Name: 、検出し可視化し、アメーバモデル系で活性酸素種の生成を定量 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-05T18:30:00.000+00:00
Duration: 16 min 41 s
Description: 学ぶアメーバモデル系における活性酸素種の検出・可視化・定量法。蛍光顕微鏡とプレートリーダーを用いて、細胞内過酸化物と細胞外過酸化水素を動的に測定し、酸化ストレス研究に有用なデータを提供します。

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私たちは、ヘルプと、これらのプロトコルを設定するために助言を博士カール·ハインツ·クラウスとヴィンセントジャケに感謝していて、また、それらの技術的なサポートのためにNCCR博士ナビンGopaldassのバイオイメージングプラットフォームからクリストフ·バウアーとジェローム若いアカシカの未発達の枝角に感謝します。研究は、スイス国立科学財団のProDoc助成金によってサポートされています。

1。可視化とファゴソーム内のROS生産の定性的測定 OBGコーティングしたビーズは、事前に準備する必要があります。ビーズコーティング手順および寒天オーバーレイ技術が公表された参考文献5,14から適応されます。 <ol><li> 1.5ミリリットルチューブに3.0ミクロンのカルボキシル化シリカビーズ（約1.8×10 9ビーズ）の1ミリリットル懸濁液を添加し、ビーズを迅速にスピンし、ボルテックスにより1mlのPBSで3回洗う。 </li><li> 25 mg / mlのシアナミドを含有する1mlのPBSでビーズを再懸濁し（共有結合前標識BSAに結合することがカルボキシル化シリカビーズを活性化するため）、15分間ホイール上でインキュベートする。 </li><li>ウォッシュクイックスピンカップリング緩衝液1ミリリットル（0.1Mホウ酸ナトリウム、pH8.0）で3倍（あるいはテーブルのフルスピードで遠心5秒トップのミニ遠心機や、テーブルトップ遠心機で1分間2000×gで遠心分離）し、過剰シアナミドを削除するためにボルテックス。 </li><li> C500μlで洗浄したビーズをミックスOxyBurstグリーン1mgの（OBG）H2HFF（ジヒドロ-2 &#39;、4,5,6,7,7&#39; - hexafluorofluorescein）-BSAを含むバッファをoupling、キャッピング前に、標準ガス缶から窒素ガスでチューブを記入し、暗闇の中で、室温で14時間（一晩）ホイール上に静置します。 </li><li>ビーズは（PBS中にグリシン250 mm）が素早く回転し、ボルテックスによりクエンチング緩衝液を除去するために、カップリング緩衝液で2回、未反応のOBGを削除し、バッファを消光1ミリリットルで2回洗う。 </li><li> BSAに結合させるためにアレクサフルオロ594スクシンイミジルエステル50μgのを含むカップリング緩衝液1ミリリットルを加える。キャッピング前に窒素でチューブを記入し、暗所で室温で1.5時間、ホイール上に静置します。 </li><li>ビーズが反応を停止させ、迅速にスピンし、ボルテックスによりバッファを消光1ミリリットルで3回洗浄し、ビーズは、迅速にスピンし、ボルテックスにより1mlのPBSで3回洗浄します。 </li><li>最後に、長期保存のためのVアジド/ wの10％の2μlのPBS 1mlにビーズを再懸濁する。 concentratioを測定血球計数器（通常は約1〜2×10 9ビーズ/ ml）で懸濁液中のビーズのnは、キャッピング前に窒素でチューブを記入し、暗闇の中で、4℃で保存する。 </li><li> OBGフルオレセインの塗着効率は、500nmでの励起を用いて発光スペクトルをチェックすることによって試験することができる。西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）の存在下でH 2 O 2で酸化すると、酸化されたビーズの蛍光強度は、発光ピーク（538nmで）で、非酸化コーティングされたビーズのそれよりも11〜12倍高い。 </li><li>収穫は指数関数的に光学的に透明なプラスチックやガラス底で3センチディッシュ上の細胞の密度の異なるプレートと、一晩、それらを成長さを10cmシャーレから細胞性粘菌細胞を増殖させる。実験の約80％コンフルエントである料理を選択してください。 細胞性粘菌の細胞を培養するための詳細なプロトコルは、15を公表されている。 </li><li> LoFlo媒体（LF培地）で、培地を交換し、インキュベートHL5C培地の細胞外およびエンドソーム内の自家蛍光を低減するために、実験の前に2時間。 </li><li>並行して、10〜15待つ、約1mmの厚さの寒天層を形成するために、平坦面（×10cmの10cmの、すなわちガラス板）上に寒天を入れ、LF培地10mlに1.5％バクト寒天を溶かす分固化させる。後で使用するためのLF媒体が2cm×2センチメートルの正方形、所定の位置に寒天層をカット。 </li><li>一方、回転ディスクまたは広視野顕微鏡を用意し、22℃の環境室の温度を設定し、この実験に必要な設定を行います（議論の中で、追加のコメントを参照してください）​​。 </li><li>インキュベーションの2時間後に3 cmディッシュからLF培地を吸引するが、細胞単層は依然として媒体の薄膜によって覆われるべきである。 1.5×10 7ビーズ/ mlにコーティングされたビーズを希釈し、細胞層の上に10μlを加える。 </li><li> 1平方寒天シートを取り、余分な液体を排出ウェットキープ。そっと目を入れる細胞層の上にE寒天の正方形。それは、細胞の上に横たわっているとき寒天四角を移動しないでください。寒天重層することにより取り込みを改善する、ビーズと細胞との接触を増加させるために使用し、また、わずかに対物レンズの焦点面に良好それらを維持、細胞を圧縮する。 </li><li> 2時間以上毎に1分、皿にふたをする顕微鏡ステージ上に配置し、自動的に、赤、緑、位相チャンネルで写真を撮る。 </li><li>選択し、食作用の全体のプロセスが含まれている細胞事象に焦点を当てる。最適化された3チャンネルをマージし、専門的な画像処理ソフトを使ってムービーに写真を組み立てる。赤色および緑色チャネルにおいて選択された各ビーズの蛍光強度を定量化し、緑/赤の比は、細胞の動的ファゴソームROS産生を反映する。 </li></ol> 2。細胞内スーパーオキシド生産の定量的および中期スループット測定<ol><li> Oを収集NE 80％コンフルエントHL5C培地10ml中の細胞性粘菌の一品。 5分間850×gで遠心分離細胞性粘菌細胞は、慎重に、完全に余分なメディアを吸引除去する。 SS6.4バッファに再懸濁した細胞[ソレンセン·バッファ内の0.12のソルビトール（14.69のKH 2 PO 4および6.27のNa 2 HPO 4）、pHが6.4]、細胞をカウントし、6×10 6細胞/ mlの最終濃度に希釈する（議論の中で、追加のコメントを参照してください）​​。 </li><li> （議論の中で、追加のコメントを参照してください）​​白い不透明な96ウェルプレートの各ウェルに細胞懸濁液50μlを加える。 </li><li>必要に応じて、各ウェルにマルチチャンネルピペットを用いへDHEストック（DMSO中30 mM）を希釈したDHEのSS6.4、ピペット50μlと500倍に希釈します。 DHEの最終濃度は30μmである。反応がすぐに開始されます。 </li><li>刺激または阻害剤は、特定のニーズに応じて、この時点で、または他の時点で添加することができる。 </li><li> 「トップリーディング＆＃エンドポイントを使用34、522 nm/605 nmでの蛍光励起/発光の蛍光マイクロプレートリーダーのモード、1時間、2分毎に読み取り、媒体振れ22℃で5秒/分</li></ol> 3。定量的および細胞外のH 2 O 2産生のハイスループット測定<ol><li> 2.1と2.2で説明したのと同じ手順に従ってください。 </li><li> SS6.4、渦の10ミリリットルに、HRPの株式の5μL（蒸留水に100 U / ml）を加えて希釈したHRPを準備したり、よく混ぜ、後で使用するために氷の上に維持するためにチューブを反転させる。希釈したHRP溶液は0.05 U / mlである。 </li><li>それぞれ、AURストック（DMSO中10 mMのAUR）および6.2510μMの最終濃度までSS6.4バッファに希釈したHRP溶液、および0.005 U / mlのを混合することにより、AUR反応液を調製する。例として、40の反応のための反応混合物を調製する希釈したHRPを400μlとAUR原液2.5μlのSS6.4の1600μLを混ぜる。 </li><li> AURミックス50μLを追加必要に応じて、マルチチャンネルピペットを用いて各ウェルにTURE。今反応が開始されます。 </li><li>刺激または阻害剤は、特定のニーズに応じて、この時点で、または他の時点で添加することができる。 </li><li> 530 nm/590 nmで蛍光励起/発光の蛍光マイクロプレートリーダーの終点「トップ読み」モードを使用し、22℃で、1時間、中ブレ5秒/分ごとに2分を読む</li></ol>

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<li>Fey, P., Kowal, A. S., Gaudet, P., Pilcher, K. E., Chisholm, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+for+growth+and+development+of+Dictyostelium+discoideum%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocols for growth and development of Dictyostelium discoideum.</a> Nat. Protoc. 2, 1307-1316 (2007).</li>
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</ol>

利害の対立が宣言されていません。

前述の方法に比べて、OBGアッセイは、動的に代えて、細胞の集団からの平均ROSシグナルを測定する、単一細胞レベルでファゴソームROS生成の過程を視覚化する。このような人口の平均化の方法は非同期食作用によって引き起こされる重要な情報を不明瞭にする傾向があります。我々が正常に細胞性粘菌にDHEとAURアッセイを適応とプロトコルを最適化した。最も重要なことは、我々はこれら2つのアッセイで測定したタイプと、ROSの細胞内局在を指定しました。一緒になって、 細胞性粘菌のためのROSの測定プロトコルのセット全体は、自然免疫、細胞分化や細胞内シグナル伝達などのROS関連の細胞メカニズムを研究するために便利で強力なシステムを提供します。 OBGアッセイのために、コーティングされたビーズの調製は実験の成功のために重要である。原因哺乳中の受容体を介した貪食取り込みの複雑さn個のセルは、粒子は、摂取をトリガするために（ 例えば、IgGを用いて）オプソニン化する必要がある。哺乳動物細胞における低取り込み効率が大幅にファゴソームROS生成の個々のイベン...

活性酸素種（ROS）は、宿主防御、シグナル伝達、組織の発達および損傷に対する反応、ならびに高血圧症および癌などの生物学的プロセスの様々に関与している。よく研究ファゴソームNADPHオキシダーゼの機械は、好中球&#39;ファゴソーム1で摂取細菌を殺すために、酸化的バーストとして知られている急速なROS発生、に捧げられています。また、ミトコンドリア呼吸鎖の副産物としての電子の漏れが以前はROSの規制されていない元の原因であると考えられていた。しかし、最近では、マウスマクロファージ2中の細菌の死滅intraphagosomalに貢献する重要な機構として同定された。近年では、社会的なアメーバ、 細胞性粘菌は 、自然免疫応答の細胞本来のメカニズムを研究するための強力かつ人気の高いモデルとなっています。実際、 細胞性粘菌と人間の食細胞はmoleculaにおける保全の驚くほど高いレベルを共有細菌は、飲み込みを感知して、3,4を殺すための責任のR機械。このような、NADPHオキシダーゼ、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、などのROS産生や解毒に関わるタンパク質や酵素のホモログは、人間と細胞性粘菌の両方に記載されています。最もよく研究され、アメーバのように、 細胞性粘菌は、哺乳類のモデル系に比べていくつかのユニークな利点を提供します。それらは、8〜10時間の倍加時間で、CO 2を必要とせずに室温で成長する。それらは容易に付着または懸濁培養物として維持することができる。また、彼らの完全に配列決定し、注釈付きの半数体ゲノムに、かつ容易に遺伝子操作のおかげで、 細胞性粘菌は非常に魅力的な実験モデル生物となっています。 これまでの研究では、活性酸素による酸化後に蛍光を発する（総称OxyBurstグリーン、OBGとして知られている）フルオレセインの様々な塩素化およびフッ素化誘導体は、活性酸素のレポーターとして使用されてきた。細胞透過性EST細胞非透過性デキストラン又はタンパク質結合誘導体は、細胞外ROSを測定するために使用される一方erified誘導体は、細胞質のROSを測定するために使用される。特に、OBG BSA-コーティングされたビーズは、既に哺乳類細胞5ファゴソーム内ROS産生を検出するために使用されてきた。しかし、マイクロプレートリーダーベースのアプローチは、細胞の集団からの平均ROSの生成カーブを与えることができる。現在のプロトコルでは、 細胞性粘菌 、専門の食細胞、および最適化された実験条件を使用することにより、我々は、ビーズ上に任意のオプソニンを結合させることなく、安定的かつ効率的な食作用を得る。 DHEは、ROS産生6-9を検出するために、そのような哺乳動物好中球およびマクロファージなどの種々のモデル系において使用されている。一方、メソッド8,10の特異性と感度をある程度の論争があります。アンプレックスレッドの改良版として、AURの蛍光強度を測定することがより適してpHに対する感度が低い非中性または弱酸性的環境におけるROS。 AURは最近、いくつかの哺乳類系11,12が、非常に多くの場合、弱酸性増殖培地を必要とする非哺乳類モデルにおけるその使用に適用されている、まだ報告されていない。また、定量的かつ動的な社会アメーバ細胞性粘菌におけるROS産生および局在を測定するための公表プロトコルがありません。 プロトコルの提示組の目標は、様々なROS及びそれらの局在をモニタリングすることが容易で汎用性の高いソリューションを提供し、さらにROS関連の細胞機構への洞察を与えることである。 OBGアッセイのために、我々は、 細胞性粘菌細胞によるOBG被覆ビーズの取り込み後のファゴソームROS生成のプロセス全体を監視するために、ライブ顕微鏡を用いて、細菌のintraphagosomal死滅の機序を研究するための新しいアプローチを提供した。我々は、細胞内superoxを測定するために、 細胞性粘菌媒体スループットDHEとAURアッセイを最適化した強力なROS刺激剤としてLPSを使用して、それぞれIDEおよび細胞外のH 2 O 2の生産、、。 LPSが最近貪食細菌13に向けて細胞性粘菌の殺菌活性を増加させることが示されたことに注意してください。また、DEDTCおよびカタラーゼを用いた治療は、明示的にこれらの2つの方法を具体的に、異なる種類や細胞性粘菌におけるROSの細胞内局在を測定することを確認した。最後に、OBGアッセイは、さらに、動物細胞の食作用性受容体のリガンドでビーズをオプソニン化することにより、任意の接着性食細胞に適合させることができる。原則として、DHEおよびAURアッセイはまた、適切な実験条件下で任意の接着性または非接着性の細胞で測定用に微調整することができます。

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>OxyBURST Green H2HFF BSA</td><td>Invitrogen</td><td>O-13291</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>A-20004</td><td></td></tr><tr><td>カルボキシル化シリカビーズ</td><td>Kisker Biotech</td><td>PSi-3.0COOH</td><td></td></tr><tr><td>HL5C medium</td><td>ForMedium</td><td>HLC0102</td><td></td></tr><tr><td>LoFlo medium</td><td></td><td>LF1001</td><td></td></tr><tr><td>バクト寒天</td><td>BD</td><td>204010</td><td></td></tr><tr><td>ジヒドロエチジウム</td><td>Σ</td><td>37291-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Amplex UltraRed</td><td>Invitrogen</td><td>A36006</td><td></td></tr><tr><td>西洋ワサビ ペルオキシダーゼ</td><td>ロシュ</td><td>10108090001</td><td></td></tr><tr><td>ジエチルジチオカルバメート (DEDTC)</td> <td>Σ</td><td>D3506-100G</td><td></td></tr><tr><td>カタラーゼ</td><td>シグマ</td><td>C9322-1G</td><td></td></tr><tr><td>シアナミド</td><td>シグマ</td><td>187364-25G</td><td></td></tr><tr><td>リポ多糖</td><td>類シグマ</td><td>L2630-25G</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>ibidi &mu;-ディッシュ 35 mm、高</td><td>イビディ</td><td>81156</td> 底部は<td>光学的に透明なプラスチック製</td></tr><tr><td>MatTek ディッシュ 35 mm</td><td>MatTek コーポレーション</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>底部はガラスカバースリップ</td></tr><tr><td>セプター セルカウンター</td><td>メルク ミリポア</td><td>PHCC00000</td><td></td></tr><tr><td>ホワイト 96ウェルプレート</td><td>Nunc</td><td>236108</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>SORVALL</td><td>Legend RT</td><td></td></tr><tr><td>マイクロプレートリーダー</td><td>BioTek</td><td>Synergy MX</td><td></td></tr></tbody></table>

、検出し可視化し、アメーバモデル系で活性酸素種の生成を定量

Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

活性酸素種（ROS）のいずれかを動的に触媒的または自然に相互変換又は排除される反応性短命の、酸素含有分子の範囲を含む。最もによるROS及びそれらのソースおよび細胞内局在の多様性の短い寿命のために、全体像は、プロトコルの組み合わせを用いて注意深く測定することによって得ることができる。ここでは、OxyBurstグリーン（OBG）を使用して、三つの異なるプロトコルのセットをコーティングしたビーズ、またはジヒドロエチ（DHE）を提示し、アンプレックスUltraRed（AUR）は、定性的および定量的な細胞性粘菌などの専門食細胞内の様々な活性酸素を監視すること。我々は手順をコーティングビーズを最適化し、動的単一細胞レベルでintraphagosomal ROS生成を可視化するOBGコートビーズとライブ顕微鏡を使用していました。我々は、 大腸菌からリポ多糖（LPS）を同定細胞性粘菌におけるROS生成のための強力な刺激として大腸菌 。また、我々は、dはリアルタイム定量的にそれぞれ、細胞内および細胞外スーパーオキシドH 2 O 2産生を測定するためDHEとAURを用いて媒体スループットアッセイをeveloped。

ファゴソーム内ROSの発生を顕微鏡（ ファイルS1）により定性的にかつ動的に視覚化することができる。アレクサフルオロ594により放出された赤色の蛍光はpH非感受性であり、OBGの酸化はグリーンチャンネルでその蛍光を増加させながら、ファゴソーム環境では一定のまま。 インビトロでの発光スペクトルは、酸化されて非酸化OBG被覆ビーズは、酸化後の強度の有意な増加を示す、 図1Bに比較される。ライブイベントの可視化を容易にするために、2つのチャネルが取り込みの1分以内に、野生型AX2細胞に吸収合併し、食作用の間に赤からオレンジへの結果の色が変化している。緑色の蛍光の増加は、ファゴソームで、おそらく直接ROS生成を示している。マイクロプレートリーダー、細胞内スーパーオキシドの媒体スループット定量的に測定し、細胞外H 2 O 2産生を用いてふぃぎゅに示されているそれぞれ、図2Cおよび図3Bを再び。 AX2細胞からの基底ROS産生が、おそらく正規オキシド還元...

我々は、定性的および定量的研究のための様々なアメーバおよび哺乳動物細胞モデルに適用することができる反応性酸素種（ROS）の測定のためのプロトコルのセットを適合。

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or ...

本実験の全体的な目的は、さまざまな活性酸素種（ROS）とその局在をモニタリングするための簡便で汎用性の高いソリューションを提供し、ROSに関連する細胞メカニズムについてのさらなる知見を得ることにあります。これは3つの異なるアッセイを行うことで達成されます。その最初の方法では、RST greenまたはOB Gコーティングビーズと生細胞顕微鏡観察を使用します。ob g fluoresceinおよびAlexa Fluor 594は、BSAを介して3 µmのシリカビーズの表面に共有結合しています。OBG fluoresceinからの蛍光放出はROSによる酸化を示し、Alexa Fluor 594からの信号はビーズの局在化を助け、蛍光定量のコントロールとして機能します。2番目の方法は、プレートリーダーベースのアッセイにおいて、スーパーオキシドアニオン感受性プローブであるジヒドロエチジウム（DHE）を利用します。スーパーオキシドによる酸化の結果、エチジウムが核およびミトコンドリアDNAにインターカレーションし、励起および放出ピークがそれぞれ522 nanometersと605 nanometersにシフトします。AUMの蛍光強度はスーパーオキシドの産生量に対応しており、細胞内におけるスーパーオキシド生成の定量的な測定が可能です。3番目の手法もプレートリーダーを用いたアッセイです。過酸化水素感受性プローブであるplex ultra red（pUR）を用いて、細胞外への過酸化水素産生量を定量的に測定します。UR OXの蛍光強度は、細胞外で生成された過酸化水素の量に対応します。O-B-G-D-H-EおよびURアッセイに基づき、動的なROS生成の局在を示す結果が得られます。プレートリーダーベースのOB GSAなどの他の既存手法に対するこの手法の主な利点は、単一細胞レベルでAl Rothの生成を動的に可視化できることです。細胞集団からのミラーリングおよび平均化されたRothシグナルを用いるのではなく、本手法を採用します。このような集団平均化の手法は、非同期的な食作用により、重要な情報が不明確になる傾向があるためです。oxy、Burt GreenまたはOBGでビーズをコーティングする手順を開始するには、3.0 micronのカルボキシル化シリカビーズ懸濁液1 mLを1.5 mLチューブに加えます。チューブを遠心分離し、速やかに上清を除去します。1 mLのPBSを加え、ボルテックスします。この手順で、ビーズをPBSで3回洗浄します。3回目の洗浄後、上清を除去してビーズを再懸濁します。25 mg/mLのシアニドを含む1 mLのPBS中で、回転盤を用いて15分間インキュベートしてください。なお、シアニド溶液は使用直前に毎回調製する必要があります。これにより、カルボキシル化シリカビーズが活性化され、あらかじめ標識したBSAが共有結合します。15分後、チューブを遠心分離し、上清を除去してください。1 mLのカップリングバッファーを加え、クイックスピンとボルテックス操作によりカップリングバッファーで3回洗浄して、過剰なシアニドを除去します。洗浄したビーズを、1 mgのOBGH two H-F-F-B-S-Aを含む500 µLのカップリングバッファーと混合し、標準ガス缶の窒素ガスでチューブ内を満たします。チューブに蓋をし、回転ディスク（ホイール）を用いて室温・暗所で14時間インキュベートします。翌日、クイックスピンとボルテックス操作により1 mLのクエンチバッファーでビーズを2回洗浄し、未反応のOBGをクエンチします。その後、カップリングバッファーで2回洗浄し、クエンチバッファーを除去します。上清を除去した後、BSAにコンジュゲートさせるため、50 µgのLOR 594 cin a middle esterを含む1 mLのカップリングバッファーを加えます。チューブを窒素で満たしてキャップし、室温・暗所にてホイールを用いて1.5時間インキュベートします。1.5時間のインキュベーション後、1 mLのクエンチングバッファーでビーズを3回洗浄して反応を停止させます。続いて、1 mLのPBSでビーズを3回洗浄します。最後に、Rayさん、1 mLのPBSに2 µLの10% (w/v) アジ化ナトリウムを加え、ビーズを懸濁させて長期保存してください。ヘモサイトメーターを用いて懸濁液中のビーズ濃度を測定します。通常は1～2 × 10⁹ beads/mLとなります。チューブに窒素を充填してキャップを閉め、4 °Cの暗所で保存します。まず、10 cmのペトリ皿で指数増殖させたalium細胞を回収することからこの手順を開始します。光学的透明度の高いプラスチック製またはガラス製の底面を持つ3 cm皿に異なる密度の細胞を播種し、翌朝まで一晩培養します。実験に使用するために、コンフルエンシーが約80%のディッシュを選択します。HL-5C培地の細胞外およびエンドソーム内の自家蛍光を低減させるため、培地を低流量（LF）培地に交換し、実験前に2時間インキュベートします。1.5% BDOアガー10 mLをLF培地中で融解し、平坦な面にアガーを流し込んで、厚さ約1 mmのアガー層を形成します。アガロースが凝固するまで10〜15分間待ちます。アガロース層を2 cm四方の正方形に切り分け、後で使用するためにLF培地に入れておきます。広視野顕微鏡を調整します。環境チャンバーの温度を22 °Cに設定し、実験に必要な設定を調整します。2時間のインキュベーション後、3 cmディッシュからLF培地を吸引しますが、細胞単層が薄い培地膜で覆われた状態を維持してください。あらかじめ調製したOBGコートビーズを1.5 × 10⁷ beads/mLに希釈し、細胞層に10 µL添加します。正方形のアガーシートを1枚取り出し、余分な液体を切り捨てますが、アガーは濡れた状態に保ってください。アガーの正方形を細胞層の上にそっと置きます。アガーをオーバーレイさせることで、ビーズと細胞の接触が増え、取り込み効率が向上します。また、これにより細胞がわずかに圧縮され、対物レンズの焦点面により安定して保持されます。実験を成功させるため、ディッシュに蓋をしてください。細胞を覆っているAGAオーバーレイを動かさないでください。また、直ちにイメージング工程を開始することが極めて重要です。次に、ディッシュを顕微鏡のステージ上に配置し、赤色、緑色、および位相差チャネルで1分ごとに2時間以上の自動撮影を行います。ROS産生を測定するために、食作用の全過程を含む細胞イベントを選択し、ピントを合わせます。専門的な画像処理ソフトウェアを用いて、最適化した3つのチャネルを統合し、画像を動画にまとめます。選択した各ビーズの赤色および緑色チャンネルにおける蛍光強度を定量します。赤色と緑色の比率は、細胞におけるFOMO R生成の動態を反映します。細胞内スーパーオキシド生成を測定するには、まず、180%コンフルエントの状態のaliumを10 mLのHL five C培地で回収します。次に、alium細胞を850 ×gで5分間遠心分離し、培地を注意深く完全に吸引します。細胞をSS 6.4バッファーで再懸濁し、細胞数をカウントして、最終密度が6 × 10⁶ cells/mLになるように希釈します。白色の非透過性96ウェルプレートの各ウェルに、細胞懸濁液を50 µLずつ加えます。dihydro ethidium（DHE）ストック溶液をSS 6.4バッファーで500倍に希釈します。次に、マルチチャンネルピペットを使用して、希釈したDHEを96ウェルプレートの各ウェルに50 µLずつ分注します。DHEの最終濃度は30 µMとなります。反応は直ちに開始されます。必要に応じて、この時点または他の任意の時点で刺激剤または阻害剤を添加してください。細胞を22°Cで緩やかに振盪しながらインキュベートします。蛍光マイクロプレートリーダーを用いて、1時間にわたり2分ごとに蛍光を測定します。エンドポイントの上部読み取りモードを使用し、蛍光励起波長を522 nanometers、蛍光 emission 波長を605 nanometersに設定してください。本手順を開始する前に、前のセグメントで示した通り、dium細胞を播種した96ウェルプレートを準備してください。5 µLのHRPストック溶液を10 mLのSS 6.4バッファーに加えて、希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）を調製します。チューブを転倒混和してよく混ぜ、氷上で保持します。希釈後のHRP溶液の濃度は0.05 units/mLとなります。a URストックと希釈HRP溶液をSS 6.4バッファーに混合し、最終濃度が6.25 µM a URおよび0.005 units/mL HRPとなるように、plex ultra red（またはa UR）反応混合液を調製します。各ウェルにa UR混合液を50 µLずつ加えます。反応は直ちに開始されます。必要に応じて、この時点または他の時点で刺激剤や阻害剤を添加できます。細胞を22 °Cで緩やかに振盪しながらインキュベートします。蛍光マイクロプレートリーダーを用いて、1時間、2分ごとに蛍光を測定します。蛍光励起波長 530 nanometers、蛍光放出波長 590 nanometers のエンドポイント上部測定モードを使用してください。OB g fluorescein のコーティング効率は、過酸化水素と HRP を用いてコーティングされたビーズを in vitro で酸化させ、500 nanometers で励起して放出スペクトルを確認することで試験します。このグラフに示されているように、酸化ビーズは非酸化ビーズと比較して538ナノメートルに有意な放出ピークを示し、強度比は少なくとも11〜12倍となっています。dium細胞のファゴソームにおけるROSの生成は、取り込み後の最初の1分間を6倍の倍率で記録し、40分間撮影したこの代表的なタイムラプス動画のように、顕微鏡を用いて定性的かつ動的に可視化できます。 phagocytosisにより、OBG蛍光コーティングビーズの蛍光が赤から明るいオレンジ色に変化したことは、ROSがファゴソーム内部で直接生成された可能性が高いことを示しています。細胞内スーパーオキシドおよび細胞外過酸化水素の産生量は、それぞれDHEアッセイおよびURアッセイによって定量的に測定されます。これら2つのアッセイに関連する生化学反応の概要を示します。DHEアッセイにおいて、スーパーオキシドはスーパーオキシドディスムターゼ（SOD）によって過酸化水素に変換され、過酸化水素はカタラーゼによって水と酸素に変換されます。細胞内スーパーオキシドの中程度のスループットでの定量測定には、マイクロプレートリーダーが使用されます。代表的な実験では、e coli由来のLPSAリポ多糖で刺激した際、AX two細胞からの動的なスーパーオキシド産生量は、非刺激のAX two細胞からの基底レベルおよびバッファー中での反応のバックグラウンドよりも有意に高くなることが示されており、青色蛍光の減少と赤色蛍光の増加は、予想通り逆相関しています。DHEアッセイによって測定されたROS産生の局在は、以下の結果によって確認されました。膜透過性スーパーオキシドディスムターゼ阻害剤であるD-E-D-T-C-Aを添加したところ、DHEシグナルが用量依存的に増加し、D-E-D-T-Cがスーパーオキシドディスムターゼ基質の蓄積を引き起こしたことが示されました。一方、膜透過性過酸化水素クエンチャーの添加は、A URアッセイにおけるスーパーオキシド産生に影響を与えませんでした。マイクロプレートリーダーは、細胞外過酸化水素産生の中スループット定量測定に使用されます。代表的な実験では、LPSで刺激した際のAX two細胞からの動的な過酸化水素産生は、非刺激のAX two細胞からの基底レベルよりも有意に高くなることが示されています。また、さまざまな濃度のD-E-D-T-Cまたはカタラーゼで処理すると、前者は細胞内スーパーオキシドからの過酸化水素産生の抑制により、後者は細胞外過酸化水素の枯渇により、a UR信号が用量依存的に減少します。D-E-D-T-Cおよびカタラーゼによる処理により、DHEアッセイとa URアッセイが、異なる種類および細胞内局在のROSを特異的に測定していることが明確に確認されました。本手順に従って実施してください。病原性または非病原性細菌による感染中のRoss世代の鏡像化などの他の方法を用いることで、Dictal stallionが損失世代の観点から異なる細菌感染にどのように反応するかといった、さらなる疑問に答えることができます。また、microbacteria marumのような病原性細菌を取り扱うことは極めて危険であるため、この手順を遂行する際は、適切なBSL 2対策などの予防措置を常に講じることを忘れないでください。

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生物学

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学ぶアメーバモデル系における活性酸素種の検出・可視化・定量法。蛍光顕微鏡とプレートリーダーを用いて、細胞内過酸化物と細胞外過酸化水素を動的に測定し、酸化ストレス研究に有用なデータを提供します。

、検出し可視化し、アメーバモデル系で活性酸素種の生成を定量

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