Name: 광학 이미징과 비침습 감지를위한 형광 염료와 함께 줄기 세포를 라벨링 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-04-02T18:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: 학습하세요 줄기세포 형광 라벨링 기법으로 생체 내 이동을 비침습적으로 추적하는 방법을. 인간 배아줄기세포와 중간엽줄기세포에 형광 염료를 적용하여 광학 이미징으로 장기간 관찰합니다.

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이 프로젝트는 재생 의료에 대한 캘리포니아 연구소에서 레온 J. Thal 시드 부여에 의해 지원되었다. 토바 이어스 헤닝는 독일 연구 협회 (DFG, HE 4578/1-2)에서 급비 연구에 의해 투자되었다. 우리는 기꺼이 그 인간의 배아 줄기 세포의 문화에 대한 그의 조언 후아의 Meneses을 인정 싶어요.

형광 염료와 mesenchymal 줄기 세포의 라벨링 것은나요 <ol><li> mesenchymal 줄기 세포를 라벨에 대한 절차를 시작하려면 trypsinize 및 세포의 정의된 번호를 중지를 얻을 수있는 세포를 계산합니다. </li><li> 인큐베이터 밖으로 세포를 가지고 세포가 표시되는 포함된 flasks에서 이전 미디어를 기음 </li><li> MG / CA - 무료 PBS 10 ML있는 세포를 씻으십시오. PBS를 대기음. MG와 CA는 트립신을 억제 것이다 그러므로 우리는이없이는 PBS를 사용합니다. </li><li> 우리가 5ml를 사용하여 T75 플라스크에 대한 사전 예열 0.05 %의 트립신을 추가합니다. 술병의 전체 표면이 적용되었는지 확인하십시오. </li><li> 약 5 분 동안 37 ° C 배양기에서에 품어. </li><li> 현미경으로 초연을 확인합니다. 세포가 계속 술병을 준수하면, 몇 번 누르고 trypsinization이 성공 때까지 조금 더 기다려. </li><li> 이제 10 % FCS를 포함하는 미디어를 추가하여 트립신을 중화하는 것이 필요합니다. 트립신가로서 우리는 매체의 동일한 금액을 사용합니다. </li><li> 모든 세포가 언론에 다시 중단되는 것을 보장하기 위해 몇 번 위아래로 피펫합니다. </li><li> 멸균 15ml 덮인 폴리 프로필렌 튜브에 세포 솔루션을 전송합니다. </li><li> 5 분 400 RCF에서 원심 분리기. </li><li> 세포 펠렛을 방해하지 않도록 보장 뜨는을 대기음. </li><li> DMEM에있는 세포를 Resuspend 및 세포 개수와 함께 진행합니다. </li><li> 혈청이없는 배지 (DMEM)에 ML 당 ^ 6 1x10의 밀도에 표시되도록 세포를 일시 중지합니다. </li><li> 이것은 세포 현탁액의 모든 준비했습니다. 지금, 그것은 상표를 시작할 준비가 된 것입니다. </li><li> 첫째, 세포 현탁액의 ML 당나요 대비 에이전트의 5 μL를 추가합니다. </li><li> 그런 다음, 부드럽게 pipetting하여 솔루션을 섞는다. </li><li> 37 라벨 솔루션 ° 6 - 잘 낮은 첨부 접시에 20 분 C와 세포를 품어. </li><li> 간단한 배양이 완료되면, 그것은 15 ML 덮인 폴리 프로필렌 튜브에 세포 솔루션을 전송하는 것이 필요합니다. </li><li> 5 분 400 RCF에서 내려 원심 분리기. </li><li> 세포 펠렛을 방해하지 않도록 보장 라벨 매체를 대기음. </li><li> PBS로 세포를 씻으십시오. 세포를 피펫 아래로, 세포 펠렛을 휴식해야하고. </li><li> 후자의 두 단계 두 번 더 반복하므로 3 세척 단계 총 있습니다. </li><li> 세포를 카운트하고 세포 생존을 결정하기 위해 Trypan 파랑 테스트를 수행합니다. 이것은 우리가 여기서 설명하지 않을 것을 표준 세포 배양 프로토콜입니다. </li><li> 당신의 세포는 현재 광학 영상기에 몇 군데 준비하고 있습니다. </li></ol> 형광 염료의 ICG와 인간 배아 줄기 세포의 라벨링 <ol><li> 인간 배아 줄기 세포를 라벨에 대한 절차를 시작하려면 대비 에이전트가 그린 Indocyanine 준비합니다. transfection 에이전트 프로타민와 함께 섞는다. </li><li> Indocyanine 그린 파우더 1mg을 측정합니다. 디메틸 Sulfoxide (DMSO) 100 μL에 ICG 분말을 디졸브. </li><li> 혼합물에 Dulbecco의 수정 이글스 중간 (DMEM + 10% 소태아 세럼) 미디어 400 μL를 추가하고 잘 흔들어. 의 2mg/ml의 최종 농도이 결과는 그린 Indocyanine. </li><li> transfection 에이전트 프로타민를 추가합니다. 대비 에이전트 셔틀로 프로타민 행위, 그것이보다 효율적으로 세포에 도착 있도록. </li><li> 300 μL ICG 300 μL 혈청 무료 Dulbecco의 수정 이글스 매체, 10mg/ml의 농도에서 제공하는 5 μL 프로타민 황산을 섞는다. </li><li> 부드럽게 양식으로 복잡한 수 있도록 5 분 동안 새로운 transfection 솔루션을 흔들. </li><li> 라벨 솔루션은 준비가 된 것입니다. </li><li> hESC 10mm 페트리 접시에서 기존의 미디어를 대기음. </li><li> 사전 예열 혈청없는 DMEM의 5ml를 추가합니다. </li><li> 세포에 이전 준비 프로타민 / ICG 솔루션을 추가합니다. 37 인큐베이터에있는 접시를 배치하여 1 시간 보육을 시작 ° C. </li><li> 배양이 완료되면, 인큐베이터에서 접시를 제거하고 라벨 솔루션을 대기음. </li><li> 5 ML PBS로 접시를 rinsing하여 세포를 씻으십시오. </li><li> PBS를 기음과 0.25 %의 트립신의 5ml로 바꿉니다. ° C 5 분 trypsinization가 발생할 수 있도록 37 접시를 품어. 그것은 한동안 조금 매번 접시를 흔들 수 있도록 도와줍니다. </li><li> 부드럽게 남아있는 식민지를 깨고, 아래로 피펫합니다. </li><li> 접시에 KSR의 동일한 금액을 추가하여 트립신을 중화. </li><li> 15ml 튜브에 세포 솔루션을 전송 5 분 400 RCF에서 솔루션을 원심 분리기. </li><li> 전체 미디어 세포를 Resuspend. </li><li> 지금이 시점에서 대단히 짧은 시간이있다면, trypsinize 다시 원심 분리기. </li><li> 덩어리가없는 세포 솔루션 달성되면, 기존의 미디어를 기음과 미리 예열 전체 ESC 미디어의 10ml의 펠렛을 resuspend. </li><li> 이 시점에서, 그것은 hESCs에서 마우스 피더 세포를 분리하는 것이 필요합니다. 이것은 그것을 보장하기 위해 수행, 나중에, 오직 영상 줄기 세포가 발생합니다. </li><li> 이를 위해 일을 전송할젤라틴 코팅 10cm 접시에 전자 전지 솔루션입니다. </li><li> 37 ° C 배양기에 접시를 넣어 45 분 동안 앉아 보자. 이 시간 동안 접시를 방해하지 않도록하십시오. 자, 피더는 음식을 준수하고 줄기 세포는하지 않습니다. </li><li> 페트리 접시 밖으로 솔루션을 전송합니다. 지금 우리는 인간의 배아 줄기 세포의 표시 단일 세포의 해결책을 가지고 있습니다. </li><li> 세포는 현재 계산 수 있으며 Trypan 파랑 시험은 그들을 수행할 수 있습니다. </li><li> 세포가 몇 군데 준비 있습니다! </li></ol>

<ol><li>Daldrup-Link, H. E., Rudelius, M., Metz, S., Piontek, G., Settles, M., Pichler, B., Heinzmann, U., Weinmann, H. J., Schlegel, J., Link, T. M., Rummeny, E. J., Oostendorp, R. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+tracking+with+Gadophrin-2+--+a+bifunctional+contrast+agent+for+MR+imaging%2C+optical+imaging+and+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Nucl+Med+Mol+Imaging%22%5BJournal%5D)">Stem cell tracking with Gadophrin-2 -- a bifunctional contrast agent for MR imaging, optical imaging and fluorescence microscopy.</a> Eur J Nucl Med Mol Imaging. 31, 1312-1321 (2004).</li>
<li>Simon, G. H., Daldrup-Link, H. E., Kau, J., Metz, S., Schlegel, J., Piontek, G., Saborowski, O., Demos, S., Duyster, J., Pichler, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+experimental+arthritis+using+allogeneic+leukocytes+labeled+with+a+near-infrared+fluorescent+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Nucl+Med+%26+Mol+Imaging%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of experimental arthritis using allogeneic leukocytes labeled with a near-infrared fluorescent probe.</a> Eur J Nucl Med & Mol Imaging. 33, 998-1006 (2006).</li>
<li>Sutton, E., Henning, T., Pichler, B., Bremer, C., Daldrup-Link, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Tracking+with+Optical+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Radiol%22%5BJournal%5D)">Cell Tracking with Optical imaging.</a> Eur Radiol. 2, 350-357 (2003).</li>
<li>Funovics, M. A., Alencar, H., Su, H. S., Khazaie, K., Weissleder, R., Mahmood, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniaturized+multichannel+near+infrared+endoscope+for+mouse+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Imaging%22%5BJournal%5D)">Miniaturized multichannel near infrared endoscope for mouse imaging.</a> Mol Imaging. 2, 350-357 (2003).</li>
</ol>

오이는 형광의 감지에 따라 비교적 새로운 이미징 기술입니다. 오이는 radiotracer 기반 이미징 기술을 같이 구분하지만, 모든 방사선 노출과 관련되지 않았습니다. 오이는이를 대상 사이트에 셀 마이 그 레이션에 대한 통찰력을 제공하는 비 invasively하고 반복적으로 추적 세포의 효과적인 수단을 제공합니다. 기술 중 하나는 주요 제한은 생체내에 형광 프로브의 제한된 조직 침투입니다. 따라서 피부 표면 5-10cm에 대한보다 깊은 조직의 추적 축적은, 감지되지 않을 수도 있습니다. 현재 임상 응용 프로그램 등, 내시경 심혈관 및 retinae 이미징 (Funovics 외. 2003)로 표면 기술로 제한되어 있습니다하지만, 연구의 도메인 생체내 세포 추적에 의해 제공하는 거대한 가능성의 인식을 통해 확장하는 것입니다.

<table><tbody><tr><td>Indocyanine Green (IR-125)</td><td>시약</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC41254-1000</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-2650</td><td></td></tr><tr><td>D-MEM High Glucose </td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5648</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td>PBS에서 최종 농도 0.1%로 희석</td></tr><tr><td>PBS, Mg 및 Ca free</td><td>시약</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 0.05% </td><td>시약</td><td>Invitrogen</td><td>25300-120</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 0.25% </td><td>시약</td><td>Invitrogen</td><td>25200-114</td><td></td></tr><tr><td>FCS, characterized</td><td>시약</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Cell Strainer (40 &amp;mu;m Nylon)</td><td>시약</td><td>BD Biosciences</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>DiD</td><td>시약</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>V-22887</td><td></td></tr><tr><td>Knockout DMEM</td><td>시약</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>10829018</td><td></td></tr><tr><td>Knockout Serum Replacer</td><td>시약</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>b-Mercapt&amp;#8211;thanol </td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7522</td><td></td></tr><tr><td>Non-essential Amino Acids </td><td>시약</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>FGF-2</td><td>시약</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine 200mM </td><td>시약</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>시약</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Protamine Sulfate</td><td>시약</td><td>American Pharmaceutical Partners</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

광학 이미징과 비침습 감지를위한 형광 염료와 함께 줄기 세포를 라벨링

 Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

광학 이미징 (오이)는 새로운 줄기 세포 기반 요법의 생체내 모니터링을 위해 쉽고, 빠르고 저렴한 도구입니다. 이 기술은 형광 염료, 특정 대상 기관 또는 pathologies들의 축적의 라벨 세포 및 시각화의 후속 정맥 주사와 함께 줄기 세포의 생체내 전 라벨에 따라 달라집니다. 제공 기술나요 (C67H103CIN2O3S)와 우리가 인간 배아의 줄기 세포를 (hESC) 라벨을 어떻게 FDA는 형광 염료가 그린 (ICG)을 Indocyanine 승인을 우리가 lipophilic 형광 염료와 함께 간단하게 부화하여 인간 mesenchymal 줄기 세포 (hMSC)를 분류하는 방법을 보여줍니다. 이해 메커니즘은 인지질의 세포 막 이중층에 걸쳐 lypophilic 염료의 준수 및 확산을 통해이다. 세포와 같은 혈청 함유 미디어 부화 반대로 혈청없는 미디어의 염료와 incubated하는 경우 라벨의 효율은 일반적으로 향상됩니다. 또한, transfection 에이전트 프로타민 황산의 추가가 대비 에이전트 이해를 크게 향상시킵니다.

이 동영상은 형광 염료와 인간 배아 줄기 세포 및 mesenchymal 줄기 세포의 라벨에 대한 기술을 보여줍니다. 이 기술은 광학 이미징과 이식 줄기 세포의 생체내 추적에와 형광 현미경과 histopathological 상관 관계에 대해 사용할 수 있습니다.

광학 이미징(Optical imaging, OI)은 새로운 줄기세포 기반 치료법의 생체 내(in vivo) 모니터링을 위한 쉽고 빠르며 비용 효율적인 도구입니다. 이 기술은 생체 외(ex vivo) ...

Hiku Alge Blink 박사님의 연구실에 오신 것을 환영합니다. 이 프로젝트에 연구비를 지원해 주신 캘리포니아 재생의학 연구소(California Institute of Regenerative Medicine)에 감사드립니다. 줄기세포를 형광 조영제로 표지하면 이식된 줄기세포를 생체 내에서 추적할 수 있습니다.표지된 줄기세포의 후속 광학 이미징을 통해 세포의 in vivo 이동을 비침습적으로 모니터링할 수 있는 종단적 연구가 가능해집니다. 이 영상에서는 형광 염료를 사용하여 인간 배아 줄기세포와 인간 중간엽 줄기세포를 모두 표지하는 방법을 보여드리겠습니다. 안녕하세요, 저는 샌프란시스코 캘리포니아 대학교 방사선학과 조영제 연구 그룹의 Sophie Boddington입니다.오늘은 형광 조영제를 사용하여 줄기세포를 표지하는 두 가지 서로 다른 기술을 보여드리고자 합니다. 하나는 형광 염료인 DID를 사용하여 중간엽 줄기세포를 표지하는 방법이고, 다른 하나는 endign ingra를 사용하여 인간 배아 줄기세포를 표지하는 방법입니다. 먼저 DID를 이용한 인간 중간엽 줄기세포 표지 기술부터 보여드리겠습니다.중간엽 줄기세포 표지 절차를 시작하기 위해, 먼저 세포를 분석하고 수를 세어 정해진 수의 세포가 포함된 현탁액을 준비해야 합니다. 이는 표준 조직 배양 기술이므로 상세히 설명하지는 않겠습니다. 표지할 세포를 무혈청 배양 배지에서 1 million cells/mL 밀도로 현탁하고자 합니다.먼저, 세포 현탁액 1mL당 5µL의 DID 대비제를 첨가합니다. 이제 파이펫팅을 통해 용액을 부드럽게 혼합합니다. 세포는 37°C의 6-웰 저부착 디쉬에서 라벨링 용액과 함께 20분 동안 배양합니다. 간단한 배양이 완료되면, 세포 용액을 15mL 원심분리 튜브로 옮겨야 합니다.400 RCF에서 5분 동안 원심분리합니다. 다음으로, 펠렛이 손상되지 않도록 주의하며 라벨링 배지를 흡입하여 제거합니다. 이제 PBS로 세포를 세척합니다.피펫팅을 통해 세포 펠렛(cell palette)이 완전히 풀리도록 세포를 위아래로 섞어줍니다. 마지막 두 단계를 두 번 더 반복하여 총 세 번의 세척 과정을 수행합니다.이제 세포 수를 측정하고 트립판 블루(trypan blue) 테스트를 수행하여 세포 생존율을 결정합니다. 세포 생존율을 확인한 후, 세포를 광학 이미저(optical imager)로 촬영할 준비가 완료됩니다. 인간 배아 줄기세포의 라

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

새로운 줄기 세포 요법의 평가는 생체내에 주입된 세포를 추적 비 invasively하는 것이 중요합니다. 이 동영상은 생체내의 후속 MR 영상에 대한 생체내의 철 산화물 기반의 콘트라스트 에이전트와 인간 mesenchymal와 배아 줄기 세포를 레이블하는 방법을 보여줍니다.

이런 산화물로 hESCs과 hMSCs을 라벨링하는 MR 영상과 생체내 추적 비침습에 대한 Nanoparticles

줄기 세포 요법에 대한 관심이 점점으로, 분자 이미징 기술은 이식 후 모니터링 줄기 세포 행동에 이상적입니다. 루시페라제 리포터 유전자는 세포 생존, 위치 및 생체내의 확산의 비침습, 반복적인 평가를 활성화합니다. 이 동영상은 살아있는 마우스의 hESC 확산을 추적하는 방법을 보여줍니다 것입니다.

체외에서 인간 배아 줄기 세포의 생체내의 Bioluminescence 리포터 진 영상에

우리는 FDA 승인, superparamagnetic 철 산화물 (SPIO), ferumoxytol (Feraheme)와 줄기 세포를 라벨링 및 추적을위한 기술을 설명합니다. 시각화에 대한 자기 공명 (MR) 영상을 이용하여이 세포 이미징 기술은 환자의 성공 여부에 줄기 세포 engraftments의 장기 모니터링 및 진단을 위해 쉽게 액세스할 수 있습니다.

Ferumoxytol, FDA 승인 철 산화물 Nanoparticle과 함께 줄기 세포를 라벨링

조혈 줄기 및 전구 세포의 표시 조합 5 형광 단백질은 재생 중에 골수 조혈 아키텍처에 대한 통찰력을 제공하는 공 초점과 두 광자 현미경을 통해 생체 클론 추적에 있습니다. 이 방법은 이식 다음 시간의 광범위한 기간에 대한 손상 조직의 스펙트럼으로 구분 HSPCs 유래 세포의 비 침습적 운명 매핑 할 수 있습니다.

공 초점 및 다중 광자 현미경을 사용하여 다섯 형광 단백질에 의해 표시됨 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 클론 추적에서

이 기사에서는 R26R-Confetti 마우스를 사용하여 다중 색상 계통 추적 실험을 설계하고 수행하는 원칙을 설명합니다. 당사는 다른 관심 조직에 대해 변형될 수 있는 각막 상피 세포를 추적하기 위한 특정 프로토콜을 제공합니다.

멀티 컬러 형광 기자 마우스를 사용하여 각막 세포의 리니지 추적하는 방법

세포 이식, 세포골격 라벨링 및 기능 손실/이득 접근법을 결합한 이 프로토콜은 생체 내 세포 이동에서 후보 유전자의 기능을 분석하기 위해 이동하는 제브라피시 전향 prechordal plate를 사용하는 방법을 설명합니다.

분석<em&gt; 생체</em&gt; 셀 마이그레이션 Zebrafish의 배아에서 세포 이식 및 시간 경과 이미징을 사용하여

이 프로토콜에는 빨강 형광 라벨 내부 관절 (IA) 주입을 통해 쥐 무릎 관절염 (KOA) 모델에 의해 셀 속성과 biodistribution 인간 지방 유래 중간 엽 줄기 세포 (haMSCs)의 모니터링 하는 효율적인 방법을 설명 합니다.

Vivo에서 인간 지방 유래 중간 엽 줄기 세포 형광 질 성 막 염료와 쥐 무릎 관절염 모델에서의 추적

인간의 1차 전립선 상피 세포를 사용하여, 우리는 스페로이드 기반 의 라벨 보유 분석법에 의해 줄기 유사 세포의 기능적 특성화의 새로운 바이오마커 없는 방법을 보고합니다. BrdU, CFSE, 또는 파 레드 2D 셀 라벨링에 대해 단계별 프로토콜이 기재되어; 3 차원 스페로이드 형성; 면역 세포 화학에 의한 라벨-유지 줄기 유사 세포 식별; 및 FACS에 의해 격리.

3차원 스페로이드 배양에서 줄기와 같은 세포의 분리

이 프로토콜은 i) 컨포칼 현미경, ii) 강도 이미징을 수행하기 위한 형광 활성화 세포 분류기 또는 iii) 형광 수명 이미징을 수행하기 위한 다광자 현미경을 사용하여 자가형광 이미징을 통해 1차 성체 마우스 신경 줄기 세포 배양에서 세포 상태를 식별하고 강화하는 전략을 설명합니다.

자가형광을 이용한 Neural Stem Cell Activation State In Vitro 분류

여기에 설명된 생체내 영상화 방법은 대사 보조인자 NAD(P)H로부터의 콜라겐 초고조파 생성 및 내인성 형광을 이용하여 표지되지 않은 종양 미세환경을 종양, 기질 및 혈관 구획으로 비침습적으로 분절하여 4D 생체내 영상의 심층 분석을 한다.

유방 종양 미세환경의 생체 내 이미징을 위한 라벨 없는 세분화 접근법

마우스 앞니는 줄기 세포 틈새에 귀중한 표지 유지 세포를 포함합니다. 우리는 라벨 유지 세포를 편견 없이 검출하고 정량화하는 새로운 방법을 가지고 있습니다. 우리의 연구는 하악의 PEGASOS 조직 제거 후 EdU 라벨링과 3D 재구성 접근법을 사용했습니다.

Detection and Quantitation of Label-Retaining Cells in Mouse Incisors using a 3D Reconstruction Approach after Tissue Clearing

학습하세요 줄기세포 형광 라벨링 기법으로 생체 내 이동을 비침습적으로 추적하는 방법을. 인간 배아줄기세포와 중간엽줄기세포에 형광 염료를 적용하여 광학 이미징으로 장기간 관찰합니다.

광학 이미징과 비침습 감지를위한 형광 염료와 함께 줄기 세포를 라벨링

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