광학 이미징과 비침습 감지를위한 형광 염료와 함께 줄기 세포를 라벨링

Hiku Alge Blink 박사님의 연구실에 오신 것을 환영합니다. 이 프로젝트에 연구비를 지원해 주신 캘리포니아 재생의학 연구소(California Institute of Regenerative Medicine)에 감사드립니다. 줄기세포를 형광 조영제로 표지하면 이식된 줄기세포를 생체 내에서 추적할 수 있습니다.

표지된 줄기세포의 후속 광학 이미징을 통해 세포의 in vivo 이동을 비침습적으로 모니터링할 수 있는 종단적 연구가 가능해집니다. 이 영상에서는 형광 염료를 사용하여 인간 배아 줄기세포와 인간 중간엽 줄기세포를 모두 표지하는 방법을 보여드리겠습니다. 안녕하세요, 저는 샌프란시스코 캘리포니아 대학교 방사선학과 조영제 연구 그룹의 Sophie Boddington입니다.

오늘은 형광 조영제를 사용하여 줄기세포를 표지하는 두 가지 서로 다른 기술을 보여드리고자 합니다. 하나는 형광 염료인 DID를 사용하여 중간엽 줄기세포를 표지하는 방법이고, 다른 하나는 endign ingra를 사용하여 인간 배아 줄기세포를 표지하는 방법입니다. 먼저 DID를 이용한 인간 중간엽 줄기세포 표지 기술부터 보여드리겠습니다.

중간엽 줄기세포 표지 절차를 시작하기 위해, 먼저 세포를 분석하고 수를 세어 정해진 수의 세포가 포함된 현탁액을 준비해야 합니다. 이는 표준 조직 배양 기술이므로 상세히 설명하지는 않겠습니다. 표지할 세포를 무혈청 배양 배지에서 1 million cells/mL 밀도로 현탁하고자 합니다.

먼저, 세포 현탁액 1mL당 5µL의 DID 대비제를 첨가합니다. 이제 파이펫팅을 통해 용액을 부드럽게 혼합합니다. 세포는 37°C의 6-웰 저부착 디쉬에서 라벨링 용액과 함께 20분 동안 배양합니다. 간단한 배양이 완료되면, 세포 용액을 15mL 원심분리 튜브로 옮겨야 합니다.

400 RCF에서 5분 동안 원심분리합니다. 다음으로, 펠렛이 손상되지 않도록 주의하며 라벨링 배지를 흡입하여 제거합니다. 이제 PBS로 세포를 세척합니다.

피펫팅을 통해 세포 펠렛(cell palette)이 완전히 풀리도록 세포를 위아래로 섞어줍니다. 마지막 두 단계를 두 번 더 반복하여 총 세 번의 세척 과정을 수행합니다.

이제 세포 수를 측정하고 트립판 블루(trypan blue) 테스트를 수행하여 세포 생존율을 결정합니다. 세포 생존율을 확인한 후, 세포를 광학 이미저(optical imager)로 촬영할 준비가 완료됩니다. 인간 배아 줄기세포의 라벨링 절차를 시작하기 위해, 먼저 인도시아닌 그린(Indocyanine Green)으로 알려진 조영제를 준비해야 합니다.

그 다음, 프로타민(protamine)으로 알려진 transfection agent와 혼합합니다. 우선, indocyanine green 분말 1 mg을 측정하여 100 µL의 DMSO에 녹입니다. 이 혼합물에 10% FCS가 포함된 DMEM 400 µL를 첨가하고 잘 흔들어 섞어주면, indocyanine green의 최종 농도는 2 mg/mL가 됩니다.

다음으로, 조영제가 세포 내로 더 효율적으로 진입할 수 있도록 셔틀 역할을 하는 형질전환제인 프로타민(protamine)을 첨가합니다. 10 mg/mL 농도의 프로타민 황산염(protamine sulfate) 5 µL를 ICG 300 µL 및 무혈청 DMEM 300 µL와 혼합합니다. 이제 복합체가 형성될 수 있도록 새로운 형질전환 용액을 5분 동안 흔들어 섞어줍니다.

다음으로, 기존 배지를 흡입하여 제거하고 10 milliliters의 예열된 DMEM을 세포에 첨가합니다. 앞서 준비한 프로타민 ICG 용액을 세포에 첨가하고, 디쉬를 37 °C 인큐베이터에 넣어 1시간 동안 배양을 시작합니다. 배양이 완료되면, 디쉬를 인큐베이터에서 꺼내어 라벨링 용액을 흡입하여 제거하고, 디쉬를 5 milliliters의 PBS로 헹구어 세포를 세척합니다.

그 다음 세포를 37°C에서 5분 동안 트립신 처리합니다. 배양 접시를 흔들어주면 세포가 현탁액 상태로 떨어지는 데 도움이 됩니다. 이제 피펫으로 천천히 흡입과 분출을 반복하여 남아 있는 세포 군집을 분리합니다.

디쉬에 10% FCS가 포함된 DMEM을 동일한 양으로 첨가하여 트립신을 중화합니다. 다음으로, 세포 현탁액을 15 milliliter 튜브로 옮기고 400 RCF에서 5분 동안 원심분리합니다. 이후 세포를 완전 배지에 재부유시킵니다.

이제 세포를 40 µm 셀 스트레이너(cell strainer)에 통과시켜 남아있는 덩어리나 복합체를 제거할 수 있습니다. 덩어리가 없는 세포 용액이 준비되면, 기존 배지를 흡입하여 제거하고 펠렛을 미리 가온된 인간 배아줄기세포 완전 배지에 재현탁합니다. 이 단계에서 마우스 피더 세포(feeder cells)를 인간 배아줄기세포로부터 분리해야 합니다.

이는 나중에 줄기세포만을 이미징하기 위함입니다. 이를 위해 세포 용액을 젤라틴이 코팅된 10 cm 페트리 접시에 옮깁니다. 접시를 37 °C 인큐베이터에 넣고 45분 동안 둡니다.

이 시간 동안 디쉬를 건드리지 않도록 주의하십시오. 이제 피더 세포는 디쉬에 부착되지만 줄기세포는 부착되지 않습니다. 페트리 디쉬에서 용액을 옮기면, 이제 라벨링된 인간 배아 줄기세포 단일 세포 용액이 준비됩니다.

이제 세포 수를 측정하고 trypan blue 테스트를 수행할 수 있습니다. 생존력을 확인한 후, 세포를 이미지화할 준비가 완료됩니다. 슬라이드는 줄기세포에 형광 조영제를 표지하여 IP 주입으로 투여한 후, 마우스의 체내(in vivo)에서 어떻게 시각화할 수 있는지에 대한 예를 보여줍니다.

연속 광학 영상 스캔 결과, 세포가 초기에 폐에 축적되었다가 이후 간, 사지 골수 및 갑상선으로 재분포되는 것이 나타났습니다. 형광 표지는 형광 현미경을 이용해 조직 병리 표본 내의 이식된 줄기세포를 직접 묘사하는 데에도 사용될 수 있습니다. 지금까지 세포 표지 수행 시 형광 조영제로 줄기세포를 표지하는 방법을 살펴보았습니다.

모든 단계를 표준화하는 것이 중요합니다. 이는 일관된 라벨링 효율과 세포 생존율을 보장하여 서로 다른 실험 결과들을 비교할 수 있도록 하기 위함입니다. 이상입니다.

시청해 주셔서 감사드리며, 세포 표지 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.