Name: 출생 후 초기 마우스 뇌 발달에서 미세아교세포 활성화를 특성화하기 위한 유세포 분석 및 단일 세포 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-10-03T13:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: 배우세요 출생 후 초기 마우스 소뇌에서 미세아교세포를 유세포 분석 및 단일 세포 RNA 시퀀싱으로 분리하고 특성화하는 방법을. 효소적 분리와 퍼콜 원심분리를 활용하여 세포 이질성을 밝히고 뇌 발달 및 질병 메커니즘 이해에 기여합니다.

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</ol>

<table><tbody><tr><td>140 & 마이크로; M 금속 메쉬 필터&NBSP;</td><td>시그마-알드리치</td><td>S3895</td><td></td></tr><tr><td>15mL 튜브</td><td>사르슈테트</td><td>62.554.205</td><td></td></tr><tr><td>5mL 튜브</td><td>사르슈테트</td><td>55.526.006</td><td></td></tr><tr><td>원추형 바닥이 있는 96웰 플레이트&NBSP;</td><td>사르슈테트</td><td>82.1583.001</td><td></td></tr><tr><td>아르기나제 1 - 접합체 Pecy7 - 클론 : A1exF5</td><td>써모 피셔 사이언티픽</td><td>25-3697-82</td><td></td></tr><tr><td>탁상용 형광 시약</td><td>인비트로젠</td><td>A49905</td><td></td></tr><tr><td>CD11b - Conjugate Fitc - 클론 : M1/70</td><td>BD 파밍겐</td><td>553310</td><td></td></tr><tr><td>CD163 - 접합체 SB600 - 클론 : TNKUPJ</td><td>써모 피셔 사이언티픽</td><td>63-1631-82</td><td></td></tr><tr><td>CD206 - Conjugate APC - 클론 : C068C2</td><td>바이오레전드</td><td>141708</td><td></td></tr><tr><td>CD45 - 접합체 A700 - 클론 : 30-F11</td><td>BD 파밍겐</td><td>560510</td><td></td></tr><tr><td>CD64 - 접합체&nbsp; PerCP-eF710 - 클론 : X54-5/7.1</td><td>써모 피셔 사이언티픽</td><td>46-0641-82</td><td></td></tr><tr><td>CD80 - 접합체 SB436 - 클론 : 16-10A1</td><td>써모 피셔 사이언티픽</td><td>62-0801-82</td><td></td></tr><tr><td>CD86 - Conjugate Pe - 클론 : GL-1</td><td>바이오레전드</td><td>105008</td><td></td></tr><tr><td>콜라게나제 D</td><td>시그마&ndash; 알드리치</td><td>11088866001</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>시그마&ndash; 알드리치</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청(FBS)</td><td>시그마&ndash; 알드리치&nbsp;</td><td>F1051</td><td></td></tr><tr><td>HBSS(행크의 균형 소금 용액) 10x</td><td>Wisent 바이오 프로덕츠&nbsp;</td><td>311506CL</td><td></td></tr><tr><td>혈구계</td><td>VWR 인터내셔널</td><td>82030-470</td><td></td></tr><tr><td>헴스</td><td>Wisent 바이오 프로덕츠&nbsp;</td><td>330.050.EL</td><td></td></tr><tr><td>iNOS - 접합체 PE- eF610 - 클론 : CXNFT</td><td>써모 피셔 사이언티픽</td><td>61-5920-82</td><td></td></tr><tr><td>케이클</td><td>써모 피셔 사이언티픽</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>써모 피셔 사이언티픽</td><td>BP362-500</td><td></td></tr><tr><td>살아있는/죽은 암시안</td><td>써모 피셔 사이언티픽</td><td>L34957</td><td></td></tr><tr><td>미세아교세포 배양 배지</td><td>라이프 테크놀로지</td><td>A12475-01</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>써모 피셔 사이언티픽</td><td>BP332-500</td><td></td></tr><tr><td>나크롬</td><td>써모 피셔 사이언티픽</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>시그마&ndash; 알드리치&nbsp;</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>쥐 항마우스 CD16/CD32</td><td>BD 바이오사이언스&nbsp;</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>사포닌</td><td>시그마&ndash; 알드리치&nbsp;</td><td>S7900</td><td></td></tr><tr><td>scRNAseq 라이브러리</td><td>10X 유전체학</td><td>1000121</td><td></td></tr><tr><td>실리카 기반 콜로이드 매체</td><td>써모 피셔 사이언티픽</td><td>45001747</td><td></td></tr><tr><td>아지드화나트륨</td><td>써모 피셔 사이언티픽</td><td>BP922I-500 시리즈</td><td></td></tr><tr><td>트리판 블루</td><td>깁코</td><td>1525006</td><td></td></tr></tbody></table>

출생 후 초기 마우스 뇌 발달에서 미세아교세포 활성화를 특성화하기 위한 유세포 분석 및 단일 세포 분석

Flow Cytometry and Single-Cell Analysis for Characterizing Microglia Activation in Early Postnatal Mouse Brain Development

이 프로토콜은 유세포 분석을 효과적으로 활용하여 선택된 표면 및 세포내 마커의 발현을 기반으로 마우스 뇌 샘플에서 미세아교세포 집단을 특성화합니다. 다음 섹션에서는 워크플로의 주요 단계에서 얻은 결과를 자세히 설명하고 실험 조건에 대한 반응으로 미세아교세포 하위 집합의 분포와 이질성을 강조합니다.
보상 및 게이팅 전략 검증 보상 비드는 형광 신호를 보정하고 형광색소 간의 스펙트럼 중첩을 보정하는 데 사용되었습니다. 각 형광색소에 대한 양성 및 음성 모집단이 명확하게 분리되어 정확한 보상 매트릭스 생성이 가능했습니다. 게이팅 임계값은 특히 불량하거나 겹치는 마커의 경우 실제 신호와 배경을 구별하기 위해 패널 최적화 중에 FMO(Fluorescence Minus One) 제어를 사용하여 처음에 검증되었습니다. 이러한 임계값은 일관성을 보장하기 위해 동일한 염색 패널 및 세포 분석기 설정을 사용하여 실험 전반에 걸쳐 재사용되었습니다. 특히 세포내 마커에 대한 잠재적인 비특이적 결합을 모니터링하기 위해 이소타입 대조군이 포함되었지만 게이팅 결정에는 사용되지 않았습니다.
미세아교세포 식별 살아있는/죽은(Amcyan) 세포 게이팅 전략은 죽은 세포를 성공적으로 배제했습니다. 게이팅 전략은 CD45(AF700) 및 CD11b(FITC) 발현을 기반으로 미세아교세포 집단을 효과적으로 분리했습니다. 전방 산란(FSC) 및 측면 산란(SSC) 매개변수는 도트 플롯 내에서 미세아교세포 집단을 중앙에 배치하도록 최적화되었습니다(FSC = 300, SSC = 200).
미세아교세포 표현형 분석 도트 플롯 분석을 통해 표면 및 세포 내 마커의 차등 발현을 기반으로 미세아교세포 하위 집단을 식별할 수 있었습니다. FlowJo 소프트웨어의 특정 게이팅 전략을 사용하여 CD80(Super Bright 436), CD86(PE) 및 iNOS(PE-eFluor 610)를 발현하는 미세아교세포의 하위 집합을 확인했습니다(그림 6A). 이중 게이팅은 또한 CD206(APC) 및 Arg1(PE-Cy7)을 발현하는 하위 집합을 정의하는 데 사용되었습니다(그림 6B 참조). 추가 집단은 CD86(PE) 및 CD64(PerCP-eFluor 710), CD163(Super Bright 600) 및 CD206(APC)의 공동 발현으로 특징지어졌습니다(그림 6C,D). 이러한 표현형 프로파일은 미세아교세포 집단 내에서 마커로 정의된 이질성을 반영하고 고정된 기능 상태를 추론하지 않고 전사학적으로 및 면역학적으로 구별되는 여러 하위 집합을 구별하는 이 프로토콜의 능력을 보여줍니다.
미세아교세포 단일 세포 분석 UMAP(Uniform Manifold Approximation and Projection)를 사용하여 세포 이질성을 시각화하고 다른 뇌 세포 유형 중에서 미세아교세포 클러스터를 식별했습니다. 각 점은 단일 세포를 나타내며 클러스터는 전사 유사성에 따라 색상으로 구분됩니다(그림 2).
실험 조건에서 조절된 유전자를 식별하기 위해 미세아교세포 클러스터 내에서 차등 발현 분석을 수행했습니다. 조정된 P-값이 0.05≤ 유전자는 차등적으로 발현된 것으로 간주되었습니다.
미세아교세포의 이러한 차등적으로 발현된 유전자를 시각화하기 위해 화산 플롯이 생성되어 배수 변화가 높고 통계적 유의성을 모두 갖는 유전자를 강조했습니다(그림 4).
이러한 단일 세포 결과를 유세포 분석 데이터와 비교하기 위해 미세아교세포 마커 CD45 및 CD11b(Ptprc 및 Itgam) 의 발현을 조사했습니다. UMAP은 서로 다른 세포 집단 내에서 발현을 보여줍니다(그림 7).
마지막으로, 선택된 면역 관련 마커의 발현을 평가하여 미세아교세포 간의 전사 이질성을 특성화했습니다. 바이올린 플롯은 단일 세포 수준에서 CD80 및 NOS- 와 같은 유전자뿐만 아니라 Mrc1, Arg1, Fcgr1 및 CD163 의 발현을 표시합니다(그림 8). 이러한 마커 발현 패턴은 유세포 분석 기반 프로파일링과 비교할 수 있으며 실험 조건 전반에 걸쳐 미세아교세포 하위 집합의 분자 다양성을 강조합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68427/68427fig1.jpg"> 
그림 1: 단일 세포 전사체 데이터의 품질 관리. (A) 세포 전체에 미토콘드리아 RNA 함량의 분포. 잠재적으로 스트레스를 받거나 죽어가는 세포를 제거하기 위해 미토콘드리아 RNA가 &gt;30%인 세포를 제외했습니다. (B) log10GenesPerUM&gt;I가 0.75인 세포를 필터링하여 일관된 유전자 대 UMI 비율을 보장하고 복잡성이 낮은 라이브러리의 노이즈를 줄였습니다. (C) 검출된 전사체(nUMI)가 500개 미만이거나 검출된 유전자(nGENE)가 300개 이상인 세포도 품질이 낮거나 여러 개의 세포를 제거하기 위해 제외되었습니다. (D) 필터링 임계값의 영향을 보여주는 NUMI 대 nGene의 상관 관계도. 검출된 이중항은 제거되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/68427fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68427/68427fig2.jpg"> 
그림 2: 단일 세포 전사체의 UMAP 시각화. 두 개의 개별 동물로부터 얻은 전사체 프로파일을 기반으로 단일 세포의 분포를 보여주는 UMAP 플롯. 각 점은 클러스터 ID에 따라 색상으로 구분된 하나의 셀을 나타냅니다. 미세아교세포 클러스터는 다른 세포 집단 중에서 확인됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/68427fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68427/68427fig3.jpg"> 
그림 3: 교차 검증을 통해 평가된 랜덤 포레스트 분류기의 ROC 곡선. 유전자 발현 프로필을 기반으로 미세아교세포를 다른 뇌 세포 유형과 구별하는 데 사용되는 랜덤 포레스트 모델의 성능을 보여주는 ROC(Receiver Operating Characteristic) 곡선. 이 모델은 알려진 라벨이 있는 ~1000개의 셀 세트에서 훈련되었고 10배 교차 검증을 사용하여 평가되었습니다. 테스트한 5가지 통계 모델(랜덤 포레스트, 로지스틱 회귀, 나이브 베이즈, 지원 벡터 머신, 의사결정 트리) 중에서 랜덤 포레스트 모델이 가장 높은 분류 성능을 달성했습니다. 곡선 아래 면적(AUC)은 모델의 정확도를 반영합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/68427fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68427/68427fig4.jpg"> 
그림 4: 미세아교세포의 차등 유전자 발현 분석. 두 실험군(대조군 대 소뇌 손상) 사이의 미세아교세포에서 차등적으로 발현되는 유전자에 대한 조정된 P-값에 대한 log2 배수 변화 대 조정된 P-값을 나타내는 화산 플롯. 상향 조절된 유전자는 관심 그룹(ident.1)에서 더 높게 발현되며, 하향 조절된 유전자는 참조 그룹에 비해 발현이 감소한 것으로 나타났습니다(ident.2). 유의하게 차등적으로 발현되는 주요 유전자가 라벨링됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/68427fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68427/68427fig5.jpg"> 
그림 5: 유세포 분석법에 의한 미세아교세포 식별을 위한 게이팅 전략. (A) 대조군 출생 후 3일(P3) 마우스의 소뇌 세포에 적용된 게이팅 전략. (B) 이중항을 제외하기 위해 일중항을 선택했습니다. (C) 생존 가능한 세포는 생존 염료를 사용하여 확인되었습니다. FSC-A가 낮은 이벤트는 파편을 제거하고 온전한 세포의 분석을 보장하기 위해 제외되었습니다. (D) 미세아교세포는 두 가지 뚜렷한 집단을 가진 CD45+ 및 CD11b+로 확인되었습니다: 정지 미세아교세포에 대한 CD45 low-CD11bint 및 활성화된 미세아교세포에 대한 CD45int -CD11bhigh. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/68427fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68427/68427fig6.jpg"> 
그림 6. 유세포 분석법에 의한 미세아교세포 마커 발현 프로파일의 특성화. (A) CD80, CD86 및 iNOS 발현에 기반한 CD45+ CD11b+ 세포의 순차적 게이팅. (B) CD206을 발현하는 하위 집합의 식별, 이어서 Arg1 발현에 기초한 게이팅. (C) CD86을 발현하는 하위 집합의 식별, 이어서 CD64 발현에 기초한 게이팅. (D) CD163을 발현하는 하위 집합의 식별, 이어서 CD206 발현에 기초한 게이팅. 이러한 게이팅 전략은 표면 및 세포내 마커 발현을 기반으로 하는 미세아교세포 집단의 표현형 이질성을 보여줍니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/68427fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68427/68427fig7.jpg"> 
그림 7: 단일 세포 RNA 시퀀싱 데이터에서 Itgam 및 Ptprc 발현을 사용한 미세아교세포 동일성 확인. UMAP은 P15에서 소뇌 세포의 전사 환경을 표시하며, Itgam 및 Ptprc 의 유전자 발현은 클러스터 전체에 걸쳐 중첩됩니다. 이러한 표준 골수성 마커의 공동 발현은 미세아교세포 집단의 식별을 지원하고 유세포 분석에 사용되는 마커와 일치하여 전사체 분석과 단백질 수준 분석 간의 교차 검증을 제공합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/68427fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68427/68427fig8.jpg"> 
그림 8: 단일 세포 RNA 시퀀싱으로 확인된 미세아교세포에서 선택된 면역 관련 유전자의 발현 프로파일. 바이올린 플롯은 개별 미세아교세포에 걸쳐 CD80, NOS2, Mrc1, Arg1, Fcgr1 및 CD163 에 대한 유전자 발현 분포를 표시합니다. 이러한 마커는 일반적으로 면역 관련 과정과 연관되어 있으며 미세아교세포 집단 내에서 관찰되는 전사 이질성을 보여줍니다. 데이터는 대조군 및 소뇌 뇌 손상(CBI) 상태 모두에 대해 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/68427fig8large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
표 1: 신경 세포 분리 및 염색에 사용되는 용액의 구성. 이 표는 각각의 농도와 성분을 포함하여 세포 분리 및 염색에 필요한 용액의 자세한 구성을 제공합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/Table%201.xlsx" target="_blank">이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
표 2: 세포외 염색을 위한 항체 혼합물 농도. 이 표는 세포외 염색에 사용되는 항체 및 생/사형 용액의 농도를 자세히 설명하며, 한 샘플에 대한 염색 혼합물의 각 항체에 필요한 부피와 희석액을 지정합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/Table%202.xlsx" target="_blank">이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
표 3: 세포내 염색을 위한 항체 혼합 농도. 이 표는 세포 내 염색에 사용되는 항체의 농도를 자세히 설명하고 한 샘플에 대한 염색 믹스의 각 항체에 필요한 부피와 희석액을 지정합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/Table%203.xlsx" target="_blank">이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

Microglia, the brain's resident immune cells, exhibit region and context-specific transcriptional profiles during development and disease. This protocol ...

우리의 연구는 미세아교세포가 산전 뇌 손상 후 뇌 복구에 어떤 영향을 미치는지 탐구합니다. 그리고 우리는 미세아교세포 활동을 조절하는 것이 장기적인 신경학적 결과를 개선할 수 있는지 여부를 결정하는 것을 목표로 합니다. 저는 이것이 미세아교세포 반응의 복잡성과 생리학적, 병리학적 반응 및 질병을 표현하기 위해 이러한 반응을 가장 정확한 방식으로 설명하는 데 어려움이 있다고 생각합니다.우리는 산전 손상 후 발달 중인 뇌에서 미세아교세포 상태와 기능을 특성화하기 위해 단일 세포 RNA 시퀀싱 및 유세포 분석 실험과 같은 다양한 양식을 사용하고 있습니다. 주요 과제는 분리 중, 특히 소뇌 세포 수가 제한된 신생아 시점에서 세포 생존력과 미세아교세포 정체성을 보존하는 것입니다. 이는 초기 소뇌 손상이 어떻게 미세아교세포 하위 집단의 전사 변화로 이어지는지, 그리고 표적 요법이 이러한 변화를 어떻게 조절할 수 있는지에 대한 의문을 제기합니다.시작하려면 필요에 따라 생쥐의 특정 뇌 영역을 해부하십시오. 집게를 사용하여 세포 생존력을 유지하기 위해 얼음 위에 놓인 미세아교세포 배양 배지가 들어 있는 작은 페트리 접시로 조직을 옮깁니다. 피펫을 사용하여 페트리 접시에서 미세아교세포 배양 배지를 제거합니다.그런 다음 메스를 사용하여 동일한 페트리 접시에서 뇌 조직을 잘게 자릅니다. 효소 소화를 위해 균질화된 뇌 조직을 5밀리리터 튜브로 옮깁니다. 콜라게나제 D와 DNase 1이 보충된 행크스 균형 소금 용액 2밀리리터를 각 튜브에 넣고 캡을 파라필름으로 단단히 밀봉합니다.그런 다음 튜브를 섭씨 37도의 수조에서 15분 동안 배양하고 5분마다 흔듭니다. 소화를 멈추려면 튜브를 얼음 위에 놓으십시오. 그런 다음 균질을 140마이크로미터 금속 메쉬 필터에 통과시켜 큰 잔해물을 제거합니다.유리 유봉을 사용하여 필터에 남아 있는 세포를 부드럽게 해리시킵니다. 각 세척에 대해 3밀리리터의 미세아교세포 배양 배지로 금속 메쉬 필터를 여러 번 세척합니다. 이제 10밀리리터 피펫을 사용하여 여과액을 모아 15밀리리터 튜브로 옮깁니다.그런 다음 튜브를 섭씨 4도에서 7분 동안 500g에서 원심분리합니다. 그런 다음 튜브를 조심스럽게 뒤집어 상층액을 버립니다. 랙을 사용하여 튜브를 부드럽게 긁어 펠릿을 재현탁합니다.그런 다음 재현탁된 세포에 37% 실리카 기반 콜로이드 배지 용액 10밀리리터를 첨가합니다. 용액을 섭씨 4도에서 10분 동안 500g에서 최소한의 파단력으로 원심분리합니다. 10밀리리터 피펫을 사용하여 용액 상단에서 미엘린 층을 흡인합니다.세포를 세척하려면 행크스 균형 소금 용액 10밀리리터를 넣고 튜브를 섭씨 4도에서 7분 동안 500g으로 원심분리합니다. 상청액을 버리고 펠릿을 재현탁한 후, 형광 활성화 세포 분류 완충액 10밀리리터를 튜브에 첨가합니다. 원심분리 후, 다운스트림 적용을 위해 최종 펠릿을 나머지 완충액에 재현탁합니다.분리된 모든 세포를 바닥이 원추형인 96웰 플레이트로 옮깁니다. 플레이트를 섭씨 4도에서 5분 동안 500g에서 원심분리합니다. 한 번의 동작으로 플레이트를 빠르게 뒤집어 상청액을 버립니다.그런 다음 세포 펠릿을 25마이크로리터의 차단 용액에 재현탁하고 플레이트를 실온에서 15분 동안 배양합니다. 세포외 항체 염색 혼합물을 준비하기 위해, 항체 스톡 튜브를 10, 000g에서 원심분리하여 응집체를 제거한다. 펠릿을 방해하지 않고 상층액에서 필요한 부피를 흡인합니다.형광 활성화 세포 분류 완충액을 사용하여 총 부피를 25마이크로리터로 조정합니다. 이제 각 웰에 25마이크로리터의 세포외 항체 염색 혼합물을 추가하고 플레이트를 실온에서 20분 동안 배양합니다. 혼합하지 않고 각 웰에 150마이크로리터의 형광 활성화 세포 분류 완충액을 추가합니다.플레이트를 섭씨 4도에서 5분 동안 500g에서 원심분리합니다. 그런 다음 플레이트를 빠르게 뒤집어 한 번에 상청액을 제거합니다. 세포 펠릿을 200마이크로리터의 형광 활성화 세포 분류 완충액에 재현탁하고 앞서 설명한 대로 원심분리합니다.세포를 100마이크로리터의 사포닌-파라포름알데히드 완충액에 재현탁하여 세포를 고정하고 투과시킵니다. 그런 다음 접시를 빛으로부터 보호한 실온에서 10분 동안 배양합니다. 혼합하지 않고 각 웰에 100마이크로리터의 사포닌 완충액을 추가합니다.플레이트를 섭씨 4도에서 6분 동안 500g에서 원심분리합니다. 그런 다음 플레이트를 뒤집어 한 번의 동작으로 상청액을 제거하고 세포 펠릿을 200마이크로리터의 사포닌 완충액에 재현탁합니다. 다음으로, 11개의 빈 웰에 20마이크로리터의 비드를 추가하여 보상 대조군을 준비합니다.세포내 항체 염색 혼합물을 준비하기 위해, 항체 스톡 튜브를 10, 000g에서 원심분리하여 잠재적인 응집체를 제거한다. 펠릿을 방해하지 않고 상층액에서 필요한 부피를 흡인합니다. 사포닌 완충액을 사용하여 부피를 50마이크로리터로 조정합니다.그런 다음 세포 펠릿을 50마이크로리터의 세포내 항체 혼합물에 재현탁합니다. 각 항체 1마이크로리터를 각 비드 웰에 추가하고 플레이트를 실온에서 30분 동안 배양합니다. 혼합하지 않고 세포 샘플이 포함된 각 웰에 150마이크로리터의 사포닌 완충액을 첨가합니다.각 보상 대조군 웰에 100마이크로리터의 형광 활성화 세포 분류 완충액을 첨가하여 비드를 세척합니다. 플레이트가 원심분리되면 세포 펠릿과 대조군을 각각 200마이크로리터의 사포닌 완충액과 형광 활성화 세포 분류 완충액에 재현탁합니다. 플레이트를 섭씨 4도에서 6분 동안 500g으로 원심분리하고 상청액을 제거합니다.세포 샘플과 보상 대조군을 200마이크로리터의 형광 활성화 세포 분류 완충액에 재현탁합니다. 현탁액을 표지된 형광 활성화 세포 분류 튜브로 옮깁니다. 단일 세포 RNA 시퀀싱은 전사 프로필을 기반으로 다른 뇌 세포 유형과 분리된 뚜렷한 미세아교세포 클러스터를 식별했습니다.차등 발현 분석은 Csf1r, Fcrls, Fyb, Adap2 및 P2ry12를 포함하여 미세아교세포에서 유의하게 상향 조절된 유전자를 밝혔습니다. 미세아교세포는 CD45 및 CD11b 마커의 뚜렷한 발현을 기반으로 살아있는 뇌 샘플에서 성공적으로 분리되었습니다. CD80, CD86, iNOS, CD206 및 Arg1, CD86 및 CD64, CD163과 CD206을 포함한 활성화 마커의 조합을 기반으로 뚜렷한 미세아교세포 하위 집단이 확인되었습니다.Ptprc 및 Itgam의 마커 유전자 발현은 umap 투영에서 미세아교세포 클러스터에 특이적으로 국한되어 이들 세포의 정체성을 확인했습니다. 바이올린 플롯 분석은 비히클 대조군에 비해 처리된 미세아교세포에서 Fcgr1 및 Cd86과 같은 항염증 마커의 발현이 더 낮은 것으로 나타났습니다.

flow-cytometry-single-cell-analysis-for-characterizing-microglia

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

Microglia은 중추 신경계의 방어 및 면역 감시의 첫번째 라인을 제공 macrophages를 거주하고 있습니다. MicroRNAs는 활성화 및 macrophages의 차별화 등 많은 생리 과정에 중요한 역할을 규제 분자입니다. 이 문서에서는 microglia에서 microRNAs의 측정을위한 방법을 설명합니다.

일반 CNS의 실시간 PCR에 의한과 Neuroinflammation 동안 Microglia에 MicroRNAs의 탐지

미세 아교 세포 생물학의 성공적인 조사에 하나의 키는 CNS의 조직으로부터 분리하는 동안 생체 미세 아교 immunofunction의 보존이다. 형광 이미징, 면역 세포 화학, 및 염증성 자극 지질 다당류 (LPS)와 팸 3 CSK 4 (팸)와 ELISA 다음 미세 아교 세포의 활성에 의해 평가 매우 순수하고 immunofunctional 세포 배양에 회전 흔들림 결과를 통해 미세 아교 세포를 분리.

쥐과 신생아에서 보존 면역 표현형과 기능으로 두피 소교 세포의 분리

미세 아교 세포의 활성화 및 microgliosis 만성 신경 퇴행의 핵심 반응이다. 여기, 우리는 생체 내, 공 초점 검안경으로 망막 CX3CR1-GFP + 미세 아교 세포의 장기 시각화를위한 방법을 제시하고, 임계 값 및 형태 계측 학적 대한 식별과 활성화를 정량화 분석한다. 우리는 연령과 관련된 녹내장의 초기 단계 소교 변경 사항을 모니터링 할 수 있습니다.

마우스 녹내장에 공 촛점 안저 이미징 및 세포 형태 계측 : 신경 퇴행 중 망막 미세 아교 활성화의 생체 역학

이 프로토콜은 유행 세포 계측법에 의한 성체 마우스 중추 신경계에서 대 식세포 모집단의 분석을 제공하며, 이들 세포에 의해 표현되는 다중 마커의 연구에 도움이됩니다.

유동 세포 계측법에 의한 중추 신경계에서 유래 된 대장 세포 및 단구 세포 유래 대 식세포의 분석

기본 microglia murine 두뇌에서의 격리에 대 한 프로토콜 제공 됩니다. 이 기술은 신경 상황의 현재 이해를 발전에 에이즈. 조밀도 기온 변화도 원심 분리와 자력 분리 매우 순수한 샘플의 충분 한 수확량을 생산 하기 위해 결합 됩니다. 또한, 우리 microglia의 특성에 대 한 단계를 설명합니다.

특성화 및 조밀도 기온 변화도 원심 분리 하 여 마우스 기본 Microglia의 절연

1차 미세아교세포 배양은 일반적으로 새로운 항염증 분자를 평가하는 데 사용됩니다. 본 프로토콜은 신생아 새끼로부터 미세아교세포를 자기적으로 분리하는 재현 가능하고 관련성 있는 방법을 설명합니다.

일차 세포 배양을 위한 Neonate 마우스의 미세아교세포의 자기 분리

여기에서, 우리는 원주형 자기 활성화 세포 분류를 활용하여 탈수초성 질환의 동물 모델에서 원발성 미세아교세포를 분리하고 정제하는 프로토콜을 제시한다.

탈수초화의 동물 모델에서 자기 활성화 세포 분류에 의한 마우스 일차 미세아교세포의 분리

이 연구는 고립된 뇌 미세아교세포에서 핵내 유세포 분석을 사용하여 전역 히스톤 변형의 정량화를 위한 프로토콜을 설명합니다. 이 작업에는 데이터 수집에 사용된 미세아교세포 격리 프로토콜도 포함되어 있습니다.

분리된 마우스 뇌 미세아교세포에서 핵내 유세포 분석을 사용한 글로벌 히스톤 번역 후 변형의 정량화

여기에서는 유세포 분석을 사용하여 vGLUT1 양성 시냅스 및 pHRodo Red 표지 미처리 시냅토좀의 미세아교세포 삼킴을 정량화하는 두 가지 프로토콜을 제시합니다.

유세포분석을 사용한 시냅스 물질의 미세아교세포 삼킴 정량화

본 프로토콜은 성체 마우스에서 1차 해마 미세아교세포를 분리 및 정제하는 방법을 설명한 다음, 이러한 급성으로 분리된 세포에서 전체 세포 패치 클램프 기록을 수행하기 위한 지침을 설명합니다.

성체 마우스에서 해마 미세아교세포의 분리 및 전체 세포 패치-클램프 기록

배우세요 출생 후 초기 마우스 소뇌에서 미세아교세포를 유세포 분석 및 단일 세포 RNA 시퀀싱으로 분리하고 특성화하는 방법을. 효소적 분리와 퍼콜 원심분리를 활용하여 세포 이질성을 밝히고 뇌 발달 및 질병 메커니즘 이해에 기여합니다.

출생 후 초기 마우스 뇌 발달에서 미세아교세포 활성화를 특성화하기 위한 유세포 분석 및 단일 세포 분석

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