출생 후 초기 마우스 뇌 발달에서 미세아교세포 활성화를 특성화하기 위한 유세포 분석 및 단일 세포 분석

우리의 연구는 미세아교세포가 산전 뇌 손상 후 뇌 복구에 어떤 영향을 미치는지 탐구합니다. 그리고 우리는 미세아교세포 활동을 조절하는 것이 장기적인 신경학적 결과를 개선할 수 있는지 여부를 결정하는 것을 목표로 합니다. 저는 이것이 미세아교세포 반응의 복잡성과 생리학적, 병리학적 반응 및 질병을 표현하기 위해 이러한 반응을 가장 정확한 방식으로 설명하는 데 어려움이 있다고 생각합니다.

우리는 산전 손상 후 발달 중인 뇌에서 미세아교세포 상태와 기능을 특성화하기 위해 단일 세포 RNA 시퀀싱 및 유세포 분석 실험과 같은 다양한 양식을 사용하고 있습니다. 주요 과제는 분리 중, 특히 소뇌 세포 수가 제한된 신생아 시점에서 세포 생존력과 미세아교세포 정체성을 보존하는 것입니다. 이는 초기 소뇌 손상이 어떻게 미세아교세포 하위 집단의 전사 변화로 이어지는지, 그리고 표적 요법이 이러한 변화를 어떻게 조절할 수 있는지에 대한 의문을 제기합니다.

시작하려면 필요에 따라 생쥐의 특정 뇌 영역을 해부하십시오. 집게를 사용하여 세포 생존력을 유지하기 위해 얼음 위에 놓인 미세아교세포 배양 배지가 들어 있는 작은 페트리 접시로 조직을 옮깁니다. 피펫을 사용하여 페트리 접시에서 미세아교세포 배양 배지를 제거합니다.

그런 다음 메스를 사용하여 동일한 페트리 접시에서 뇌 조직을 잘게 자릅니다. 효소 소화를 위해 균질화된 뇌 조직을 5밀리리터 튜브로 옮깁니다. 콜라게나제 D와 DNase 1이 보충된 행크스 균형 소금 용액 2밀리리터를 각 튜브에 넣고 캡을 파라필름으로 단단히 밀봉합니다.

그런 다음 튜브를 섭씨 37도의 수조에서 15분 동안 배양하고 5분마다 흔듭니다. 소화를 멈추려면 튜브를 얼음 위에 놓으십시오. 그런 다음 균질을 140마이크로미터 금속 메쉬 필터에 통과시켜 큰 잔해물을 제거합니다.

유리 유봉을 사용하여 필터에 남아 있는 세포를 부드럽게 해리시킵니다. 각 세척에 대해 3밀리리터의 미세아교세포 배양 배지로 금속 메쉬 필터를 여러 번 세척합니다. 이제 10밀리리터 피펫을 사용하여 여과액을 모아 15밀리리터 튜브로 옮깁니다.

그런 다음 튜브를 섭씨 4도에서 7분 동안 500g에서 원심분리합니다. 그런 다음 튜브를 조심스럽게 뒤집어 상층액을 버립니다. 랙을 사용하여 튜브를 부드럽게 긁어 펠릿을 재현탁합니다.

그런 다음 재현탁된 세포에 37% 실리카 기반 콜로이드 배지 용액 10밀리리터를 첨가합니다. 용액을 섭씨 4도에서 10분 동안 500g에서 최소한의 파단력으로 원심분리합니다. 10밀리리터 피펫을 사용하여 용액 상단에서 미엘린 층을 흡인합니다.

세포를 세척하려면 행크스 균형 소금 용액 10밀리리터를 넣고 튜브를 섭씨 4도에서 7분 동안 500g으로 원심분리합니다. 상청액을 버리고 펠릿을 재현탁한 후, 형광 활성화 세포 분류 완충액 10밀리리터를 튜브에 첨가합니다. 원심분리 후, 다운스트림 적용을 위해 최종 펠릿을 나머지 완충액에 재현탁합니다.

분리된 모든 세포를 바닥이 원추형인 96웰 플레이트로 옮깁니다. 플레이트를 섭씨 4도에서 5분 동안 500g에서 원심분리합니다. 한 번의 동작으로 플레이트를 빠르게 뒤집어 상청액을 버립니다.

그런 다음 세포 펠릿을 25마이크로리터의 차단 용액에 재현탁하고 플레이트를 실온에서 15분 동안 배양합니다. 세포외 항체 염색 혼합물을 준비하기 위해, 항체 스톡 튜브를 10, 000g에서 원심분리하여 응집체를 제거한다. 펠릿을 방해하지 않고 상층액에서 필요한 부피를 흡인합니다.

형광 활성화 세포 분류 완충액을 사용하여 총 부피를 25마이크로리터로 조정합니다. 이제 각 웰에 25마이크로리터의 세포외 항체 염색 혼합물을 추가하고 플레이트를 실온에서 20분 동안 배양합니다. 혼합하지 않고 각 웰에 150마이크로리터의 형광 활성화 세포 분류 완충액을 추가합니다.

플레이트를 섭씨 4도에서 5분 동안 500g에서 원심분리합니다. 그런 다음 플레이트를 빠르게 뒤집어 한 번에 상청액을 제거합니다. 세포 펠릿을 200마이크로리터의 형광 활성화 세포 분류 완충액에 재현탁하고 앞서 설명한 대로 원심분리합니다.

세포를 100마이크로리터의 사포닌-파라포름알데히드 완충액에 재현탁하여 세포를 고정하고 투과시킵니다. 그런 다음 접시를 빛으로부터 보호한 실온에서 10분 동안 배양합니다. 혼합하지 않고 각 웰에 100마이크로리터의 사포닌 완충액을 추가합니다.

플레이트를 섭씨 4도에서 6분 동안 500g에서 원심분리합니다. 그런 다음 플레이트를 뒤집어 한 번의 동작으로 상청액을 제거하고 세포 펠릿을 200마이크로리터의 사포닌 완충액에 재현탁합니다. 다음으로, 11개의 빈 웰에 20마이크로리터의 비드를 추가하여 보상 대조군을 준비합니다.

세포내 항체 염색 혼합물을 준비하기 위해, 항체 스톡 튜브를 10, 000g에서 원심분리하여 잠재적인 응집체를 제거한다. 펠릿을 방해하지 않고 상층액에서 필요한 부피를 흡인합니다. 사포닌 완충액을 사용하여 부피를 50마이크로리터로 조정합니다.

그런 다음 세포 펠릿을 50마이크로리터의 세포내 항체 혼합물에 재현탁합니다. 각 항체 1마이크로리터를 각 비드 웰에 추가하고 플레이트를 실온에서 30분 동안 배양합니다. 혼합하지 않고 세포 샘플이 포함된 각 웰에 150마이크로리터의 사포닌 완충액을 첨가합니다.

각 보상 대조군 웰에 100마이크로리터의 형광 활성화 세포 분류 완충액을 첨가하여 비드를 세척합니다. 플레이트가 원심분리되면 세포 펠릿과 대조군을 각각 200마이크로리터의 사포닌 완충액과 형광 활성화 세포 분류 완충액에 재현탁합니다. 플레이트를 섭씨 4도에서 6분 동안 500g으로 원심분리하고 상청액을 제거합니다.

세포 샘플과 보상 대조군을 200마이크로리터의 형광 활성화 세포 분류 완충액에 재현탁합니다. 현탁액을 표지된 형광 활성화 세포 분류 튜브로 옮깁니다. 단일 세포 RNA 시퀀싱은 전사 프로필을 기반으로 다른 뇌 세포 유형과 분리된 뚜렷한 미세아교세포 클러스터를 식별했습니다.

차등 발현 분석은 Csf1r, Fcrls, Fyb, Adap2 및 P2ry12를 포함하여 미세아교세포에서 유의하게 상향 조절된 유전자를 밝혔습니다. 미세아교세포는 CD45 및 CD11b 마커의 뚜렷한 발현을 기반으로 살아있는 뇌 샘플에서 성공적으로 분리되었습니다. CD80, CD86, iNOS, CD206 및 Arg1, CD86 및 CD64, CD163과 CD206을 포함한 활성화 마커의 조합을 기반으로 뚜렷한 미세아교세포 하위 집단이 확인되었습니다.

Ptprc 및 Itgam의 마커 유전자 발현은 umap 투영에서 미세아교세포 클러스터에 특이적으로 국한되어 이들 세포의 정체성을 확인했습니다. 바이올린 플롯 분석은 비히클 대조군에 비해 처리된 미세아교세포에서 Fcgr1 및 Cd86과 같은 항염증 마커의 발현이 더 낮은 것으로 나타났습니다.