Name: IRE / IRP 예 : RNA - 단백질 상호 작용의 연구에 대한 전기 이동 기동성 교대 분석 실험 (EMSA) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-03T16:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 44 s
Description: 배우세요 전기 이동 기동성 교대 분석(EMSA)을 이용하여 세포 추출물에서 RNA-단백질 상호작용을 분석하는 방법입니다. 이 기법은 철 조절 단백질의 결합 역학 연구에 활용됩니다.

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이 연구는 캐나다 보건 연구소(Canadian Institutes for Health Research)의 보조금(MOP-86514)으로 지원되었습니다.

쥐 실험 절차는 맥길 대학 (프로토콜 4966)의 동물 관리위원회에 의해 승인되었다. 배양 된 세포에서 단백질 추출물 1. 준비 <ol><li> 얼음처럼 차가운 인산 완충 생리 식염수 10 ㎖ (PBS)로 두 번 배양 세포를 씻으십시오. </li><li> 고무 경찰관 또는 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 얼음처럼 차가운 PBS, 전송 현탁액 1 ㎖의 플라스틱 셀 스크레이퍼 중 하나에 부착 된 세포를 다 쳤어요. </li><li> 4 ° C에서 700 XG에 5 분의 microcentrifuge에 스핀. 대기음 PBS. </li><li> 10 7 세포 당 얼음처럼 차가운 세포질 용해 버퍼 100 ㎕ (표 1)를 추가하고 아래로 피펫. </li><li> 얼음에서 20 분 동안 인큐베이션. </li><li> 4 ° C에서 마이크로 원심에서 최고 속도로 10 분 동안 스핀. </li><li> 취소 펠렛. 새로운 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 뜨는을 전송하고 얼음에 보관하십시오. </li><li> DET브래드 포드 분석 (23)를 사용하여 - (10 ㎍ / μL 일반적으로 1) 순백의 단백질 농도. </li><li> 사용할 때까지 -80 ° C에서 나누어지는 및 저장 세포 추출합니다. </li></ol> 마우스 간 및 비장에서 단백질 추출물 2. 준비 <ol><li> CO 2 흡입으로 마우스를 안락사. </li><li> 해부 보드 위에 깨끗한 패드의 안락사 동물을 놓습니다. 가위로 복부를 엽니 다. </li><li> 가위 집게를 사용하여 간 및 비장을 해부하고, 약 50 ml의 빙냉 PBS에서 각 조직을 헹군다. </li><li> 즉시 메스 작은 조각으로 조직을 절단 (예 : 약 1-2mm 3). </li><li> 지체없이 신선한 cryotube에 조직의 조각을 넣고 액체 질소를 고정 스냅. 스토어 스냅인 냉동 조직 씩을 사용할 때까지 -80 ° C에서. </li><li> 0.5 ㎖의 - 0.25 - (2 내지 3mm 정도 1) 동결 조직의 한 조각 균질화세포질 빙냉 용해 완충액 (표 1) 10 초 동안 조직 균질화. </li><li> 20 분 동안 얼음에 1.5 ml의 microcentrifuge 관과 진정으로 균질을 전송합니다. </li><li> 4 ° C에서 마이크로 원심에서 최고 속도로 10 분 동안 스핀. </li><li> 새로운 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 펠렛 및 전송 상층 액을 제거한다. 얼음에 보관하십시오. </li><li> 브래드 포드 분석 (23)를 사용하여 - (10 ㎍ / μL 일반적으로 1) 단백질 농도를 결정합니다. </li><li> 사용할 때까지 -80 ° C에서 나누어지는 및 저장 세포 추출합니다. </li></ol> 방사성 표지 IRE 프로브 3. 준비 <ol><li> 제한 효소 XbaI으로 (플라스미드 당 1 μg의 U), IRE 서열의 하류로 절단하여, 1 시간 동안 37 ° C에서 배양하여 IRE 함유 플라스미드 I-12.CAT 22 선형화. 선형화 된 플라스미드는 시험 관내 전사를위한 템플릿으로 사용됩니다. </li><li> 설정N 체외 20㎕의 전체 부피에서 전사 반응. 표 2에 나타낸 스톡 솔루션을 사용하고 추가 1 μL 선형화 된 플라스미드 주형 4 μL 전사 버퍼; ATP / CTP / GTP 믹스 1 ㎕를 혼합, 10 ㎕의 [α- 32 P] -UTP, 2 μL 디티 오 트레이 톨, 1 ㎕의 RNA 분해 효소 억제제 및 1 μL의 T7 RNA 폴리머 라제. 로 pipetting 아래로 섞는다. </li><li> 1 시간 24 40 ° C에서 품어. </li></ol> 방사성 표지 IRE 프로브 4. 정제 <ol><li> 피펫 팅 아래로 0.5 M EDTA, pH가 8 믹스 1 μl를 추가하여 시험 관내 전사 반응을 종료합니다. </li><li> 더 나은 침전 캐리어로, 10 ㎎ / ㎖의 tRNA의 10 μl를 추가합니다. 로 pipetting 아래로 섞는다. </li><li> 3 M 암모늄 아세테이트 82.5 μl를 추가합니다. 와동에 의해 섞는다. </li><li> 에탄올 273 μl를 추가합니다. 와동에 의해 섞는다. </li><li> 5 분 동안 RT에 서 보자. </li><li> RT에서 마이크로 원심에서 최고 속도로 10 분 동안 스핀. 취소 상층 액. </li><li> 워시는 70 % 에탄올 100 ㎕로 펠렛. </li><li> RT에서 마이크로 원심에서 최고 속도로 10 분 동안 스핀. 취소 상층 액. </li><li> 10 분 동안 공기 건조 펠렛. </li><li> 이중 증류수 100 ㎕에 재현 탁 펠릿은, 이전에 H 2 O를 멸균 </li><li> 사용할 때까지 -80 ° C에서 액체 섬광 계수기의 방사능, 나누어지는 방사성 동위 원소 표지의 IRE 프로브와 저장소를 정량화. 냉동 분취 최대 3 주 동안 사용될 수있다. </li></ol> EMSA에 대한 기본 폴리 아크릴 아미드 겔 5. 준비 <ol><li> 1.5 mm 스페이서와 빗을 사용하여 겔 (16 × 16cm)를 조립합니다. </li><li> 표 3에 도시 된 원액을 사용하여, 6 % 폴리 아크릴 아미드 겔 네이티브을 제조 7.5 ㎖의 40 % 아크릴 아미드의 혼합 :. 비스 아크릴 아미드, 5X TBE 5 ㎖과 37.5 ml에더블 증류수 H 2 O </li><li> 10 % 새롭게 제조 된 황산 암모늄 (APS) 25 μL의 테트라 메틸 에틸렌 디아민 (TEMED)의 0.5 ML을 추가합니다. </li><li> 즉시 젤에 아크릴 아미드 솔루션을 붓고 중합 할 수 있습니다. 약 30 분 동안 기다립니다. </li><li> 상기 겔 전기 영동 장치를 조립하여 0.5X TBE의 탱크를 채우기와 전원 연결. </li></ol> 6. 전기 이동 기동성 교대 분석 실험 <ol><li> 10 μL의 총 부피에서 세포질 또는 세포 용해 완충액 (표 1)과 조직으로부터의 단백질 추출물의 25 μg의 희석 (저급 단백질 농도도 사용될 수있다). 얼음에 보관하십시오. 25 : 4 휴면 IRP1 (2 % 최종 농도)를 활성화 2- 머 캅토 에탄올 (2-ME)로 희석 : 필요한 경우, 1의 1 μl를 추가합니다. </li><li> 95 °에서 두 번 증류수에 방사성 동위 원소 표지 IRE 프로브를 희석 2 O 200,000 CPM / μL, 열 변성에1 분 C, 그리고 적어도 5 분 동안 실온에서 냉각. </li><li> 단백질 추출물에 방사성 동위 원소 표지 IRE 프로브의 1 μl를 추가하여 EMSA 반응을 설정합니다. </li><li> 실온에서 20 분 동안 품어. </li><li> 반응 50 ㎎ / ㎖ 헤파린의 1 μl를 추가 (프로브 (9)와 비 특정 단백질 상호 작용을 억제하기 위해) 또 다른 10 분 동안 배양을 계속합니다. -80 ° C에서 스톡 헤파린 용액 (50 ㎎ / ml) 및 저장소 나누어지는. </li><li> 긴 방사성 표지 된 프로브 (&gt; 60 개 뉴클레오티드)를 사용하는 경우, 1 μL의 RNase T1 (1 U / μL)를 첨가하고, RT에서 10 분 동안 인큐베이션 프로브 비특이적 결합 단백질을 줄이기 위해, 및 RNA / 단백질의 잘 구분할 수 있도록 전기 영동시 복잡한. </li><li> 로딩 버퍼 (80 % 글리세롤 + 브로 모 페놀 블루)의 3 μl를 추가, 혼합 6 % 비 변성 폴리 아크릴 아미드 겔에로드. </li><li> 130 V (5 V / cm)에서 60 분 동안 젤을 실행합니다. </li><li> 티를 ransfer 큰 필터 종이 건조 위에 젤. </li><li> 필름에 노출 및 오토 라디오를 개발한다. 노출 시간은 1 시간 (이하)에서 O / N까지의 범위 일 수있다. </li></ol>

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</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

여기서, 우리는 IRP1과 IRP2의 IRE 결합 활동을 연구하기 위해 개발 된 프로토콜을 설명하고 우리는 대표적인 데이터를 보여줍니다. 다른 프로브를 사용함으로써,이 프로토콜은 다른 RNA 결합 단백질의 연구를 위해 조정될 수있다. 중요한 단계는 탐침의 크기이다. 정확한 결합 부위를 알 수없는 경우 일반적인 긴 프로브의 사용은 무료 RNA 다르게 마이그레이션되지 않습니다 RNA / 단백질 복합체가 발생할 수 있습니다. 이 경우, RNAse가 T1 (단계 6.6)으로 처리함으로써 미 결합 RNA를 제거하는 것이 바람직하다. 프로브의 품질도 매우 중요하다. 최상의 결과를 새로 제조 된 방사성 동위 원소 표지 된 RNA를 얻을 수 있습니다. 겔 정제 (10)는 필요하지 않지만 (더 RNAse가 T1 소화 단계가 포함되지 않은 경우 등)을 검사 준비를위한 시험 관내 전사 반응이 조기 종료되는 제품을 산출하는 경우 EMSA의 외관을 향상시킬 수있다. 기본 겔 전기 영동...

EMSA는 원래 타겟 DNA 서열과 1,2- DNA 결합 단백질의 관계를 연구하기 위해 개발되었다. 원리는이 문서의 초점이다 RNA / 단백질 상호 작용 3, 비슷합니다. 간단히, RNA는 음전하 폴리 아크릴 아미드 (또는 아가로 오스) 겔에서 전기 영동 비 변성 중에 애노드쪽으로 이동한다. 겔 내에서 마이그레이션 충전량에 비례하는 RNA의 크기에 따라 달라집니다. 특정 RNA에 단백질의 결합은 무료 RNA에 비해 복잡한 마이그레이션하는 느린 이동성을 변경합니다. 이는 분자량의 증가뿐만 아니라, 충전 및 가능한 입체 구조의 변화에​​ 주로 기인한다. 프로브로 표지 된 RNA를 활용하여 &quot;젤 지연&quot;또는 &quot;bandshift&quot;쉽게 모니터링 할 수 있습니다. 32 P - 라벨 RNA 프로브의 사용은 매우 일반적이며 높은 감도를 제공합니다. RNA / 단백질 복합체 무료 RNA의 이동이 감지된다오토 라디오로. 단점 32 P (14.29 일), 방사선 분해로 인해 프로브의 품질의 점진적인 열화의 짧은 반감기이다 방사능 라이센스 방사능 작업 인프라 및 잠재적 생물 안전성 문제의 요구. 따라서, RNA 프로브 레이블을 대체 비 동위 원소 방법은 형광 또는 화학 발광 영상 4,5의 검출을 가능하게 형광 물질이나 바이오틴,와 예를 들어, 개발되었다. 이러한 방법의 제한은 높은 비용과 동위 원소 라벨에 비해 자주 감소 감도 및 RNA / 단백질 상호 작용을 방해하는 비 동위 원소 라벨의 가능성이 있습니다. 비 변성 폴리 아크릴 아마이드 겔은 가장 EMSA 애플리케이션에 적합하며 일반적으로 사용된다. 경우에 따라, 아가 로스 젤 큰 단지의 분석을위한 대안을 제기 할 수 있습니다. EMSA의 주요 장점은 단순성, 감도 및 안정성을 겸비한 4 점이다 &lt;/ SUP&gt;. 분석은 몇 시간 내에 완료 될 수 있고, 정교한 장비를 필요로하지 않는다. RNA / 단백질 상호 작용은 0.1 nm 이하의 낮은 농도에서 EMSA에 의해 검출 될 수 있고, 광범위한 결합 조건의 범위 내에서 (pH가 4.0-9.5, 가의 염 농도 1-300 ㎜, 온도 0-60 ℃). RNA / 단백질 복합체 형성은 필터 결합 분석에 의해 연구 할 수있다. 자유 RNA 프로브가 6을 통과하면서는 니트로 셀룰로오스 필터 RNA / 단백질 복합체의 유지에 기초하여, 간단하고, 빠르고, 저렴한 절차이다. EMSA에 비해, 그것은 RNA 프로브가 다중 결합 부위를 포함하거나 조 추출물이 동일한 사이트에서 프로브에 결합하는 하나 이상의 RNA 결합 단백질이 들어 가지 경우에 한정된다. 여러 RNA / 단백질 상호 작용은 필터 결합 분석에 의해 탐지되지 것이지만, 그들은 용이 EMSA에 의해 시각화 될 수있다. 어떤 경우에는, 시각화 이브이다N 가능한 경우, 겔에 더 지체를 산출, EMSA 반응에 RNA 결합 단백질 중 하나에 대한 항체를 추가하여 공동 마이그레이션 (예를 들어, 인간의 IRP1 / IRE 및 IRP2 / IRE 단지) 두 RNA / 단백질 복합체 ( &quot;supershift&quot;) 7. EMSA 널리 철 대사 8-10의 전사 후 레귤레이터이다 IRP1과 IRP2을 연구하는 데 사용되었다. 그들은 몇 가지의 mRNA (11)의 UTRs 내에서 IRES, 계통 발생 학적으로 보존 헤어핀 구조에 결합함으로써 작동합니다. IRES 먼저 페리틴 (12)와 트랜스페린 수용체 1 (TfR1) (13), 각각 철 저장 및 흡수의 단백질을 암호화하는 mRNA를 발견했다. 나중에, IRES는 적혈구 특정 aminolevulinate 신타 (ALAS2) 14 미토콘드리아 aconitase 15 ferroportin 16, 2가 금속 수송 체 1 (DMT1) 17, 저산소증 유도 성 인자 (2)에서 발견 된 <em&gt; α (HIF2α) (18), 및 기타의 mRNA 19-21. UTR &#39;TfR1의 mRNA는 3에서 여러 IRES를 포함하는 동안, UTR&#39;프로토 타입 H-와 L-페리틴의 mRNA는 5 일 IRE가 포함되어 있습니다. IRE / IRP의 상호 작용은 특히 입체 43S 리보솜 서브 유닛의의 연결을 차단하여 페리틴 mRNA의 번역을 억제; 또한, 그들은 endonucleolytic 분열에 대한 TfR1 mRNA의 안정화. IRP1과 IRP2 공유 광범위한 서열의 유사성과 철에 굶주린 세포에서 높은 IRE 결합 활성을 나타낸다. IRP2은 프로 테오 열화를 겪는 동안 철 구비 세포에서, IRP1는 그것 IRE 결합능 희생 aconitase 세포질로 변환 쿠반의 Fe-S 클러스터를 조립한다. 따라서, IRE / IRP 상호 작용은 세포 철 상태에 의존 할뿐만 아니라, H 2 O 2, 산화 질소 (NO) 또는 저산소증과 같은 다른 신호들에 의해 조절된다. 여기서는 E에 의해 조 세포 및 조직 추출물에서 IRE - 결합 활성을 평가하기위한 프로토콜을 묘사MSA. 우리는 IRE 서열은 원래 의해 하류 T7 RNA 중합 효소 사이트의 센스 방향에 도입 된 플라스미드 DNA 템플릿 (I-12.CAT)로부터 시험 관내 전사에 의해 생성 된 32 P - 표지 H-페리틴 IRE 프로브를 사용 어닐링 합성 올리고 뉴클레오티드 (22)의 복제.

<table><tbody><tr><td>leupeptin</td><td>SIGMA</td><td>L2884</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>SIGMA</td><td>78830</td><td></td></tr><tr><td>BioRad 단백질 분석</td><td>BIORAD</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNA 중합효소</td><td>Thermoscientific</td><td>EPO111</td><td></td></tr><tr><td>RNase Inhibitor</td><td>Invitrogen</td><td>15518-012</td><td></td></tr><tr><td>UTP [alpha-32P]</td><td>Perkin-Elmer</td><td></td><td></td>NEG507H</tr><tr><td>섬광 액체</td><td>Beckman Coulter</td><td>141349</td><td></td></tr><tr><td>heparin</td><td>SIGMA</td><td>H0777</td><td></td></tr><tr><td>Rnase T1</td><td>Thermoscientific</td><td>EN0541</td><td></td></tr><tr><td>장비</td><td></td><td></td><td></td>이름</tr><tr><td>: 조직 파열판</td><td>Qiagen</td><td>9001271</td><td></td></tr><tr><td>섬광 카운터</td><td>Beckman Coulter</td><td>LS6500</td><td></td></tr><tr><td>Protean II xi Cell</td><td>BIORAD</td><td>165-1834</td><td></td></tr><tr><td>20웰 빗</td><td>BIORAD</td><td>165-1868</td><td>1.5mm 두께</td></tr><tr><td>1.5mm 스페이서</td><td>BIORAD</td><td>165-1849</td><td></td></tr><tr><td>PowerPac</td><td>BIORAD</td><td>164-5070</td><td></td></tr></tbody></table>

ire / irp 예 : rna - 단백질 상호 작용의 연구에 대한 전기 이동 기동성 교대 분석 실험 (emsa)

Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) for the Study of RNA-Protein Interactions: The IRE/IRP Example

RNA / 단백질 상호 작용은 전사 후 조절 경로에 대한 중요합니다. 가장 특징 세포질 RNA 결합 단백질 중 철 조절 단백질, IRP1과 IRP2입니다. 그들은하여 mRNA를 번역 또는 안정성을 제어하는​​ 여러 대상의 mRNA의 번역되지 않은 지역 (UTRs) 내에서 반응 요소 (IRES)을 다림질 결합한다. IRE / IRP 상호 작용은 널리 EMSA에 의해 연구되고있다. 여기서, 우리는 다른 RNA 결합 단백질의 활성을 평가하기 위해 일반화 될 수 IRP1과 IRP2 IRE의 결합 활성을 EMSA 분석 프로토콜을 설명한다. RNA 결합 단백질, 또는이 단백질의 정제 된 제제를 함유하는 조단백질 해물, 복합체 형성을 가능하게 표지 된 32 P-RNA 프로브의 과량과 함께 배양된다. 헤파린 결합 프로브 비 특정 단백질을 배제하기 위해 추가됩니다. 이어서, 혼합물을 폴리 아크릴 아미드 겔상에서 비 변성 전기 영동에 의해 분석된다. 무료 프로브, 빠른 마이그레이션하는 동안 RNA / 단백질 복합체 전시 지체 이동; 그러므로, 절차는 또한 &quot;겔 위상차&quot;또는 &quot;bandshift&quot;분석 불린다. 전기 영동 완료 후, 겔을 건조 및 RNA / 단백질 복합체,뿐만 아니라 자유 프로브는, 오토 래디오 그래피에 의해 검출된다. 프로토콜의 전반적인 목적은 감지 IRE / IRP 및 기타 RNA / 단백질 상호 작용을 정량화하는 것이다. 또한, EMSA는 조사중인 RNA / 단백질 상호 작용의 특이성 결합 친화력 및 화학량 론을 결정하는 데 사용될 수있다.

섹션 3 및 4 프로토콜에 기재된 방사성 표지 된 프로브 IRE 제조 하였다. 프로브의 서열은 5'-CUG GGGCGAAUUC GAGCUCGGUA CCCGGGGAUC UUCAA C C AGUGC UUGGA CGGAUCCU-3 '이었다; 굵은 뉴클레오티드는 중요한 IRE 기능입니다 짝이없는 C 잔류 루프를 나타냅니다. 프로브의 특정 방사능 4.5 × 109 CPM / μg의 RNA의이었다. 활성 IRE는 결합에 철 교란의 효과를 평가하기 위해, 뮤린 RAW264.7 대 식세포는 방치 또는 헤민 (철 공급원) 또는 desferrioxamine (철 킬 레이터)으로 처리 하였다. 용 해물을 제조하고 IRE 프로브 (8,000 CPM / μg의 단백질)와 EMSA에 의해 분석 하였다. 대표 데이터는 각각 좌측 및 우측 패널의 autoradiograms 짧고 긴 노출이,도 1에 도시되어있다. 쥐 IRE /...

여기에서 우리는 RNA / 단백질 상호 작용을 분석하는 프로토콜을 제시한다. 전기 영동 이동성 변화 분석 (EMSA)이 네이티브 겔 전기 영동시 RNA / 단백질 복합체 및 무료 RNA의 차분에 기초하여 이동된다. 방사성 표지 된 RNA 프로브를 사용함으로써, RNA / 단백질 복합체는 오토 라디오 그래피에 의해 시각화 될 수있다.

IRE / IRP 예 : RNA - 단백질 상호 작용의 연구에 대한 전기 이동 기동성 교대 분석 실험 (EMSA)

RNA/protein interactions are critical for post-transcriptional regulatory pathways. Among the best-characterized cytosolic RNA-binding proteins are iron ...

다음 실험의 전반적인 목표는 전기영동 이동성 이동 분석을 사용하여 세포 추출물의 RNA 단백질 상호 작용을 분석하는 것입니다. 이는 먼저 세포나 조직에서 추출한 단백질을 별도의 단계로 준비하여 유전자 특이적 무선 표지 RNA 프로브를 합성하고 정제함으로써 달성됩니다. 그런 다음 단백질 추출물을 표지된 RNA 프로브와 혼합하여 특정 RNA 단백질 복합체를 형성할 수 있습니다.마지막으로, 반응 생성물은 비 변성 폴리 아크릴아미드 겔에 적재되고 전기영동이 없는 RNA 프로브로 분석되어 더 빠른 이동성 덕분에 RNA 단백질 복합체에서 분리됩니다. 전기영동 이동성 이동 분석은 RNA 단백질 상호 작용을 분석하는 데 널리 사용됩니다. 우리는 철 조절 단백질인 IRP 1과 IRP 2가 표적 RNA 요소에 결합하는 것을 분석할 수 있었습니다.그러나이 방법은 또한 다른 RNA 결합 단백질의 연구에 적용 할 수 있으며,이 절차는 내 실험실의 Dr.Kain 필리핀 연구원과 박사후 연구원 인 Dr.Nicole Wilkinson에 의해 수행 될 것임을 보여줍니다. 얼음처럼 차가운 PBS로 세포를 두 번 씻은 다음 얼음처럼 차가운 PBS 1ml를 넣고 플라스틱 세포 스크레이퍼로 세포를 수확합니다. 느슨한 셀 현탁액을 새로운 1.5ml 원심분리기 튜브로 옮깁니다.미리 냉각된 섭씨 4도의 마이크로 원심 분리기에 튜브를 놓습니다. 5분 동안 저속으로 스핀다운하고 수프 나탄트를 흡입합니다. 세포는 튜브 바닥에 흰색 펠릿으로 나타납니다.1,000만 개의 세포를 채취할 때마다 100마이크로리터의 얼음처럼 차가운 세포질 용해 완충액을 추가합니다. 여러 번 위아래로 피펫팅하여 세포 펠릿을 느슨하게 한 다음 얼음 위에서 20분 동안 현탁액을 배양합니다. 이것은 세포막을 용해시키고 모든 세포질 함량을 완충액으로 방출합니다.용해된 세포질 분획을 분리하려면 섭씨 4도의 원심분리기에서 튜브를 최대 속도로 10분 동안 회전시킨 다음, 정화된 스내트를 얼음 위의 새 1.5ml 튜브로 옮기고 펠릿을 버립니다. 다음으로, Bradford assay를 사용하여 생성된 세포질 추출물의 총 단백질 농도를 측정합니다. 생성된 세포질 추출물을 더 작은 튜브로 분취하고 신선한 조직에서 세포질 추출물을 생산하는 데 사용할 때까지 섭씨 영하 80도에서 보관합니다.안락사된 동물을 해부판 위의 깨끗한 패드에 눕혀 수확 과정을 시작합니다. 가위로 복부를 엽니다. 가위와 집게를 사용하여

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우리는 전사 인자(TF) DNA 결합에 영향을 미치는 비암호화 유전적 변이를 식별하기 위한 전략적 계획과 프로토콜을 제시합니다. 유전자형 의존성 TF DNA 결합의 전기영동 이동성 이동 분석(EMSA) 및 DNA 친화성 침전 분석(DAPA) 분석을 위한 자세한 실험 프로토콜이 제공됩니다.

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적외선 형광 염료로 표지 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 전기 영동 이동성 시프트 분석을위한 최적화 된 프로토콜

네이티브 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동은 RNA- 단백질 상호 작용을 분석하기위한 기본적인 도구입니다. 전통적으로 대부분의 실험에서는 수직 겔을 사용했습니다. 그러나, 수평 겔은 전기 영동 중에 복합체를 모니터링 할 수있는 기회와 같은 몇 가지 이점을 제공합니다. 우리는 수평 네이티브 겔 전기 영동을 생성하고 사용하기위한 상세한 프로토콜을 제공합니다.

단백질 -RNA 복합체의 향상된 검출을위한 수평 겔 전기 영동

사이트 지시 된 mutagenesis deoxyribonucleic 산 (DNA) 특정 돌연변이 소개 하는 기술 이다. 이 프로토콜 사이트 감독 mutagenesis 2 스텝을 수행 하는 방법을 설명 하 고 3 단계 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 기반 접근, 관심의 모든 DNA 조각에 적용 됩니다.

사이트 감독 Mutagenesis에 대 한 생체 외에서 그리고 Vivo 실험 대장균 RNA 상호 Exemplified에서

이 방법에서, 우리는 세균 세포에서 단순, 살아있는, 리포터 분석법을 사용하여 동축 및 비동종 결합 부위에 RNA 결합 단백질(RBPs)의 결합 친화도를 정량화한다. 분석은 기자 유전자의 억압에 근거를 둔다.

박테리아에서 단백질 RNA 결합을 정량화하기위한 분석

여기에 제시된 단백질-핵산 상호작용을 연구하기 위해 널리 적용될 수 있는 비오틴 라벨을 이용한 시험관내 생화학적 분석에 대한 프로토콜이다.

비오틴 라벨을 사용하여 단백질-핵산 상호 작용을 연구하는 생체외 생화학 적 분석을 통해

여기에서, 우리는 포유류 세포에서 내인성 RNA 결합 사이트 또는 RNA의 "발자국"을 풍부하게 하는 프로토콜을 제시합니다:단백질 (RNP) 복합체. 이 접근은 RNP 소단위의 2개의 면역 강절을 관련시키고 그러므로 나란히 RNA 면역 침전이라고 불립니다 (RIPiT).

RNA의 발자국 의 식별:연속RNA 면역 침전을 통한 단백질 복합체 시퀀싱 (RIPiT-Seq)

배우세요 전기 이동 기동성 교대 분석(EMSA)을 이용하여 세포 추출물에서 RNA-단백질 상호작용을 분석하는 방법입니다. 이 기법은 철 조절 단백질의 결합 역학 연구에 활용됩니다.

IRE / IRP 예 : RNA - 단백질 상호 작용의 연구에 대한 전기 이동 기동성 교대 분석 실험 (EMSA)

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