Iterative Bleaching Extends Multiplexity 접근법을 사용한 종양 함유 조직의 3차원 이미징

이 연구는 면역조절제와 복합 고형 위장관 종양의 표적을 식별하는 데 중점을 둡니다. 종양 미세환경 세포 환경을 분석하는 것은 면역 요법과 같은 치료에 대한 감수성을 이해하는 데 절대적으로 중요합니다. 단일 세포 시퀀싱 및 유세포 분석은 종양 미세 환경을 특성화하는 데 도움이 되지만 공간적 맥락이 부족합니다. 최근에는 생체 내 맥락에서 종양 미세 환경을 연구하기 위한 다중 이미징 및 전사체 플랫폼이 등장했습니다.

종양 미세 환경을 분석하는 데 사용할 수 있는 다중 기술은 반복적이든 올인원이든 2차원으로 제한됩니다. 이 프로토콜은 특성화를 깊이 차원으로 확장하여 단일 FFPE 또는 동결 절편을 넘어서는 통찰력을 제공합니다.

[해설자] 시작하려면 티슈 시트를 따뜻한 수확 배지가 들어 있는 샘플 컵에 옮기고 준비 테이블의 가열판에 놓습니다. 수확 배지가 들어 있는 15cm 플레이트의 플랫폼에 조직을 장착합니다. 중피 쪽이 플랫폼의 작은 구멍 쪽 위로 향하도록 종양 보유 조직을 조심스럽게 드레이프하고 2-0 실크 봉합사로 고정합니다. 준비된 조직 플랫폼을 수확 배지가 들어 있는 24웰 플레이트에 반으로 완전히 잠근 상태로 놓습니다. 고정을 위해 30밀리리터의 차가운 PBS가 들어 있는 50밀리리터 원뿔형 튜브에 10밀리리터의 고정액을 첨가하여 40밀리리터의 고정 완충액을 준비합니다. 겸자를 사용하여 플랫폼에 장착된 조직을 고정 완충액으로 옮깁니다. 그리고 섭씨 4도에서 24시간 동안 배양합니다. 고정액을 디캔팅하십시오. 40밀리리터의 차가운 PBS로 교체하십시오. 그리고 섭씨 4도에서 10분 동안 배양합니다. 염색을 위해 1밀리리터의 차단 완충액을 웰에 넣고 조직 플랫폼을 삽입합니다. 30RPM의 저속으로 설정된 로커에서 실온에서 최소 2시간 동안 차단합니다. 마이크로 원심분리기 튜브에 0.8 밀리리터의 항체 염료 용액을 준비하고 실온에서 2분 동안 10,000g에서 원심분리합니다. 상청액 0.75밀리리터를 9웰 배양 플레이트의 깨끗한 웰로 옮깁니다. 그리고 세척된 플랫폼을 삽입합니다. 접시를 알루미늄 호일로 싸십시오. 그리고 30RPM의 저속으로 설정된 로커에서 실온에서 최소 2시간 동안 배양합니다. 40밀리리터의 PBS가 들어 있는 50밀리리터 원뿔형 튜브에서 4도에서 10분 동안 플랫폼을 세척합니다. 3.5cm 이미징 접시의 유리 바닥 중앙에 0.1밀리리터의 PBS를 넣고 따로 보관합니다. 높이 조절 링을 시계 방향으로 외부 뚜껑에 느슨하게 조입니다. 그리고 내부 플라스틱 홀더에 플랫폼을 장착하여 노치 홈 정렬을 보장합니다. 슬라이더로 플랫폼을 고정합니다. 조립된 이미징 어댑터를 유리 바닥 접시에 놓고 조직이 완충액에 닿을 때까지 높이 조절 링을 조심스럽게 내립니다. 유리로부터 최적의 거리에 도달하면 이미징 중 조직 탈수를 방지하기 위해 바닥면이 위로 향하도록 조직에 0.2밀리리터의 PBS를 추가합니다. 이미지 획득 소프트웨어를 시작합니다. 20X 또는 40X와 같은 적절한 대물렌즈를 선택하고 해당 침지 매체를 추가합니다. 600헤르츠의 스캔 속도, 1024 x 1024픽셀의 XY 해상도, 3줄 평균 및 양방향 스캔과 같은 이미지 획득 매개변수를 선택합니다. 적절한 레이저 라인을 선택하거나 염색에 사용되는 형광단의 여기 및 방출 스펙트럼과 일치하도록 백색광 레이저를 조정하십시오. 조립된 이미징 접시를 현미경 스테이지의 샘플 홀더에 놓습니다. XY 컨트롤을 사용하여 시편을 중앙에 놓고 대물렌즈를 커버 유리로 가져간 다음 이미지 획득을 시작합니다. 각 이미징 라운드가 끝나면 표백 단계를 수행합니다. 증류수에 1.5밀리리터당 1.5밀리그램의 수소화붕소리화 리튬 용액 5밀리리터를 준비하고 실온에서 30분 동안 배양합니다. 1밀리리터의 수소화붕소리튬 용액을 9웰 배양 플레이트의 깨끗한 웰에 옮기고 세척된 플랫폼을 실온에서 60분 동안 삽입합니다. 원추형 튜브 내부의 PBS 20밀리리터로 플랫폼을 잠시 세척합니다. Z 보정을 위해 가장 높은 레이저 설정을 사용하여 남은 형광 신호를 확인하십시오. 첫 번째 반복 표백으로 염색된 종양 함유 복막 샘플은 시각화를 위한 다중성 확장 또는 IBEX 1 패널이 여기에 나와 있습니다. 종양 병변은 유두상 중피종의 특징적인 핵 배열을 가진 CD44 및 포도플라닌에 대해 이중 양성인 로제트 유사 구조로 확인되었습니다. 종양 함유 복막 샘플에서 선택된 영역의 고해상도 면역형광 이미지가 여기에 표시됩니다. 이 이미지는 종양 영역과 종양 3차 림프 구조 인터페이스를 나타내며 고밀도의 CD45 양성 세포로 일관된 면역 세포 침윤을 강조합니다. 이 그림은 IBEX 주기 1에서 6에 걸쳐 반복적인 면역형광 염색을 나타내며, 종양 병변 및 종양 3차 림프 구조 인터페이스 내에서 면역 및 구조 마커의 공간적 분포를 보여줍니다. 다양한 광학 섹션의 최대 투영이 여기에 표시됩니다. 이 3D 이미징은 종양 병변과 3차 림프 구조가 서로 다른 Z 깊이에 존재한다는 것을 확인하여 복잡한 조직 구조를 캡처하는 데 있어 2D 이미징의 한계를 입증했습니다.