광학 이미징과 비침습 감지를위한 형광 염료와 함께 줄기 세포를 라벨링

Dr.Hiku Alge Blink의 연구실에 오신 것을 환영합니다. 이 프로젝트에 자금을 지원해 주신 캘리포니아 재생 의학 연구소(California Institute of Regenerative Medicine)에 감사드립니다. 형광 조영제로 줄기세포를 라벨링하면 이식된 줄기세포를 in vivo에서 추적할 수 있습니다.

표지된 줄기 세포의 후속 광학 이미징을 통해 생체 내에서 세포의 이동을 비침습적으로 모니터링할 수 있는 종단 연구를 수행할 수 있습니다. 이 동영상은 인간 배아 줄기 세포와 인간 중간엽 줄기 세포를 형광 염료로 라벨링하는 방법을 보여줍니다. 안녕하세요, 저는 캘리포니아 대학교 샌프란시스코 캠퍼스 방사선학과 조영제 연구 그룹의 소피 보딩턴(Sophie Boddington)입니다.

오늘은 형광 조영제로 줄기세포를 표지하는 두 가지 기술을 보여드리고자 합니다. 하나는 중간엽 줄기세포를 형광 염료인 DID로 표지하기 위한 것이고, 다른 하나는 인간 배아 줄기세포를 엔디그네 잉그라(endign ingra)로 표지하기 위한 것입니다. 먼저 DID로 인간 중간엽 줄기세포를 표지하는 기술을 보여드리겠습니다.

중간엽 줄기 세포를 표지하는 절차를 시작하려면 항아리를 시도하고 계수하여 정의된 수의 세포를 가진 현탁액을 얻어야 합니다. 이것은 표준 조직 배양 기술이므로 자세히 설명하지 않습니다. 우리는 무혈청 배양 배지에서 밀리리터당 100만 개의 세포의 밀도로 라벨링할 세포를 현탁시키고자 합니다.

먼저, 세포 현탁액 1ml당 5마이크로리터의 DID 조영제를 첨가합니다. 이제 우리는 부드러운 피펫팅으로 용액을 혼합하여 세포를 섭씨 37도에서 20분 동안 6개의 웰 저부착 접시에 라벨링 용액과 함께 배양합니다. 간단한 배양이 완료되면 이제 세포 용액을 15ml 원심분리 튜브로 옮겨야 합니다.

400 RCF에서 5분 동안 원심분리합니다. 다음으로, 펠릿을 방해하지 않도록 라벨링 매체를 흡입합니다. 이제 PBS로 세포를 세척합니다.

우리는 세포를 위아래로 피펫팅하여 세포 팔레트를 분해합니다. 후자의 두 단계. 총 세 가지 세탁 단계가 있도록 두 번 더 반복합니다.

이제 세포를 세고 트립 및 블루 테스트를 수행하여 세포 생존력을 확인합니다. 세포 생존율을 결정한 후 이제 광학 이미저에서 세포를 이미징할 준비가 되었습니다. 인간 배아 줄기 세포를 표지하는 절차를 시작하려면 먼저 인도시아닌 그린(Indocyanine Green)으로 알려진 조영제를 준비해야 합니다.

그런 다음 프로타민(protamine)으로 알려진 형질주입제(transfection)와 혼합합니다. 먼저 1밀리그램의 인도시아닌 녹색 분말을 측정하여 100마이크로리터의 DMSO에 용해시킵니다. 혼합물에 10%FCS를 함유한 DMEM 400마이크로리터를 첨가하고 잘 흔들면 인도시아닌 그린 1밀리리터당 2밀리그램의 농도가 됩니다.

다음으로, 조영제의 셔틀 역할을 하는 트랜스펙션제인 프로타민을 첨가하여 세포에 보다 효율적으로 침투할 수 있도록 합니다. 이제 우리는 5마이크로리터의 프로타민 설페이트를 밀리리터당 10밀리그램과 300마이크로리터의 ICG 및 300마이크로리터의 무혈청 DMEM과 혼합합니다. 이제 새로운 transfect 용액을 5분 동안 흔들어 복합체가 형성될 수 있도록 합니다.

다음으로, 오래된 배지를 흡인하고 10ml의 PREWARM DMEM을 세포에 추가합니다. 미리 준비된 프로타민 ICG 용액을 세포에 첨가하고 접시를 섭씨 37도의 인큐베이터에 넣어 1시간 배양을 시작합니다. 배양이 완료된 후, 인큐베이터에서 접시를 꺼내고 라벨링 용액을 흡입하고 접시를 5ml의 PBS로 헹궈 세포를 세척합니다.

그런 다음 세포는 섭씨 37도에서 5분 동안 트립화됩니다. 접시를 흔들면 세포를 현탁액으로 들어 올리는 데 도움이 됩니다. 이제 우리는 남은 군체를 분해하기 위해 위아래로 부드럽게 피펫팅합니다.

우리는 접시에 10%FCS를 함유한 동일한 양의 DMEM을 첨가하여 트립신을 중화합니다. 다음으로, 셀 용액을 15ml 튜브로 옮기고 400RCF에서 5분 동안 용액을 원심분리합니다. 우리는 전체 배지에서 세포를 재현탁합니다.

이제 40마이크로미터 세포 여과기를 통해 세포를 통과시켜 잔류 덩어리 또는 복합체를 제거할 수 있습니다. 덩어리가 없는 세포 용액이 있으면 오래된 배지를 흡인하고 펠릿을 미리 벌레가 있는 완전한 인간 배아 줄기 세포 배지에 재현탁합니다. 이 시점에서 우리는 인간 배아 줄기 세포에서 마우스 공급 세포를 분리해야 합니다.

이것은 나중에 줄기 세포만 이미징하도록 하기 위해 수행됩니다. 이를 위해 세포 용액을 젤라틴으로 코팅 된 10cm 페트리 접시로 옮깁니다. 우리는 접시를 37도 인큐베이터에 넣고 45분 동안 그대로 두었습니다.

이 시간 동안 접시를 방해하지 않도록 하십시오. 이제 먹이는 접시에 달라붙고 줄기 세포는 그렇지 않습니다. 우리는 용액을 페트리 접시 밖으로 옮기고 이제 인간 배아 줄기 세포로 구성된 표지된 단일 세포 용액을 갖게 되었습니다.

이제 셀을 세고 셀에 대해 파란색 트립 테스트를 수행할 수 있습니다. 생존 가능성을 확인한 후 세포를 이미지화할 준비가 되었습니다. 이 슬라이드는 줄기세포에 형광 조영제를 부착하고 IP 주입을 통해 투여한 후 생쥐에서 줄기세포를 in vivo에서 시각화할 수 있는 방법의 예를 보여줍니다.

연속 광학 이미징 스캔은 초기에 폐에 세포가 축적된 후 간, 사지의 골수 및 갑상선에 재분포하는 것을 보여주었습니다. 형광 라벨은 형광 현미경 검사로 조직병리학 표본에서 이식된 줄기 세포를 직접 묘사하는 데에도 사용할 수 있습니다. 세포 라벨링을 수행할 때 형광 조영제로 줄기세포를 라벨링하는 방법을 보여드렸습니다.

모든 단계를 표준화해야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 당사는 다양한 실험의 결과를 비교할 수 있도록 일관된 라벨링 효율성과 세포 생존율을 보장하기 위해 이를 수행합니다. 그게 다야.

시청해 주셔서 감사드리며 세포 라벨링에 행운을 빕니다.