、検出し可視化し、アメーバモデル系で活性酸素種の生成を定量

次の実験の全体的な目標は、さまざまな活性酸素種またはROSとその局在を監視するための簡単で汎用性の高いソリューションを提供し、ROS関連の細胞メカニズムに関するさらなる洞察を提供することです。これは、3つの異なるアッセイを実行することによって達成され、最初のアッセイではRSTグリーンまたはOB Gコーティングビーズと生顕微鏡、ob gフルオレセイン、およびAlexaを使用します。Fluor 594は、BSAを介して3ミクロンのsicaビーズの表面に共有結合しています。

OBGフルオレセインからの蛍光発光はROSによる酸化を示し、Alexa Fluor 594からのシグナルはビーズの局在化に役立ち、蛍光定量のコントロールとして機能します。2番目の方法は、プレートリーダーベースのアッセイでスーパーオキシド感受性プローブジヒドロエチジウムまたはDHEを利用します。スーパーオキシドによる酸化の結果、エチジウムは核DNAとミトコンドリアDNAにインターカレートすることができ、励起ピークと発光ピークをそれぞれ522ナノメートルと605ナノメートルにシフトしています。

AUMの蛍光強度はスーパーオキシド産生量に対応しており、細胞内の細胞内スーパーオキシド生成を定量的に測定することができます。3番目の方法もプレートリーダーベースのアッセイです。過酸化水素感受性プローブプレックスウルトラレッドまたはURは、細胞外過酸化水素産生を定量的に測定するために使用されます。

UR OXの蛍光強度は、細胞外で生成される過酸化水素の量に対応します。結果は、O-B-G-D-H-EおよびURアッセイに基づく動的ROS生成の局在を示す結果が得られます。この手法がプレートレートベースのOB GSAなどの他の既存の方法と比較した場合の主な利点は、アルロスの生成をシングルセルレベルで動的に視覚化できることです。

ミラーリングの代わりに、細胞集団からのRothシグナルを平均化します。このような集団平均化法は、非同期食作用のために重要な情報を不明瞭にする傾向があります。オキシ、バートグリーン、またはOBGでビーズをコーディングする手順を開始するには、3.0ミクロンのカルボキシル化シリカビーズの懸濁液を1.5ミリリットルのチューブに1ミリリットル加えます。

チューブを回転させて、上清をすばやく取り除きます。この方法で1ミリリットルのPBSとボルテックスを追加します。ビーズをPBSで3回洗います。

3回目の洗浄後、上清を取り除き、ビーズを再懸濁します。1ミリリットルあたり25ミリグラムのシアン化物を含むPBSの1ミリリットルでは、シアン化物溶液は、使用前に毎回新たに調製する必要があります15分間ホイール上でインキュベートします。これにより、カルボキシル化シリカビーズが活性化され、15分後に事前に標識されたBSAに共有結合し、チューブを遠心分離し、上清を除去します。

カップリングバッファーの1ミリリットルを追加し、余分なシアン化物を除去するためにクイックスピンとボルテックスでカップリングバッファーで3回ボルテックス洗浄し、洗浄したビーズを1ミリグラムのOBGHを含むカップリングバッファーの500マイクロリットルと混合します2つのH-F-F-B-S-A、次いでチューブに標準的なガス缶からの窒素ガスを充填します。翌日、室温で14時間ホイールでインキュベートしたチューブをキャッピングした後、1ミリリットルのクエンチングバッファーでビーズを2回洗浄し、クイックスピンとボルテックスでクエンチングした後、カップリングバッファーで2回洗浄してクエンチングバッファーを除去します。上清を除去した後、50μgのLOR 594 cinを中エステルに含むカップリングバッファー1ミリリットルを加えて、BSAに結合させます。

チューブに窒素キャップを充填し、暗所で室温で1.5時間ホイール上でインキュベートします。1.5時間のインキュベーションの終わりに、ビーズを1ミリリットルのクエンチングバッファーで3回洗浄して反応を停止します。その後、ビーズを1ミリリットルのPBSで3回洗浄します。

最後に、レイは、ボリュームあたり10%の重量の2マイクロリットルでPBSの1ミリリットルにビーズを懸濁します。長期保存用のアジド。懸濁液中のビーズの濃度をヘモサイトメーターで測定すると、通常は1ミリリットルあたり10〜9ビーズの1〜2倍です。

チューブに窒素キャップを入れ、暗所で摂氏4度で保管します。この手順は、10 cmのペトリ皿プレートから指数関数的に増殖するアリウム細胞を回収することから開始します。光学的に透明なプラスチックまたはガラスの底を持つ3センチメートルの皿に細胞の異なる密度を、翌朝一晩で成長させます。

実験で使用するには、約 80% のコンフルエントなディッシュを選択します。培地を低流量培地またはLF培地と交換し、実験前に2時間インキュベートして、HL five C培地の細胞外およびエンドソーム内の自家蛍光を減らします。1.5%BDO寒天10ミリリットルをLF培地で溶かし、平らな面に寒天を流し込むと、厚さ約1mmの寒天層が形成されます。

寒天が固まるまで10〜15分待ちます。寒天層を2 x 2センチメートルの正方形に切り、後で使用するためにLFミディアムに入れます。使う。広視野顕微鏡を修理します。

環境チャンバーの温度を22°Cに設定し、実験に必要な設定を調整します。2時間のインキュベーション後、3cm皿からLF培地を吸引しますが、細胞単層を培地の薄膜で覆ったままにします。予め調製したOBGコーティングビーズを1ミリリットルあたり7番目のビーズの1.5倍の10に希釈し、細胞層に10マイクロリットルを追加します。

正方形の寒天シートを1枚取り、余分な液体を排出しますが、寒天は濡れたままにしてください。寒天を細胞層の上にそっと置きます。寒天オーバーレイは、ビーズと細胞の間の接触を増加させ、それによって取り込みを改善します。

また、細胞をわずかに圧縮し、対物レンズの焦点面に細胞をより良く保ちます。実験の成功のために皿に蓋を置きます。AGAオーバーレイが細胞を覆っているときは動かさず、また、イメージングステップをすぐに開始することが重要です。

次に、ディッシュを顕微鏡ステージに置き、赤、緑、位相の各チャンネルで2時間以上、1分ごとに自動的に写真を撮ります。ROS産生を測定するには、食作用の全過程を含む細胞イベントを選択し、焦点を当てます。プロの画像処理ソフトウェアを使用して、最適化された3つのチャンネルをマージし、画像をムービーに組み立てます。

選択した各ビーズの蛍光強度を赤チャンネルと緑チャンネルで定量化します。赤と緑の比率は、細胞の動的なFOMO産生を反映します。細胞内スーパーオキシド産生を測定するには、まず、HL 5 C培地10ミリリットルに180%コンフルエントディッシュのアリウムを収集し、次にアリウム細胞をGの850倍で5分間遠心分離し、培地をSS 6.4バッファーカウント細胞に再懸濁細胞を吸引し、最終密度10の6倍に希釈して10ミリリットルあたり6細胞にします。

白色の不透明な96ウェルプレートの各ウェルに50マイクロリットルの細胞懸濁液を添加し、SS 6.4バッファーで希釈したジヒドロエチジウムまたはDHEストック500倍にします。次に、マルチチャンネルピペットを使用して、希釈したDHEの50マイクロリットルを96ウェルプレートの各ウェルに分注します。DHEの最終濃度は30マイクロモルです。

さっそく反応が始まります。刺激または阻害剤は、特定のニーズに応じて、この時点でまたは他の時点で追加することができる。細胞を22°Cで培地振とうしながらインキュベートします。

蛍光マイクロプレートリーダーで2分おきに1時間蛍光を読み取ります。522ナノメートルの蛍光励起と605ナノメートルの発光でエンドポイントトップ読み取りモードを使用します。この手順は、前のセグメントで示したように、ジウムセルを含む96ウェルプレートを準備することから始めます。

希釈した西洋わさびペルオキシダーゼまたはHRPを調製するには、10ミリリットルのSS 6.4バッファーに5マイクロリットルのHRPストックを加えます。チューブを反転させてよく混ぜ、氷の上に保ちます。希釈されたHRP溶液は0.05単位/ミリリットルです。

プレックスウルトラレッドまたはUR反応混合物を、URストックと希釈したHRP溶液をSS 6.4バッファーに混合し、最終濃度6.25まで調製します。マイクロモル A UR および 0.005 単位/ミリリットル。HRPは、各ウェルに50マイクロリットルのUR混合物を追加します。

さっそく反応が始まります。刺激または阻害剤は、特定のニーズに応じて、この時点でまたは他の時点で追加することができる。細胞を22°Cで培地振とうしながらインキュベートします。

蛍光マイクロプレートリーダーで2分おきに1時間蛍光を読み取ります。530ナノメートルの蛍光励起と590ナノメートルの発光でエンドポイントトップ読み取りモードを使用します。OB gフルオレセインのコーティング効率は、過酸化水素とHRPを使用してコーティングされたビーズをin vitroで酸化し、500ナノメートルの励起を使用して発光スペクトルを確認することによってテストされます。

このグラフに示すように、酸化ビーズは、少なくとも11〜12倍の強度比を持つ非酸化ビーズのそれと比較して、538ナノメートルで有意な発光ピークを示します。ジウム細胞内のファゴソームにおけるROSの生成は、この代表的なタイムラプス動画が示すように、顕微鏡で定性的かつ動的に可視化することができます。これは、上昇後の最初の1分間を6倍の拡大鏡で40分間撮影したものです。食作用により、OBG蛍光コーティングビーズの蛍光は赤色から明るいオレンジ色に変化し、ROSがファゴソーム内で直接産生された可能性が高いことを示しています。

細胞内スーパーオキシドおよび細胞外過酸化水素産生は、それぞれDHEおよびURアッセイによって定量的に測定されます。これら2つのアッセイに関連する生化学反応の要約を示します。DHEアッセイでは、スーパーオキシドはスーパーオキシドジスムターゼまたはSODによって過酸化水素に変換され、過酸化水素はカタラーゼによって水と酸素に変換されます。

マイクロプレートリーダーは、細胞内スーパーオキシドのミディアムスループット定量測定に使用されます。代表的な実験では、大腸菌由来のLPSAリポ多糖類で刺激すると、AX 2細胞からの動的スーパーオキシド産生は、非刺激AP細胞由来の基礎レベルよりも有意に高くなり、反応の背景であるバッファー内での青色蛍光の減少と赤色蛍光の増加は逆相関していることが示されています。予想通り。

DHEアッセイによって測定されたROS産生の局在は、以下の結果によって確認されます。D-E-D-T-C-A膜透過性スーパーオキシドジスムターゼ阻害剤の添加物添加は、用量依存的にDHEシグナルを増加させ、D-E-D-T-Cがスーパーオキシドジスムターゼ基質の蓄積を引き起こしたことを示しました。あるいは、メンブレンIMP過酸化水素クエンチャーの添加は、A URアッセイにおけるスーパーオキシド産生に影響を与えませんでした。

マイクロプレートリーダーは、細胞外過酸化水素産生のミディアムスループット定量測定に使用されます。代表的な実験では、LPSで刺激すると、AX 2細胞からの動的過酸化水素産生は、非刺激AX 2細胞からの基礎レベルよりも有意に高くなり、バックグラウンド反応は、さまざまな濃度のD-E-D-T-Cまたはカタラーゼで処理すると、細胞内スーパーオキシドからの過酸化水素産生の阻害と細胞外過酸化水素の枯渇により、A URシグナルが用量依存的に減少することを示しています。D-E-D-T-Cとカタラーゼによる治療により、DHEおよびURアッセイがROSインディカムのさまざまなタイプと細胞内局在を特異的に測定することが明示的に確認されました。

病原性細菌または非病原性細菌に感染した際のロス生成をミラーリングするなどの他の方法を実行して、ディクタル種牡馬が損失発生の観点からさまざまな細菌感染にどのように応答するかなどの追加の質問に答えることができます。また、微生物マルムなどの病原菌を扱う作業は非常に危険であり、この手順を実行する際には、適切なBSLの2つの対策を常に講じる必要があることを忘れないでください。