 에탄올 100 ㎕로 펠렛. </li><li> RT에서 마이크로 원심에서 최고 속도로 10 분 동안 스핀. 취소 상층 액. </li><li> 10 분 동안 공기 건조 펠렛. </li><li> 이중 증류수 100 ㎕에 재현 탁 펠릿은, 이전에 H 2 O를 멸균 </li><li> 사용할 때까지 -80 ° C에서 액체 섬광 계수기의 방사능, 나누어지는 방사성 동위 원소 표지의 IRE 프로브와 저장소를 정량화. 냉동 분취 최대 3 주 동안 사용될 수있다. </li></ol> EMSA에 대한 기본 폴리 아크릴 아미드 겔 5. 준비 <ol><li> 1.5 mm 스페이서와 빗을 사용하여 겔 (16 × 16cm)를 조립합니다. </li><li> 표 3에 도시 된 원액을 사용하여, 6 % 폴리 아크릴 아미드 겔 네이티브을 제조 7.5 ㎖의 40 % 아크릴 아미드의 혼합 :. 비스 아크릴 아미드, 5X TBE 5 ㎖과 37.5 ml에더블 증류수 H 2 O </li><li> 10 % 새롭게 제조 된 황산 암모늄 (APS) 25 μL의 테트라 메틸 에틸렌 디아민 (TEMED)의 0.5 ML을 추가합니다. </li><li> 즉시 젤에 아크릴 아미드 솔루션을 붓고 중합 할 수 있습니다. 약 30 분 동안 기다립니다. </li><li> 상기 겔 전기 영동 장치를 조립하여 0.5X TBE의 탱크를 채우기와 전원 연결. </li></ol> 6. 전기 이동 기동성 교대 분석 실험 <ol><li> 10 μL의 총 부피에서 세포질 또는 세포 용해 완충액 (표 1)과 조직으로부터의 단백질 추출물의 25 μg의 희석 (저급 단백질 농도도 사용될 수있다). 얼음에 보관하십시오. 25 : 4 휴면 IRP1 (2 % 최종 농도)를 활성화 2- 머 캅토 에탄올 (2-ME)로 희석 : 필요한 경우, 1의 1 μl를 추가합니다. </li><li> 95 °에서 두 번 증류수에 방사성 동위 원소 표지 IRE 프로브를 희석 2 O 200,000 CPM / μL, 열 변성에1 분 C, 그리고 적어도 5 분 동안 실온에서 냉각. </li><li> 단백질 추출물에 방사성 동위 원소 표지 IRE 프로브의 1 μl를 추가하여 EMSA 반응을 설정합니다. </li><li> 실온에서 20 분 동안 품어. </li><li> 반응 50 ㎎ / ㎖ 헤파린의 1 μl를 추가 (프로브 (9)와 비 특정 단백질 상호 작용을 억제하기 위해) 또 다른 10 분 동안 배양을 계속합니다. -80 ° C에서 스톡 헤파린 용액 (50 ㎎ / ml) 및 저장소 나누어지는. </li><li> 긴 방사성 표지 된 프로브 (&gt; 60 개 뉴클레오티드)를 사용하는 경우, 1 μL의 RNase T1 (1 U / μL)를 첨가하고, RT에서 10 분 동안 인큐베이션 프로브 비특이적 결합 단백질을 줄이기 위해, 및 RNA / 단백질의 잘 구분할 수 있도록 전기 영동시 복잡한. </li><li> 로딩 버퍼 (80 % 글리세롤 + 브로 모 페놀 블루)의 3 μl를 추가, 혼합 6 % 비 변성 폴리 아크릴 아미드 겔에로드. </li><li> 130 V (5 V / cm)에서 60 분 동안 젤을 실행합니다. </li><li> 티를 ransfer 큰 필터 종이 건조 위에 젤. </li><li> 필름에 노출 및 오토 라디오를 개발한다. 노출 시간은 1 시간 (이하)에서 O / N까지의 범위 일 수있다. </li></ol>

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</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

여기서, 우리는 IRP1과 IRP2의 IRE 결합 활동을 연구하기 위해 개발 된 프로토콜을 설명하고 우리는 대표적인 데이터를 보여줍니다. 다른 프로브를 사용함으로써,이 프로토콜은 다른 RNA 결합 단백질의 연구를 위해 조정될 수있다. 중요한 단계는 탐침의 크기이다. 정확한 결합 부위를 알 수없는 경우 일반적인 긴 프로브의 사용은 무료 RNA 다르게 마이그레이션되지 않습니다 RNA / 단백질 복합체가 발생할 수 있습니다. 이 경우, RNAse가 T1 (단계 6.6)으로 처리함으로써 미 결합 RNA를 제거하는 것이 바람직하다. 프로브의 품질도 매우 중요하다. 최상의 결과를 새로 제조 된 방사성 동위 원소 표지 된 RNA를 얻을 수 있습니다. 겔 정제 (10)는 필요하지 않지만 (더 RNAse가 T1 소화 단계가 포함되지 않은 경우 등)을 검사 준비를위한 시험 관내 전사 반응이 조기 종료되는 제품을 산출하는 경우 EMSA의 외관을 향상시킬 수있다. 기본 겔 전기 영동...

EMSA는 원래 타겟 DNA 서열과 1,2- DNA 결합 단백질의 관계를 연구하기 위해 개발되었다. 원리는이 문서의 초점이다 RNA / 단백질 상호 작용 3, 비슷합니다. 간단히, RNA는 음전하 폴리 아크릴 아미드 (또는 아가로 오스) 겔에서 전기 영동 비 변성 중에 애노드쪽으로 이동한다. 겔 내에서 마이그레이션 충전량에 비례하는 RNA의 크기에 따라 달라집니다. 특정 RNA에 단백질의 결합은 무료 RNA에 비해 복잡한 마이그레이션하는 느린 이동성을 변경합니다. 이는 분자량의 증가뿐만 아니라, 충전 및 가능한 입체 구조의 변화에​​ 주로 기인한다. 프로브로 표지 된 RNA를 활용하여 &quot;젤 지연&quot;또는 &quot;bandshift&quot;쉽게 모니터링 할 수 있습니다. 32 P - 라벨 RNA 프로브의 사용은 매우 일반적이며 높은 감도를 제공합니다. RNA / 단백질 복합체 무료 RNA의 이동이 감지된다오토 라디오로. 단점 32 P (14.29 일), 방사선 분해로 인해 프로브의 품질의 점진적인 열화의 짧은 반감기이다 방사능 라이센스 방사능 작업 인프라 및 잠재적 생물 안전성 문제의 요구. 따라서, RNA 프로브 레이블을 대체 비 동위 원소 방법은 형광 또는 화학 발광 영상 4,5의 검출을 가능하게 형광 물질이나 바이오틴,와 예를 들어, 개발되었다. 이러한 방법의 제한은 높은 비용과 동위 원소 라벨에 비해 자주 감소 감도 및 RNA / 단백질 상호 작용을 방해하는 비 동위 원소 라벨의 가능성이 있습니다. 비 변성 폴리 아크릴 아마이드 겔은 가장 EMSA 애플리케이션에 적합하며 일반적으로 사용된다. 경우에 따라, 아가 로스 젤 큰 단지의 분석을위한 대안을 제기 할 수 있습니다. EMSA의 주요 장점은 단순성, 감도 및 안정성을 겸비한 4 점이다 &lt;/ SUP&gt;. 분석은 몇 시간 내에 완료 될 수 있고, 정교한 장비를 필요로하지 않는다. RNA / 단백질 상호 작용은 0.1 nm 이하의 낮은 농도에서 EMSA에 의해 검출 될 수 있고, 광범위한 결합 조건의 범위 내에서 (pH가 4.0-9.5, 가의 염 농도 1-300 ㎜, 온도 0-60 ℃). RNA / 단백질 복합체 형성은 필터 결합 분석에 의해 연구 할 수있다. 자유 RNA 프로브가 6을 통과하면서는 니트로 셀룰로오스 필터 RNA / 단백질 복합체의 유지에 기초하여, 간단하고, 빠르고, 저렴한 절차이다. EMSA에 비해, 그것은 RNA 프로브가 다중 결합 부위를 포함하거나 조 추출물이 동일한 사이트에서 프로브에 결합하는 하나 이상의 RNA 결합 단백질이 들어 가지 경우에 한정된다. 여러 RNA / 단백질 상호 작용은 필터 결합 분석에 의해 탐지되지 것이지만, 그들은 용이 EMSA에 의해 시각화 될 수있다. 어떤 경우에는, 시각화 이브이다N 가능한 경우, 겔에 더 지체를 산출, EMSA 반응에 RNA 결합 단백질 중 하나에 대한 항체를 추가하여 공동 마이그레이션 (예를 들어, 인간의 IRP1 / IRE 및 IRP2 / IRE 단지) 두 RNA / 단백질 복합체 ( &quot;supershift&quot;) 7. EMSA 널리 철 대사 8-10의 전사 후 레귤레이터이다 IRP1과 IRP2을 연구하는 데 사용되었다. 그들은 몇 가지의 mRNA (11)의 UTRs 내에서 IRES, 계통 발생 학적으로 보존 헤어핀 구조에 결합함으로써 작동합니다. IRES 먼저 페리틴 (12)와 트랜스페린 수용체 1 (TfR1) (13), 각각 철 저장 및 흡수의 단백질을 암호화하는 mRNA를 발견했다. 나중에, IRES는 적혈구 특정 aminolevulinate 신타 (ALAS2) 14 미토콘드리아 aconitase 15 ferroportin 16, 2가 금속 수송 체 1 (DMT1) 17, 저산소증 유도 성 인자 (2)에서 발견 된 <em&gt; α (HIF2α) (18), 및 기타의 mRNA 19-21. UTR &#39;TfR1의 mRNA는 3에서 여러 IRES를 포함하는 동안, UTR&#39;프로토 타입 H-와 L-페리틴의 mRNA는 5 일 IRE가 포함되어 있습니다. IRE / IRP의 상호 작용은 특히 입체 43S 리보솜 서브 유닛의의 연결을 차단하여 페리틴 mRNA의 번역을 억제; 또한, 그들은 endonucleolytic 분열에 대한 TfR1 mRNA의 안정화. IRP1과 IRP2 공유 광범위한 서열의 유사성과 철에 굶주린 세포에서 높은 IRE 결합 활성을 나타낸다. IRP2은 프로 테오 열화를 겪는 동안 철 구비 세포에서, IRP1는 그것 IRE 결합능 희생 aconitase 세포질로 변환 쿠반의 Fe-S 클러스터를 조립한다. 따라서, IRE / IRP 상호 작용은 세포 철 상태에 의존 할뿐만 아니라, H 2 O 2, 산화 질소 (NO) 또는 저산소증과 같은 다른 신호들에 의해 조절된다. 여기서는 E에 의해 조 세포 및 조직 추출물에서 IRE - 결합 활성을 평가하기위한 프로토콜을 묘사MSA. 우리는 IRE 서열은 원래 의해 하류 T7 RNA 중합 효소 사이트의 센스 방향에 도입 된 플라스미드 DNA 템플릿 (I-12.CAT)로부터 시험 관내 전사에 의해 생성 된 32 P - 표지 H-페리틴 IRE 프로브를 사용 어닐링 합성 올리고 뉴클레오티드 (22)의 복제.

<table><tbody><tr><td>leupeptin</td><td>SIGMA</td><td>L2884</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>SIGMA</td><td>78830</td><td></td></tr><tr><td>BioRad 단백질 분석</td><td>BIORAD</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNA 중합효소</td><td>Thermoscientific</td><td>EPO111</td><td></td></tr><tr><td>RNase Inhibitor</td><td>Invitrogen</td><td>15518-012</td><td></td></tr><tr><td>UTP [alpha-32P]</td><td>Perkin-Elmer</td><td></td><td></td>NEG507H</tr><tr><td>섬광 액체</td><td>Beckman Coulter</td><td>141349</td><td></td></tr><tr><td>heparin</td><td>SIGMA</td><td>H0777</td><td></td></tr><tr><td>Rnase T1</td><td>Thermoscientific</td><td>EN0541</td><td></td></tr><tr><td>장비</td><td></td><td></td><td></td>이름</tr><tr><td>: 조직 파열판</td><td>Qiagen</td><td>9001271</td><td></td></tr><tr><td>섬광 카운터</td><td>Beckman Coulter</td><td>LS6500</td><td></td></tr><tr><td>Protean II xi Cell</td><td>BIORAD</td><td>165-1834</td><td></td></tr><tr><td>20웰 빗</td><td>BIORAD</td><td>165-1868</td><td>1.5mm 두께</td></tr><tr><td>1.5mm 스페이서</td><td>BIORAD</td><td>165-1849</td><td></td></tr><tr><td>PowerPac</td><td>BIORAD</td><td>164-5070</td><td></td></tr></tbody></table>

ire / irp 예 : rna - 단백질 상호 작용의 연구에 대한 전기 이동 기동성 교대 분석 실험 (emsa)

Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) for the Study of RNA-Protein Interactions: The IRE/IRP Example

RNA / 단백질 상호 작용은 전사 후 조절 경로에 대한 중요합니다. 가장 특징 세포질 RNA 결합 단백질 중 철 조절 단백질, IRP1과 IRP2입니다. 그들은하여 mRNA를 번역 또는 안정성을 제어하는​​ 여러 대상의 mRNA의 번역되지 않은 지역 (UTRs) 내에서 반응 요소 (IRES)을 다림질 결합한다. IRE / IRP 상호 작용은 널리 EMSA에 의해 연구되고있다. 여기서, 우리는 다른 RNA 결합 단백질의 활성을 평가하기 위해 일반화 될 수 IRP1과 IRP2 IRE의 결합 활성을 EMSA 분석 프로토콜을 설명한다. RNA 결합 단백질, 또는이 단백질의 정제 된 제제를 함유하는 조단백질 해물, 복합체 형성을 가능하게 표지 된 32 P-RNA 프로브의 과량과 함께 배양된다. 헤파린 결합 프로브 비 특정 단백질을 배제하기 위해 추가됩니다. 이어서, 혼합물을 폴리 아크릴 아미드 겔상에서 비 변성 전기 영동에 의해 분석된다. 무료 프로브, 빠른 마이그레이션하는 동안 RNA / 단백질 복합체 전시 지체 이동; 그러므로, 절차는 또한 &quot;겔 위상차&quot;또는 &quot;bandshift&quot;분석 불린다. 전기 영동 완료 후, 겔을 건조 및 RNA / 단백질 복합체,뿐만 아니라 자유 프로브는, 오토 래디오 그래피에 의해 검출된다. 프로토콜의 전반적인 목적은 감지 IRE / IRP 및 기타 RNA / 단백질 상호 작용을 정량화하는 것이다. 또한, EMSA는 조사중인 RNA / 단백질 상호 작용의 특이성 결합 친화력 및 화학량 론을 결정하는 데 사용될 수있다.

섹션 3 및 4 프로토콜에 기재된 방사성 표지 된 프로브 IRE 제조 하였다. 프로브의 서열은 5'-CUG GGGCGAAUUC GAGCUCGGUA CCCGGGGAUC UUCAA C C AGUGC UUGGA CGGAUCCU-3 '이었다; 굵은 뉴클레오티드는 중요한 IRE 기능입니다 짝이없는 C 잔류 루프를 나타냅니다. 프로브의 특정 방사능 4.5 × 109 CPM / μg의 RNA의이었다. 활성 IRE는 결합에 철 교란의 효과를 평가하기 위해, 뮤린 RAW264.7 대 식세포는 방치 또는 헤민 (철 공급원) 또는 desferrioxamine (철 킬 레이터)으로 처리 하였다. 용 해물을 제조하고 IRE 프로브 (8,000 CPM / μg의 단백질)와 EMSA에 의해 분석 하였다. 대표 데이터는 각각 좌측 및 우측 패널의 autoradiograms 짧고 긴 노출이,도 1에 도시되어있다. 쥐 IRE /...

여기에서 우리는 RNA / 단백질 상호 작용을 분석하는 프로토콜을 제시한다. 전기 영동 이동성 변화 분석 (EMSA)이 네이티브 겔 전기 영동시 RNA / 단백질 복합체 및 무료 RNA의 차분에 기초하여 이동된다. 방사성 표지 된 RNA 프로브를 사용함으로써, RNA / 단백질 복합체는 오토 라디오 그래피에 의해 시각화 될 수있다.

IRE / IRP 예 : RNA - 단백질 상호 작용의 연구에 대한 전기 이동 기동성 교대 분석 실험 (EMSA)

RNA/protein interactions are critical for post-transcriptional regulatory pathways. Among the best-characterized cytosolic RNA-binding proteins are iron ...

다음 실험의 전반적인 목표는 전기영동 이동성 이동 분석을 사용하여 세포 추출물의 RNA 단백질 상호 작용을 분석하는 것입니다. 이는 먼저 세포나 조직에서 추출한 단백질을 별도의 단계로 준비하여 유전자 특이적 무선 표지 RNA 프로브를 합성하고 정제함으로써 달성됩니다. 그런 다음 단백질 추출물을 표지된 RNA 프로브와 혼합하여 특정 RNA 단백질 복합체를 형성할 수 있습니다.마지막으로, 반응 생성물은 비 변성 폴리 아크릴아미드 겔에 적재되고 전기영동이 없는 RNA 프로브로 분석되어 더 빠른 이동성 덕분에 RNA 단백질 복합체에서 분리됩니다. 전기영동 이동성 이동 분석은 RNA 단백질 상호 작용을 분석하는 데 널리 사용됩니다. 우리는 철 조절 단백질인 IRP 1과 IRP 2가 표적 RNA 요소에 결합하는 것을 분석할 수 있었습니다.그러나이 방법은 또한 다른 RNA 결합 단백질의 연구에 적용 할 수 있으며,이 절차는 내 실험실의 Dr.Kain 필리핀 연구원과 박사후 연구원 인 Dr.Nicole Wilkinson에 의해 수행 될 것임을 보여줍니다. 얼음처럼 차가운 PBS로 세포를 두 번 씻은 다음 얼음처럼 차가운 PBS 1ml를 넣고 플라스틱 세포 스크레이퍼로 세포를 수확합니다. 느슨한 셀 현탁액을 새로운 1.5ml 원심분리기 튜브로 옮깁니다.미리 냉각된 섭씨 4도의 마이크로 원심 분리기에 튜브를 놓습니다. 5분 동안 저속으로 스핀다운하고 수프 나탄트를 흡입합니다. 세포는 튜브 바닥에 흰색 펠릿으로 나타납니다.1,000만 개의 세포를 채취할 때마다 100마이크로리터의 얼음처럼 차가운 세포질 용해 완충액을 추가합니다. 여러 번 위아래로 피펫팅하여 세포 펠릿을 느슨하게 한 다음 얼음 위에서 20분 동안 현탁액을 배양합니다. 이것은 세포막을 용해시키고 모든 세포질 함량을 완충액으로 방출합니다.용해된 세포질 분획을 분리하려면 섭씨 4도의 원심분리기에서 튜브를 최대 속도로 10분 동안 회전시킨 다음, 정화된 스내트를 얼음 위의 새 1.5ml 튜브로 옮기고 펠릿을 버립니다. 다음으로, Bradford assay를 사용하여 생성된 세포질 추출물의 총 단백질 농도를 측정합니다. 생성된 세포질 추출물을 더 작은 튜브로 분취하고 신선한 조직에서 세포질 추출물을 생산하는 데 사용할 때까지 섭씨 영하 80도에서 보관합니다.안락사된 동물을 해부판 위의 깨끗한 패드에 눕혀 수확 과정을 시작합니다. 가위로 복부를 엽니다. 가위와 집게를 사용하여 간과 비장을 제거합니다.조직 분해를 방지하기 위해 약 50ml의 얼음처럼 차가운 PBS로 각 조직을 헹굽니다. 즉시 메스로 조직을 약 1-2입방 밀리미터의 작은 조각으로 지체 없이 자릅니다. 새 극저온 튜브에 티슈를 넣고 스냅합니다.샘플을 액체 질소에 동결시킵니다. 냉동 조직은 필요할 때까지 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 이전에 냉동된 조직 샘플을 250-500마이크로리터의 얼음 저온 용해 완충액이 들어 있는 평평한 바닥의 2밀리리터 튜브로 옮겨 세포질 추출물을 만들기 시작합니다.조직 균질화 팁을 튜브에 넣고 중간 전력으로 장치를 켭니다. 균질화 10초 후 즉시 튜브를 얼음 위에 20분 동안 올려 놓아 단백질 변성을 방지합니다. 세포질 분획을 분리하려면 섭씨 4도의 원심분리기에서 10분 동안 최대 속도로 튜브를 회전시키고 정화된 상등액을 얼음 위의 새 1.5ml 튜브로 옮기고 펠릿을 버립니다.생성된 세포질 추출물의 총 단백질 농도를 Bradford assay를 사용하여 측정합니다. 생성된 세포질 추출물을 더 작은 튜브에 Aqua 넣고 필요할 때까지 섭씨 영하 80도에서 보관합니다. 프로토콜을 계속하기 전에 플렉시글라스 실드 가이거 계수기가 있는 방사선 안전 작업대를 설정하십시오.실험실 가운의 세포 분석 모니터링 태그와 적절한 방사선 특정 날카로운 물건 및 날카롭지 않은 폐기물 용기를 사용하십시오. 복제된 철 반응 요소를 포함하는 선형화된 DNA 플라스미드로 시작합니다. 템플릿으로, 템플릿 반응 버퍼, 부분 방사성 뉴클레오티드 및 RNA 중합효소를 실온에서 피펫과 혼합하여 20마이크로리터 in vitro RNA 전사 반응을 설정합니다.RNA 합성을 시작하려면 섭씨 40도에서 1시간 동안 샘플을 배양합니다. 1마이크로리터의 0.5몰 EDTA pH 8.0을 첨가하여 시험관 내 전사 반응을 종료합니다. 위아래로 피펫팅하여 EDTA를 혼합합니다.이제 표준 알코올 침전 프로토콜을 사용하여 RNA 산물을 정제합니다. 시작하려면 pH 5.2에서 10마이크로리터의 TRNA와 82.5마이크로리터의 3몰 아세트산나트륨을 합성 후 혼합물과 와류에 추가합니다. 혼합하기 위해 TRNA는 침전 운반체로 작용하고 최종 RNA 수율을 증가시켜 RNA를 침전시킵니다.273 마이크로 리터의 95-100 % 에탄올을 넣고 볼텍싱으로 혼합합니다. RNA를 분리하기 위해 실온에서 10분 동안 튜브를 벤치에 그대로 두어 침전 반응을 진행하고 실온 원심분리기에서 튜브를 10분 동안 최고 속도로 회전시켜 침전 반응을 진행하도록 합니다. 피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 버리고 펠릿을 방해하지 마십시오.침전된 RNA는 튜브 바닥 근처에 작은 흰색 펠릿으로 존재하거나 육안으로 보이지 않을 수 있습니다. 100-500 마이크로 리터의 70 % 에탄올을 첨가하여 펠릿을 세척하십시오. 실온에서 10분 동안 최고 속도로 샘플을 회전시킨 다음 뚜껑으로 스내트를 디캔팅합니다.튜브를 벤치에 10-15분 동안 열어 두어 RNA 펠릿을 열어서 건조시킵니다. 100마이크로리터의 뉴클레아제 자유수를 첨가하여 고체 방사 표지 RNA를 재구성합니다. RNA 용액을 액체 sation counter Eloqua에 배치하여 방사성 뉴클레오티드 통합 정도를 정량화합니다.라디오는 RNA 프로브를 더 작은 튜브에 넣고 필요할 때까지 섭씨 영하 80도에서 보관합니다. 냉동 분취액은 전기영동 이동성 전환 분석을 시작하기 전에 최대 3주 동안 사용할 수 있으며, 레인당 더 많은 시료 부피를 용이하게 하기 위해 최소 16 x 16cm 크기의 표준 6% 비변성 아크릴아마이드 겔을 준비할 수 있습니다. 그리고 이 크기의 젤의 기계적 안정성을 향상시키기 위해.최소 1mm 두께의 유리 스페이서와 빗을 사용하십시오. 먼저 전기영동 이동성 이동 분석을 진행하기 위해 이전에 동결된 세포질 용해물과 무선 표지된 RNA가 눈에서 실험의 단백질 성분을 탐사합니다. 세포질 추출물 25마이크로그램을 세포질 용해 완충액으로 최종 총 부피 10마이크로리터로 희석합니다.필요한 경우 혼합물에 1마이크로리터의 2개의 미스톡 용액을 첨가하고 단백질 샘플을 얼음 위에 보관합니다. RNA 분대의 경우, 방사 표지를 붙인 RNA 프로브를 뉴클레아제가 없는 물에 200, 마이크로리터 당 분당 000 카운트로 희석하여 섭씨 95도의 RNA를 1분 동안 자연화하고 용액을 실온에서 최소 5분 동안 냉각시킵니다. 단백질 RNA 결합 반응을 시작하려면 단백질 추출물에 1마이크로리터의 무선 표지 RNA 프로브를 추가하여 실온에서 20분 동안 결합이 일어나도록 합니다.전기영동 이동성 이동 분석의 특이성을 높이려면 1마이크로리터의 헤파린 스톡을 반응에 첨가합니다. 방사성 표지된 RNA 프로브가 60개의 뉴클레오티드보다 긴 경우 1마이크로리터의 RNA T 1을 추가로 추가합니다. 실온에서 결합 반응을 10분 더 계속하여 특이성을 더욱 높이고 RNA 단백질 복합체를 더 잘 분리할 수 있도록 합니다.3마이크로리터의 로딩 버퍼와 피펫을 위아래로 추가하여 혼합합니다. 그런 다음 6%아크릴아미드 겔에 전체 반응을 로드하고 60분 동안 센티미터 당 5볼트로 겔을 실행합니다. 적절한 방사선 차폐로 장치를 덮으십시오.겔 장치를 분해하고 겔을 큰 여과지에 옮깁니다. 어두운 방에서 젤 건조 진공 장치를 사용하여 젤을 건조시킵니다. 젤과 여과지 조합을 조각 위에 놓습니다.노출 후 필름을 현상하고 자연 건조합니다. 최적의 노출 시간은 1시간에서 하룻밤까지 다양할 수 있습니다. 철 함량이 다양한 조직 배양 세포에서 방사성 IRE 프로브에 대한 I RRP 1 및 I RRP 2의 철 의존성 결합 능력을 평가할 수 있습니다.따라서, IRE 결합 활성은 이전에 K 나중에 데페록사민으로 처리된 철이 고갈된 세포에서 유도됩니다. 반대로, IRE 결합 활성은 이전에 철이 적재된 세포에서 헤만으로 처리된 철이 적재된 세포에서 억제됩니다. I RRP 1의 IRE 결합 활성은 철 황 클러스터의 조립 후 손실되는 반면 I RRP 2는 철 의존성 분해를 겪습니다.IRP one의 철세포 클러스터는 휴면 IRE 결합 활성을 모니터링 할 수있는 2 % 2 me로 세포 추출물을 처리하여 파괴 할 수 있습니다. I RRP 2의 활동은 2 me에 의해 회복되지 않습니다. 이 다음 실험에서, 세포 철 농도의 함수로서 I RRP 1 및 IRP 2의 IRE 결합 활성은 야생형 I RRP 1 녹아웃 및 I RRP 2 녹아웃 마우스의 신선한 간 조직의 맥락에서 평가됩니다.여기서 데이터는 간 철분 부하를 증가시키는 것으로 알려진 높은 철분 식단을 마우스에게 먹이면 야생형 마우스의 간 추출물에서 I RRP 1 및 IRP 2의 IRE 결합 활성이 감소하는 것을 촉진한다는 것을 보여줍니다. I rrp 두 개의 IRE 복합체는 I RRP 1의 존재에 의해 편향됩니다. 그들은 I RRP one 녹아웃 마우스의 간 추출물에서 쉽게 시각화됩니다.여기서 높은 철분 다이어트는 IRP 2의 완전한 비활성화로 이어집니다. 이 동영상을 시청한 후에는 전기영동 이동도 이동 분석법으로 RNA 단백질 상호 작용을 분석하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. RNA 프로브의 품질이 성공에 매우 중요하다는 점을 기억하십시오.

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사전 mRNA의 과도 특성으로 인해, 그것은 분리하고 공부하기에 어려울 수...

인간 사전 mRNA에 매핑 Ribonucleoproteins에 대한 신속한 하이 스루풋 방법 (RNPs)

이 비디오에서는 적외선 형광 표지 DNA 프로브를 사용하여 단백질-DNA 상호 작용을 감지하는 전기영동 이동성 이동 분석을 시연합니다. 단백질이 DNA 프로브에 결합할 때, 천천히 이동하며 겔에 이동된 밴드로 나타나는 큰 복합체를 형성합니다.

transcription factor-DNA 복합체 검출을 위한 전기영동 이동성 전환 분석

이 비디오에서는 관심 대상 단백질에 대한 특정 RNA 결합 서열을 식별하기 위해 지수 농축(SELEX) 방법에 의한 리간드의 체계적인 진화를 설명합니다. 단백질은 무작위 RNA 염기서열의 대규모 풀과 함께 배양되며, 단백질 결합 RNA 염기서열은 단백질 결합 부위를 식별하기 위해 분리, PCR 증폭 및 염기서열 분석됩니다.

RNA-단백질 상호작용을 식별하기 위한 SELEX 기반 체외 결합 분석

우리는 전사 인자(TF) DNA 결합에 영향을 미치는 비암호화 유전적 변이를 식별하기 위한 전략적 계획과 프로토콜을 제시합니다. 유전자형 의존성 TF DNA 결합의 전기영동 이동성 이동 분석(EMSA) 및 DNA 친화성 침전 분석(DAPA) 분석을 위한 자세한 실험 프로토콜이 제공됩니다.

전기 영동 이동성 분석 (EMSA) 및 Shift 키를 사용하여 기능 비 코딩 유전자 변형에 대한 심사 DNA 화성 강수 분석 (DAPA)

우리는 여기서 중요한 생물학적 문제를 해결하기 위해 사례 연구와 같은 적외선 형광 염료 표지 DNA 프로브와 함께 정제 된 SOX-2 단백질을 사용하여 형광 전기 영동 이동성 이동 분석 (fEMSA)의 최적화 된 프로토콜을 설명합니다.

적외선 형광 염료로 표지 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 전기 영동 이동성 시프트 분석을위한 최적화 된 프로토콜

네이티브 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동은 RNA- 단백질 상호 작용을 분석하기위한 기본적인 도구입니다. 전통적으로 대부분의 실험에서는 수직 겔을 사용했습니다. 그러나, 수평 겔은 전기 영동 중에 복합체를 모니터링 할 수있는 기회와 같은 몇 가지 이점을 제공합니다. 우리는 수평 네이티브 겔 전기 영동을 생성하고 사용하기위한 상세한 프로토콜을 제공합니다.

단백질 -RNA 복합체의 향상된 검출을위한 수평 겔 전기 영동

사이트 지시 된 mutagenesis deoxyribonucleic 산 (DNA) 특정 돌연변이 소개 하는 기술 이다. 이 프로토콜 사이트 감독 mutagenesis 2 스텝을 수행 하는 방법을 설명 하 고 3 단계 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 기반 접근, 관심의 모든 DNA 조각에 적용 됩니다.

사이트 감독 Mutagenesis에 대 한 생체 외에서 그리고 Vivo 실험 대장균 RNA 상호 Exemplified에서

이 방법에서, 우리는 세균 세포에서 단순, 살아있는, 리포터 분석법을 사용하여 동축 및 비동종 결합 부위에 RNA 결합 단백질(RBPs)의 결합 친화도를 정량화한다. 분석은 기자 유전자의 억압에 근거를 둔다.

박테리아에서 단백질 RNA 결합을 정량화하기위한 분석

여기에 제시된 단백질-핵산 상호작용을 연구하기 위해 널리 적용될 수 있는 비오틴 라벨을 이용한 시험관내 생화학적 분석에 대한 프로토콜이다.

비오틴 라벨을 사용하여 단백질-핵산 상호 작용을 연구하는 생체외 생화학 적 분석을 통해

여기에서, 우리는 포유류 세포에서 내인성 RNA 결합 사이트 또는 RNA의 "발자국"을 풍부하게 하는 프로토콜을 제시합니다:단백질 (RNP) 복합체. 이 접근은 RNP 소단위의 2개의 면역 강절을 관련시키고 그러므로 나란히 RNA 면역 침전이라고 불립니다 (RIPiT).

RNA의 발자국 의 식별:연속RNA 면역 침전을 통한 단백질 복합체 시퀀싱 (RIPiT-Seq)

배우세요 전기 이동 기동성 교대 분석(EMSA)을 이용하여 세포 추출물에서 RNA-단백질 상호작용을 분석하는 방법입니다. 이 기법은 철 조절 단백질의 결합 역학 연구에 활용됩니다.

IRE / IRP 예 : RNA - 단백질 상호 작용의 연구에 대한 전기 이동 기동성 교대 분석 실험 (EMSA)

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