化学発光アッセイによるイネの免疫応答における活性酸素種産生のリアルタイム検出

このプロトコルは、イネ組織におけるPAMP誘発時にROS産生をリアルタイムで検出するための最適化されたL-012ベースの化学発光法について説明しています。この方法は、しっかりと制御された条件下で簡単で標準化されており、再現性が高いです。この手順を実演するのは、私の研究室の博士課程の学生であるOn Yingです。

まず、脱皮した米の種子を70%エタノールで1分間殺菌し、次に40%次亜塩素酸ナトリウムで1時間殺菌します。残留塩素を除去するために滅菌水で種子を5回すすいでください。稲鞘法では、滅菌ガラス容器内の種子をムラシゲとスクーグまたはMS培地で直接播種する。

リーフディスク法で種子をプレートするには、MSプレートに5〜7日間プレートしてから、成長マトリックスまたは土壌に移植します。12時間の明、12時間の暗い写真期間の成長室で苗を育てます。10日齢のイネ苗の鞘を鋭利なカミソリの刃または手術用刃で3ミリメートルのセグメントに切り、ROSアッセイの前日の前処理を行います。

100マイクロリットルの二重蒸留水を含む96ウェルマイクロタイタープレートの個々のウェルに5つのシースセグメントを10〜12時間配置します。プランジャー付きの生検パンチを使用して、4〜6週齢のイネから葉のディスクを切り取ります。データのばらつきを減らすために、常にメインティラーの2番目のリーフの中央3分の1からリーフディスクを切り取ります。

次に、前処理のために100マイクロリットルの二重蒸留水を含む96ウェルマイクロタイタープレートの個々のウェルに1枚のリーフディスクを10〜12時間入れます。葉の側面に関連する変動を避けるために、水の前処理のためにすべてのリーフディスクを浮かせて上向きに保ちます。9.4ミリリットルの50マイクロモルのトリス塩酸塩、400マイクロリットルのL012溶液、100マイクロリットルの西洋ワサビペルオキシダーゼ、および100マイクロリットルのFlg22を組み合わせて、誘発溶液を調製します。

200マイクロリットルの誘発溶液をウェルに加える。ソフトウェアを起動し、実験ボタンをクリックして新しいプロトコルを作成するか、既存のプロトコルを使用します。ポップアップの手順をクリックしてプレートを設定し、監視するプレートからウェルを選択します。

[キネティックを開始] をクリックし、実験の要件に応じてランタイムを 30 分以上に設定します。最小間隔を選択して、できるだけ頻繁に読み取り値を取得します。また、積分時間については、信号強度に応じて1秒以上を選択してください。

[検証]をクリックし、[OK]をクリックして設定を確認し、ポップアップで[新しいプレートを検出]をクリックして、ソフトウェアがロードプレートダイアログボックスを表示するのを待ちます。前処理された組織を含むウェルから二重蒸留水を慎重に取り除き、組織の損傷や乾燥を避けます。マルチチャンネルピペットを使用して、組織を含むウェルに200マイクロリットルの誘発溶液を追加します。

テストするプレートをキャリアに置き、検出を開始します。Flg22によるROSの誘導には、リーフディスクと3ミリメートルの長さの鞘を使用しました。ROSの生成は35分間監視されます。

バーは、5つのテクニカルリピートから計算された標準偏差の平均を示します。イネでは、ROS産生の増加は1〜2分で最初に検出され、10〜12分でピークに達し、約30〜35分でベースラインに戻りました。ROSの総量は曲線から計算した。

ROS値の合計量を取得するには、対応するデータセットに式を適用して各時間間隔で生成されたROSを計算し、式の合計を適用して生成された合計量を計算することで組み合わせることができます。リーフディスクの単一穴または2つの半分を、100マイクロリットルの二重蒸留水で10〜12時間前処理した96ウェルマイクロタイタープレートのウェルに入れ、次にROS誘導のためにFlg22で処理しました。2つのハーフディスクサンプルからの読み取り値は、リーフディスク全体からの読み取り値よりもはるかに高くなります。

平均して、2つのハーフディスクサンプルの合計値はリーフディスク全体の値のほぼ1.6倍であり、これはサンプルの面積ではなくエッジの長さに比例します。この結果は、ROSが主に創傷部位の細胞で生成されることを裏付けている。この手順を試みるときは、組織を穏やかに操作し、データのばらつきの原因となる可能性のある余分な切り抜きをしないでください。

この方法は、植物組織における他の任意のROS産生生理学的プロセスに適用することができる。