Name: 악성 말초 신경초 종양의 마우스 모델에서 치료 표적을 식별하기 위한 유전자 프로파일링 및 게놈 규모 드롭아웃 스크리닝 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-08-25T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: 배우세요 악성 말초 신경초 종양의 마우스 모델에서 유전자 프로파일링 및 게놈 규모 shRNA 스크리닝을 활용한 치료 표적 식별 방법입니다. erbB3와 같은 필수 수용체를 발견하여 새로운 치료 전략 개발에 기여합니다.

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이 연구는 국립 신경 질환 및 뇌졸중 연구소(R01 NS048353 및 R01 NS109655 SLC의 보조금으로 지원되었습니다. R01 NS109655-03S1 - D.P.J.), 국립 암 연구소(R01 CA122804 - S.L.C.), 국방부(X81XWH-09-1-0086 및 W81XWH-12-1-0164 - S.L.C.).

종양의 치료 표적을 식별하고 비교하기 위한 게놈 규모 스크리닝

<ol><li>Carroll, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+promoting+the+pathogenesis+of+Schwann+cell+neoplasms%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms promoting the pathogenesis of Schwann cell neoplasms.</a> Acta Neuropathol. 123 (3), 321-348 (2012).</li>
<li>Longo, J. F., Weber, S. M., Turner-Ivey, B. P., Carroll, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+Advances+in+the+Diagnosis+and+Pathogenesis+of+Neurofibromatosis+Type+1+%28NF1%29-associated+Peripheral+Nervous+System+Neoplasms%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Anat+Pathol%22%5BJournal%5D)">Recent Advances in the Diagnosis and Pathogenesis of Neurofibromatosis Type 1 (NF1)-associated Peripheral Nervous System Neoplasms.</a> Adv Anat Pathol. 25 (5), 353-368 (2018).</li>
<li>Longo, J. F., Carroll, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RASopathies%3A+Biology%2C+genetics+and+therapeutic+options%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The RASopathies: Biology, genetics and therapeutic options.</a> Adv Cancer Res. 153, 305-341 (2022).</li>
<li>Birindelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rb+and+TP53+pathway+alterations+in+sporadic+and+NF1-related+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Rb and TP53 pathway alterations in sporadic and NF1-related malignant peripheral nerve sheath tumors.</a> Lab Invest. 81 (6), 833-844 (2001).</li>
<li>Legius, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TP53+mutations+are+frequent+in+malignant+NF1+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Chromosomes+Cancer%22%5BJournal%5D)">TP53 mutations are frequent in malignant NF1 tumors.</a> Genes Chromosomes Cancer. 10 (4), 250-255 (1994).</li>
<li>Menon, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+17p+deletions+and+p53+gene+mutations+associated+with+the+formation+of+malignant+neurofibrosarcomas+in+von+Recklinghausen+neurofibromatosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Chromosome 17p deletions and p53 gene mutations associated with the formation of malignant neurofibrosarcomas in von Recklinghausen neurofibromatosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (14), 5435-5439 (1990).</li>
<li>Upadhyaya, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+and+somatic+NF1+gene+mutation+spectrum+in+NF1-associated+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumors+%28MPNSTs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mutat%22%5BJournal%5D)">Germline and somatic NF1 gene mutation spectrum in NF1-associated malignant peripheral nerve sheath tumors (MPNSTs).</a> Hum Mutat. 29 (1), 74-82 (2008).</li>
<li>Kourea, H. P., Orlow, I., Scheithauer, B. W., Cordon-Cardo, C., Woodruff, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletions+of+the+INK4A+gene+occur+in+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumors+but+not+in+neurofibromas%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Deletions of the INK4A gene occur in malignant peripheral nerve sheath tumors but not in neurofibromas.</a> Am J Pathol. 155 (6), 1855-1860 (1999).</li>
<li>Nielsen, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malignant+transformation+of+neurofibromas+in+neurofibromatosis+1+is+associated+with+CDKN2A%2Fp16+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Malignant transformation of neurofibromas in neurofibromatosis 1 is associated with CDKN2A/p16 inactivation.</a> Am J Pathol. 155 (6), 1879-1884 (1999).</li>
<li>Gregorian, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PTEN+dosage+is+essential+for+neurofibroma+development+and+malignant+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">PTEN dosage is essential for neurofibroma development and malignant transformation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (46), 19479-19484 (2009).</li>
<li>Lee, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRC2+is+recurrently+inactivated+through+EED+or+SUZ12+loss+in+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">PRC2 is recurrently inactivated through EED or SUZ12 loss in malignant peripheral nerve sheath tumors.</a> Nat Genet. 46 (11), 1227-1232 (2014).</li>
<li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+mutations+of+SUZ12+in+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Somatic mutations of SUZ12 in malignant peripheral nerve sheath tumors.</a> Nat Genet. 46 (11), 1170-1172 (2014).</li>
<li>Varela, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+structural+rearrangements+in+genetically+engineered+mouse+mammary+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Somatic structural rearrangements in genetically engineered mouse mammary tumors.</a> Genome Biol. 11 (10), 100(2010).</li>
<li>Johnson, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-species+genomics+matches+driver+mutations+and+cell+compartments+to+model+ependymoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cross-species genomics matches driver mutations and cell compartments to model ependymoma.</a> Nature. 466 (7306), 632-636 (2010).</li>
<li>Kim, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+oncogenomics+identifies+NEDD9+as+a+melanoma+metastasis+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Comparative oncogenomics identifies NEDD9 as a melanoma metastasis gene.</a> Cell. 125 (7), 1269-1281 (2006).</li>
<li>Zender, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+validation+of+oncogenes+in+liver+cancer+using+an+integrative+oncogenomic+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification and validation of oncogenes in liver cancer using an integrative oncogenomic approach.</a> Cell. 125 (7), 1253-1267 (2006).</li>
<li>Uren, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+mutagenesis+in+p19%28ARF%29-+and+p53-deficient+mice+identifies+cancer+genes+and+their+collaborative+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Large-scale mutagenesis in p19(ARF)- and p53-deficient mice identifies cancer genes and their collaborative networks.</a> Cell. 133 (4), 727-741 (2008).</li>
<li>Starr, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transposon-based+genetic+screen+in+mice+identifies+genes+altered+in+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A transposon-based genetic screen in mice identifies genes altered in colorectal cancer.</a> Science. 323 (5922), 1747-1750 (2009).</li>
<li>Dupuy, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+sleeping+beauty+transposon+system+that+can+be+used+to+model+a+wide+variety+of+human+cancers+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A modified sleeping beauty transposon system that can be used to model a wide variety of human cancers in mice.</a> Cancer Res. 69 (20), 8150-8156 (2009).</li>
<li>Carroll, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Challenge+of+Cancer+Genomics+in+Rare+Nervous+System+Neoplasms%3A+Malignant+Peripheral+Nerve+Sheath+Tumors+as+a+Paradigm+for+Cross-Species+Comparative+Oncogenomics%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">The Challenge of Cancer Genomics in Rare Nervous System Neoplasms: Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumors as a Paradigm for Cross-Species Comparative Oncogenomics.</a> Am J Pathol. 186 (3), 464-477 (2016).</li>
<li>Huijbregts, R. P., Roth, K. A., Schmidt, R. E., Carroll, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypertrophic+neuropathies+and+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumors+in+transgenic+mice+overexpressing+glial+growth+factor+beta3+in+myelinating+Schwann+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Hypertrophic neuropathies and malignant peripheral nerve sheath tumors in transgenic mice overexpressing glial growth factor beta3 in myelinating Schwann cells.</a> J Neurosci. 23 (19), 7269-7280 (2003).</li>
<li>Kazmi, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+mice+overexpressing+neuregulin-1+model+neurofibroma-malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+progression+and+implicate+specific+chromosomal+copy+number+variations+in+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Transgenic mice overexpressing neuregulin-1 model neurofibroma-malignant peripheral nerve sheath tumor progression and implicate specific chromosomal copy number variations in tumorigenesis.</a> Am J Pathol. 182 (3), 646-667 (2013).</li>
<li>Brosius, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuregulin-1+overexpression+and+Trp53+haploinsufficiency+cooperatively+promote+de+novo+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Neuregulin-1 overexpression and Trp53 haploinsufficiency cooperatively promote de novo malignant peripheral nerve sheath tumor pathogenesis.</a> Acta Neuropathol. 127 (4), 573-591 (2014).</li>
<li>Hart, T., Brown, K. R., Sircoulomb, F., Rottapel, R., Moffat, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+error+rates+in+genomic+perturbation+screens%3A+gold+standards+for+human+functional+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">Measuring error rates in genomic perturbation screens: gold standards for human functional genomics.</a> Mol Syst Biol. 10 (7), 733(2014).</li>
<li>Hart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+and+Design+of+Genome-Wide+CRISPR%2FSpCas9+Knockout+Screens%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Evaluation and Design of Genome-Wide CRISPR/SpCas9 Knockout Screens.</a> G3. 7 (8), Bethesda. 2719-2727 (2017).</li>
<li>Longo, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+genomic+characterization+of+a+sporadic+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Establishment and genomic characterization of a sporadic malignant peripheral nerve sheath tumor cell line.</a> Sci Rep. 11 (1), 5690(2021).</li>
<li>Maser, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomally+unstable+mouse+tumours+have+genomic+alterations+similar+to+diverse+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chromosomally unstable mouse tumours have genomic alterations similar to diverse human cancers.</a> Nature. 447 (7147), 966-971 (2007).</li>
<li>Rahrmann, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forward+genetic+screen+for+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+formation+identifies+new+genes+and+pathways+driving+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Forward genetic screen for malignant peripheral nerve sheath tumor formation identifies new genes and pathways driving tumorigenesis.</a> Nat Genet. 45 (7), 756-766 (2013).</li>
</ol>

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

여기에 제시된 자세한 방법은 말초 신경계 종양 및 MPNST 발병 기전을 연구하기 위해 개발되었습니다. 이러한 방법이 효과적인 것으로 확인되었지만 여기에서 설명하는 방법에는 몇 가지 잠재적인 제한 사항이 있음을 인식해야 합니다. 아래에서는 이러한 한계 중 일부와 다른 모델 시스템에서 이를 극복하기 위한 잠재적 전략에 대해 설명합니다.
전체 엑솜 염기서열분석이 P 0-GGFβ3 마우스에서 관심 돌연변이를 효과적으로 식별한다는 것을 발견했습니다. 그러나 전체 엑솜 염기서열 분석 자체에는 한계가 있음을 인식해야 합니다. 첫째, 전체 엑솜 염기서열 분석은 융합 유전자 산물을 식별하는 효과적인 접근법이 아닙니다. 이는 염색체 절단과 후속 융합의 대부분이 유전자 간 영역과 인트론을 주로 포함하기 때문에 이러한 영역이 게놈의 대부분을 차지하기 때문입니다. 대신 우리는 paired-end read를 가진 RNA-Seq가 융합 유전자를 훨씬 더 효과적으로 식별한다는 것을 발견...

악성 말초신경초종양(MPNST)은 종양감수성 증후군인 신경섬유종증 1형(NF1)과 관련하여 발생하는 매우 공격적인 방추세포 신생물로, 일반 인구 집단과 이전 방사선 치료 부위에서 산발적으로 발생합니다 1,2,3. NF1 환자는 NF1 종양 억제 유전자의 야생형 사본과 기능 상실 돌연변이가 있는 두 번째 NF1 대립유전자 를 가지고 태어납니다. 이러한 하플로인기능부전(haploinsufficiency) 상태는 NF1 환자를 야생형 NF1 유전자의 두 번째 기능 상실 돌연변이에 취약하게 만들어 종양형성을 유발합니다. 이 "두 번째 히트" NF1 돌연변이가 슈반(Schwann) 세포 계통의 세포에서 발생하면, 그 결과로 생기는 종양은 피부에서 발생하는 진피 신경섬유종이거나 큰 신경 또는 신경총에서 발생하는 망상형 신경섬유종입니다. 진피 신경섬유종과 망상형 신경섬유종의 병리학은 동일하지만, 생물학적 거동은 상당히 다릅니다 - 진피와 망상신경섬유종은 모두 양성이지만, 망상신경섬유종만이 변형을 겪을 수 있고 MPNST를 일으킬 수 있습니다. NF1 유전자에 의해 암호화된 Ras GTPase 활성화 단백질인 뉴로피브롬의 손실 외에도, MPNST는 TP53 4,5,6,7, CDKN2A 8,9 및 PTEN 10을 포함한 여러 다른 종양 억제 유전자의 돌연변이, 폴리콤 억제 복합체 2 11,12 의 구성 요소를 암호화하는 유전자의 돌연변이(PRC2; SUZ12 및 EED 유전자) 및 수용체 티로신 키나아제 1,2의 비정상적인 발현. NF1 및 상술한 다른 유전자들의 돌연변이는 산발적이고 방사선에 의해 유도된 MPNST에서도 존재한다11,12.
MPNST의 게놈 이상에 대한 이해의 이러한 발전은 발병 기전을 이해하는 데 매우 중요하지만 MPNST에 대한 효과적인 새로운 치료법의 개발로 이어지지는 않았습니다. 새로운 치료법의 개발을 방해하는 주요 장벽은 MPNST가 희귀 암이라는 사실입니다. 이 때문에 TCGA(The Cancer Genome Atlas)에서 수행한 것과 같은 주요 동인 돌연변이를 정의하는 글로벌 분석에 필요한 많은 수의 환자 샘플을 얻기가 어렵습니다. 우리의 경험에 비추어 볼 때, 적당한 수의 인간 MPNST 표본을 축적하는 데에도 몇 년이 걸릴 수 있습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 다른 희귀 암 유형을 연구하는 많은 연구자들은 필수 드라이버 유전자 돌연변이를 식별하고, 관심 종양에서 필수 세포질 신호 전달 경로를 정의하고, 새로운 치료 표적을 식별하기 위해 종 간 비교 종양유전체학을 사용하고 있습니다. 종양형성에 필수적인 신호전달 경로는 인간과 다른 척추동물 종 사이에서 매우 잘 보존되어 있기 때문에 게놈 스케일 shRNA 스크리닝과 같은 기능적 유전체학 접근법을 적용하는 것은 이러한 새로운 드라이버 돌연변이, 신호전달 경로 및 치료 표적을 식별하는 효과적인 수단이 될 수 있습니다 13,14,15,16,17,18,19, 특히 제한된 수로 사용할 수 있는 희귀 인간 종양 유형을 연구할 때20개.
여기에 제시된 방법론에서는 성장 인자 뉴레굴린-1(NRG1)의 슈반(Schwann) 세포 특이적 과발현이 망상형 신경섬유종의 발병 기전과 MPNST로의 후속 진행을 촉진하는 유전자 조작 마우스 모델(GEM)인 P 0-GGFβ3 마우스에서 유래한 인간 MPNST 세포주 및 초기 통과 MPNST 배양에서 게놈 프로파일링을 수행하는 이러한 접근 방식을 설명합니다21, 22,23. 이 접근법의 첫 번째 단계는 P 0-GGFβ3 MPNST, 인간 MPNST 세포주 및 외과적으로 절제된 인간 MPNST에서 후보 드라이버 유전자를 식별하는 것입니다. 이러한 돌연변이의 영향을 받는 신호 전달 경로를 기능적으로 검증하기 위해 게놈 스케일 shRNA 스크리닝을 사용하여 인간 및 마우스 MPNST 세포주에서 증식과 생존에 필요한 유전자를 식별합니다. 증식과 생존에 필요한 유전자를 확인한 후, 약물 유전자 상호작용 데이터베이스(Drug Gene Interaction Database)를 사용하여 "히트(hit)" 컬렉션 내에서 약물 가능한 유전자 산물을 식별합니다. 또한 GEM 모델과 인간 MPNST가 동일한 유전자 및 신호 전달 경로에 대해 유사한 의존성을 보이는지 여부를 결정하기 위해 인간 및 마우스 MPNST 세포의 "적중"을 비교합니다. 증식 및 생존에 필요한 유전자와 영향을 받는 신호 전달 경로의 중복을 식별하는 것은 분자 수준에서 P 0-GGFβ3 마우스 모델을 검증하는 수단이 됩니다. 이 접근법은 또한 인간 스크리닝을 보완하는 역할을 할 수 있는 새로운 치료 표적을 식별하기 위해 인간과 마우스 스크리닝을 결합하는 효과를 강조합니다. 이러한 종간 접근법의 가치는 인간 종양과 세포주를 얻기 어려운 희귀 종양에서 치료 표적을 찾을 때 특히 분명합니다.

<table><tbody><tr><td>Bioruptor 초음파 처리 시스템</td><td>Diagenode&nbsp;</td><td>UCD-600</td><td></td></tr><tr><td>CASAVA 1.8.2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cbot</td><td>Illumina, San Diego, CA</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Celigo 이미지 세포분석기</td><td>Nexcelom</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Cellecta 바코드 분석기 및 디콘볼루터 소프트웨어</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Citrisolve Hybrid</td><td>Decon Laboratories</td><td>5989-27-5</td><td></td></tr><tr><td>Corning 96-well Black Microplate</td><td>Millipore Sigma</td><td>CLS3603</td><td></td></tr><tr><td>Diagenode Bioruptor 15ml 원뿔형 튜브</td><td>Diagenode&nbsp;</td><td></td><td></td>C30010009</tr><tr><td>dNTP 믹스</td><td>Clontech</td><td>639210</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Y</td><td>Thermo Scientific</td><td>7111</td><td></td></tr><tr><td>용출 버퍼</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>에탄올 (200 proof)</td><td>Decon Laboratories</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>Excel&nbsp;</td><td>마이크로소프트&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FWDGEX 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGA-3'</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FWDHTS 5'-TTCTCTGGCAAGCAAAAGACGGCATA-3'</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GexSeqS (5' AGAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGAA-3'</td><td></td><td></td><td>HPLC 정제</td></tr><tr><td>GraphPad 프리즘</td><td>Dotmatics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Harris Hematoxylin</td><td>Fisherbrand</td><td>245-677</td><td></td></tr><tr><td>Illumina HiScanSQ</td><td>Illumina, San Diego, CA</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드(4%)</td><td>Thermo Scientific</td><td>J19943-K2</td><td></td></tr><tr><td>PLUS 트랜스펙션 시약</td><td>Thermo Scientific</td><td>11514015</td><td></td></tr><tr><td>폴리브렌 트랜스펙션 시약</td><td>Millipore Sigma</td><td>TR1003G</td><td></td></tr><tr><td>PureLink Quick PCR 정제 키트</td><td>Invitrogen</td><td>K310001</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen Buffer P1</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>19051</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen 젤 추출 키트</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>RevGEX 5'-AATGATACGGCGACCGAGA-3'</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RevHTS1 5'-TAGCCAACGCATCGCACAAGCCA-3'</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>티타늄 Taq 중합효소</td><td>Clontech</td><td>639210</td><td></td></tr><tr><td>Trimmomatic 소프트웨어</td><td></td><td>www.usadellab.org</td><td></td></tr></tbody></table>

악성 말초 신경초 종양의 마우스 모델에서 치료 표적을 식별하기 위한 유전자 프로파일링 및 게놈 규모 드롭아웃 스크리닝

Genetic Profiling and Genome-Scale Dropout Screening to Identify Therapeutic Targets in Mouse Models of Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor

악성 말초 신경초 종양(MPNST)은 슈반(Schwann) 세포 또는 그 전구체에서 유래합니다. 종양 감수성 증후군 신경섬유종증 1형(NF1) 환자에서 MPNST는 가장 흔한 악성 종양이자 주요 사망 원인입니다. 이 희귀하고 공격적인 연조직 육종은 5년 무병 생존율이 34-60%에 달하는 암울한 미래를 제시합니다. MPNST 환자를 위한 치료 옵션은 실망스러울 정도로 제한적이며, 변형 수술이 가장 중요한 치료 옵션입니다. Ras 신호전달 억제제인 티피파르닙(tipifarnib)과 같이 한때 유망했던 많은 치료법이 임상적으로 실패했다. 마찬가지로, 표피 성장 인자(EFGR)를 표적으로 하는 엘로티닙과 혈관 내피 성장 인자 수용체(VEGF), 혈소판 유래 성장 인자 수용체(PDGF)를 표적으로 하는 소라페닙, 그리고 Raf를 표준 화학요법과 병용하는 임상 2상 시험에서도 환자에게 반응을 보이지 못했습니다. 
최근 몇 년 동안 암 세포주의 유전자 프로파일링과 결합된 기능적 게놈 스크리닝 방법은 필수 세포질 신호 전달 경로를 식별하고 표적 특이적 치료법을 개발하는 데 유용한 것으로 입증되었습니다. 희귀 종양 유형의 경우, 종간 비교 종양유전체학(cross-species comparative oncogenomics)으로 알려진 이 접근법의 변형이 새로운 치료 표적을 식별하는 데 점점 더 많이 사용되고 있습니다. 종간 비교 종양유전체학에서 유전자 프로파일링 및 기능적 유전체학은 유전자 조작 마우스(GEM) 모델에서 수행되며 결과는 사용 가능한 희귀 인간 표본 및 세포주에서 검증됩니다. 
본 논문은 전체 엑솜 염기서열분석(whole exome sequencing, WES)을 이용하여 인간 및 마우스 MPNST 세포에서 후보 드라이버 유전자 돌연변이를 식별하는 방법을 설명합니다. 그런 다음 게놈 스케일 shRNA 스크리닝을 수행하여 마우스 및 인간 MPNST 세포에서 중요한 신호 전달 경로를 식별 및 비교하고 이러한 경로에서 약물 가능한 표적을 식별하는 방법을 설명합니다. 이러한 방법론은 다양한 인간 암 유형에서 새로운 치료 표적을 식별하는 효과적인 접근 방식을 제공합니다.

그림 5 플롯은 스크리닝된 각 인간 세포주에서 TRUE로 표시된 핵심 필수 유전자(CEG)의 결핍 점수를 비 CEG(FALSE로 표시)와 비교하여 보여줍니다. 포인트는 개별 유전자에 대한 접힘 고갈 점수의 log2를 나타내며, 이는 전체 점수 분포의 상자 그림 표현 위에 표시됩니다. 스튜던트 t-검정은 각 세포주에서 두 그룹 간의 공핍 점수 평균의 유의한 차이를 검정하는 데 사용되었습니다. 결과 p-값은 각 패널에 표시됩니다. 평균 폴드 고갈 점수는 CEG가 아닌 CEG보다 훨씬 높습니다. 이는 핵심 필수 유전자(Core Essential Gene)가 대부분의 세포 유형에서 증식 및/또는 생존에 일관되게 필요하기 때문에 예상됩니다.
그림 6A는 3개의 인간 MPNST 세포주에 대한 "적중"의 벤 다이어그램을 보여줍니다. 우리는 일반적으로 많은...

우리는 유전자 조작 마우스 모델에서 발생하는 종양과 해당 인간 종양 유형에서 발생하는 종양의 치료 표적을 식별하고 비교하기 위해 게놈 분석 및 기능적 게놈 스크리닝을 활용하는 종간 비교 종양유전체학 접근 방식을 개발했습니다.

Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumors (MPNSTs) are derived from Schwann cells or their precursors. In patients with the tumor susceptibility syndrome ...

우리는 산발성 및 NF1 관련 악성 말초 신경초 종양의 발병 기전을 이해하기 위해 노력하고 있습니다. 우리의 목표는 이러한 매우 공격적인 신생물에 대한 새로운 치료법을 논리적으로 개발하는 것입니다. 현재 연구를 발전시키기 위해 구현하고 있는 기술에는 게놈 스케일 shRNA 스크리닝, 단일 세포 염기서열 분석, BaseScope in situ 프로브 및 생물정보학과 같은 편향되지 않은 방법이 포함됩니다.현재의 다양한 접근법을 사용하여 악성 말초 신경초 종양의 증식과 생존에 필수적일 뿐만 아니라 치료적으로 표적이 될 수 있는 여러 수용체를 확인했습니다. 이러한 수용체에는 뉴레굴린 수용체(neuregulin receptor), ErbB3 및 리소포스파티드산 수용체(lysophosphatidic acid receptor) 3가 포함됩니다. 이 접근법 사용의 장점은 MPNST 암 세포주에서 15 이상, 000 유전자의 증식 중요성을 시험하는 능력에 있습니다.이는 MPNST 치료에서 탐색되지 않은 표적을 식별하는 편향되지 않은 접근 방식입니다. 앞으로 우리 실험실의 초점은 화면에서 식별된 표적을 검증하는 데 집중할 것입니다. 여기에는 세포주와 배양에 억제제를 사용하는 것이 포함되며 궁극적으로 이를 동물 실험으로 전환하는 것이 포함됩니다.

genetic-profiling-genome-scale-dropout-screening-to-identify

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

우리는 유전자 조작 쥐의 신경계 신생물이 인간 쥐의 병리를 정확하게 재현하는지 여부를 평가하는 방법론을 개발했습니다. 여기서는 이러한 조직학적 기술, 정의된 병리학적 기준 및 배양 방법론을 P 0-GGFβ3 마우스 모델에서 발생하는 신경섬유종 및 악성 말초 신경초 종양에 적용합니다.

유전자 조작 마우스 모델에서 악성 말초 신경초 종양 식별, 진단 및 등급 지정

이 프로토콜은 초파리의 눈 / 더듬이 가상적인 디스크 (EAD에게)에서 형광 표시, 유 전적으로 정의 클론 종양을 생성하는 방법을 보여줍니다. 그것은 세 번째 령 유충과 방법을 시각화하고 유전자 발현 변화와 종양 침입을 정량화를 처리하는 방법에서 EAD 뇌를 해부하는 방법에 대해 설명합니다.

그만큼<em&gt; 초파리</em&gt; 가상적인 디스크 종양 모델 : 유전 모자이크를 사용하여 유전자 발현 및 종양 침윤의 시각화 및 정량화

전임상 시험에서 인간 대상 시험으로 전환되는 새로운 약물 표적을 식별하는 것은 과학적인 우선 순위입니다. 이를 위해 여기에서는 유전자 고갈이 암 세포주 스페로이드에 미치는 영향을 조사하기 위한 기능적 유전체학 접근 방식을 설명하며, 이는 생체 내에서 인간 암을 보다 적절하게 모델링합니다.

기능 유전체학에게 검사를 활용하여 암 세포 회전 타원체 문화에 잠재적으로 소설 약 표적을 식별하는

여기 우리는 프로토콜 설명 높은 처리량 RNAi 심사 oncolytic 바이러스 치료를 강화 하도록 조작 될 수 있는 호스트 대상을 폭로를 위한, 특히 rhabodvirus 및 vaccinia 바이러스 치료, 하지만 그것은 다른 oncolytic 쉽게 적용할 수 있습니다 바이러스 플랫폼 또는 변조 바이러스 복제를 일반적으로 호스트 유전자 발견.

RNAi 게놈 넓은 검사 Oncolytic 바이러스 치료 변조 호스트 요소를 식별 하

우리는 전 임상 생체 내에서 암 전이의 추적에 대 한 프로토콜을 설명합니다. 그것은 비 침략 적 [18F] tetrafluoroborate-애완 동물, 그리고 유선형 비보 전 확인에 대 한 형광 단백질에 의해 감지 나트륨 요오드 화물 symporter 결합 방사성 핵 종 형광 기자를 기반으로 합니다. 방법은 전 임상 vivo에서 세포 종양 생물학 넘어 추적에 적용 합니다.

방사성 핵 종 형광 취재 원 유전자 설치류 종양 모델에서 종양의 진행을 추적 하기 위해 이미징

디지털 연쇄 반응 (PCR) 단일 뉴클레오티드 이체와 DNA 복사 번호 이체의 고감도 검출을 위한 유용한 도구입니다. 여기, 칩에 튜브 형식으로 디지털 PCR를 사용 하 여 인간 게놈에 있는 드문 이체를 측정 하기 위한 주요 고려 사항을 설명 합니다.

튜브에 칩 형식을 사용 하 여 산발적 인 가족 용 대 환자에 있는 유전 변이 대 한 디지털 중 합 효소 연쇄 반응 분석 결과

신경 내분비 종양 (NETs) 신경 문장의 신경 내분비 세포에서 유래. 그들은 천천히 성장하고 문화에 도전. 우리는 스페로이드로 그들을 배양하여 작은 창자에서 NET를 성장하는 대체 전략을 제시한다. 이 스페로이드는 작은 창자 그물 마커가 있고 약 시험을 위해 이용될 수 있습니다.

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여기에서, 우리는 유전자 조작된 마우스 모델 유래 종양 에서 생체내에서 배아 치사되는 유전자 녹아웃을 수행하기 위한 프로토콜을 제시하고, 이어서 녹아웃이 종양 성장, 증식, 생존, 이동, 침윤 및 시험 관내 및 생체내에서 전사체에 미치는 영향을 평가한다.

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최근 작품은 고급 소아 신경 교종에 신경 영향을 발견 (pHGG) 세포와 그들의 상호 작용. 본 작품은 생체 외 모델의 발달을 pHGG 세포와 글루타미터기뉴런과 기록하여 그 간 작용을 모방하였다.

글루타미터기뉴런과 소아 고학년 신경교세포의 공동 배양을 미세유체 장치로 결합하여 전기 적 상호 작용을 평가합니다.

이 방법 논문의 목표는 외과적으로 절제된 흉막 중피종으로부터 원발성 종양 세포주의 농축, 생성 및 확장을 위한 강력하고 재현 가능한 방법론을 입증하는 것이다.

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배우세요 악성 말초 신경초 종양의 마우스 모델에서 유전자 프로파일링 및 게놈 규모 shRNA 스크리닝을 활용한 치료 표적 식별 방법입니다. erbB3와 같은 필수 수용체를 발견하여 새로운 치료 전략 개발에 기여합니다.

악성 말초 신경초 종양의 마우스 모델에서 치료 표적을 식별하기 위한 유전자 프로파일링 및 게놈 규모 드롭아웃 스크리닝

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