단세포 분석을 위한 인간 나팔관 상피를 추출하는 효율적인 방법

우리의 연구 초점은 난소암의 화학 요법 저항성을 이해하고 퇴치하는 것입니다. 우리는 이러한 공격적인 집단을 근절하기 위한 저항성과 새로운 표적을 유도하는 메커니즘과 세포 하위 집단을 발견하는 것을 목표로 합니다.

단일 세포 RNA 시퀀싱은 이질적인 난소 종양에서 하위 집단의 특성화를 용이하게 합니다. 우리는 비암성 나팔관 상피 세포를 난소암 분석을 위한 정상 기원 세포로 활용합니다.

나팔관 상피 세포를 농축된 단일 세포 현탁액으로 효율적으로 분리하면 고급 장액성 난소암 질병 시작을 더 잘 이해하는 데 도움이 될 것입니다. 이 기계적 및 효소적 소화 기술은 생존 가능한 나팔관 상피 세포의 농축된 단일 세포 현탁액을 추출하기 위한 보다 효율적인 공정을 제공합니다.

[해설자] 시작하려면 해리 배지가 들어 있는 15밀리리터 또는 50밀리리터 튜브에 신선한 인간 나팔관을 수집하고 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 나팔관을 신선한 해리 배지가 들어 있는 멸균 페트리 접시로 옮기고 샘플을 해부 현미경 아래에 놓습니다. 이제 가는 뾰족한 집게와 Vannas-Tubingen 가위를 사용하여 지방, 결합 조직 및 튜브를 둘러싼 모든 혈관을 해부합니다. 그런 다음 가위로 나팔관의 관상면을 잘라 직경 3-5mm의 작은 원통을 만듭니다. 절단하는 동안 조직을 안정화하기 위해 fine=point 겸자를 사용하십시오. 조직 조각이 들어 있는 접시에서 해리 배지를 조심스럽게 흡인합니다. 티슈 조각을 2밀리리터의 차가운 1x PBS로 두 번 씻고 플레이트를 가볍게 돌립니다. PBS를 흡인한 후, 조직 조각을 실온에서 차가운 5밀리몰 EDTA에서 5분 동안 배양합니다. 차가운 1% 트립신 행크스 균형 소금 용액에 조직 조각을 현탁시키고 섭씨 4도에서 40분 동안 배양합니다. 1% 트립신 행크스 균형 염 용액을 흡인하고 조직 조각을 차가운 해리 배지로 두 번 세척하여 트립신을 비활성화합니다. 조직 단편을 2밀리리터의 해리 배지에 0.4mg의 DNase와 함께 실온에서 최소 30분 동안 배양합니다. DNase 배지에 있는 동안 해부 현미경으로 나팔관 조각을 집게로 잡고 내강이 접시 바닥과 평행이 되도록 합니다. 집게를 사용하여 조직을 반복적으로 눌러 내강에서 상피 세포를 배출합니다. 조직 주위에 세포의 후광이 방출되는지 확인합니다. 배지 함유 세포를 멸균 15밀리리터 튜브로 옮깁니다. 페트리 접시를 해리 배지로 두 번 세척하고 동일한 튜브에 세척을 결합합니다. 나머지 간질관 조각을 버립니다. 세포를 수확하려면 500g에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 흡인하고 펠릿을 1밀리리터의 해리 배지에 재현탁합니다. 이제 10마이크로리터의 세포 현탁액을 같은 양의 트리판 블루와 혼합합니다. 혼합물 10마이크로리터를 챔버 카운팅 슬라이드에 피펫팅하고 세포 계수기에 삽입하여 세포 수를 결정합니다. 콜라게나제 유형 1 및 DNase를 포함하는 9밀리리터의 해리 배지에 세포를 재현탁합니다. 섭씨 37도에서 200RPM으로 설정된 궤도 셰이커에서 30-45분 동안 배양합니다. 세포를 수확하려면 500g에서 5분 동안 원심분리합니다. 상청액을 흡인한 후 펠릿을 5밀리리터의 해리 배지에 재현탁하여 콜라게나제를 씻어냅니다. 세포 현탁액을 100마이크로미터 세포 여과기를 통해 50밀리리터 튜브에 통과시키고 여과액을 500g에서 5분 동안 원심분리합니다. 세포 펠릿이 빨간색으로 나타나면 적혈구를 용해하기 위해 적혈구 용해 완충액을 준비합니다. 펠릿에서 배지를 흡인하고 희석된 RBC 용해 완충액 5밀리리터를 첨가한 다음 샘플을 얼음 위에서 3분 동안 배양합니다. 적혈구 용해를 멈추려면 튜브에 1x PBS 45밀리리터를 추가합니다. 튜브를 500g에서 5분 동안 원심분리합니다. 세포를 수확하여 1밀리리터의 해리 배지에 재현탁한 후, 10마이크로리터의 세포 현탁액을 같은 부피의 트리판 블루와 혼합합니다. 혼합물 10마이크로리터를 챔버 카운팅 슬라이드에 피펫팅하고 셀 카운터에 삽입합니다. 유세포 분석 분석은 평균 생존율이 82%인 나팔관 조직에서 생존 가능하고 농축된 상피 세포 집단의 분리를 확인했습니다. CD45 양성 면역 세포를 채취한 후 EpCAM 양성 상피 세포는 샘플의 평균 80%를 차지한 반면, CD10 양성 간질 세포 오염은 7.8%로 최소화되었습니다. 분리된 상피 세포는 도금 4-6일 후 2D 배양에서 부착성 조약돌 같은 클러스터를 형성하여 상피 동일성을 확인했습니다. 면역화학은 대부분의 배양 세포가 소수의 비멘틴 양성 세포만으로 EpCAM 및 PAX8을 발현하는 것으로 나타났습니다. 섬모 세포는 배양에 존재했습니다.