Name: 멀티 컬러 형광 기자 마우스를 사용하여 각막 세포의 리니지 추적하는 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: 학습하세요 R26R-Confetti 마우스를 이용한 다색 형광 계보 추적법으로 각막 상피 줄기세포의 이동과 생존을 관찰하는 방법입니다. 이 기술은 재생의학 연구에 활용됩니다.

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RSF는 이스라엘 과학재단(218/14)뿐만 아니라 보조금 계약 n° 618432 – MC—Epi-Patho-Stem에 따라 유럽 연합의 - 제7차 프레임워크 프로그램(FP7/2007-2013])으로부터 자금을 지원받았습니다.

윤리 성명 :이 연구의 동물 관리 및 사용에 안과 및 비전 연구에서 동물의 사용에 대한 ARVO 문을 본했다. 모든 실험은 로컬 윤리위원회에 의해 승인되었다. 마우스의 변형을 표현하는 적합한 Cre 호텔 - 재조합 효소를 선택하십시오 <ol><li> 조사하는 구매 (26)와 대상 조직에 따라 사용할 수 Cre 호텔의 형질 전환 라인의 큰 다양성의 부족, Cre 호텔 재조합 효소 유전자가 관심의 조직에 특이 프로모터에 의해 제어되는 Cre 호텔 형질 전환 마우스 변형을 선택합니다. 경우 시간적 제어가 필요한에서, 유도 Cre 호텔 라인을 선택합니다. 참고 : 우리는 특별히 윤부 각막 상피 줄기 / 전구 세포 (24)에 라벨을 붙이기 위해 타목시펜 유도 K14-Cre 호텔 ERT의 유전자를 선택했다. 디 지 롤라 모 동료가 자신의 K1에 대한 각막 식으로 윤부 특이성을보고, 균주 사이에 차이가있을 수 있습니다4-Cre 호텔 ERT (22). Cre 호텔 유도 트랜스 제닉 마우스를 사용하는 장점은 다목적 타임 프레임에서 추적 혈통의 유도를 허용한다는 것이다. </li></ol> 2. 적절한 브롬 마우스 스트레인을 선택 <ol><li> 연구 문제 및 사용 가능한 Cre 호텔 라인 16,18,20에 따라 적절한 브롬 카세트를 선택합니다. <ol><li> 비 - 유도 Cre 호텔 마우스 균주를 사용하는 경우, 연속적인 DNA 반전 / 절개를 허용하고, 따라서 (16) (실시 예 Br1.0 또는 Br1.1 용) 데드 엔드 제품을 초래하지 않는 브롬 카세트를 선택한다. </li></ol></li></ol> 3. 관심의 유전자 변형 라인 크로스 <ol><li> 여기에 표시된 프로토콜의 경우, hemizygous 새끼 쥐를 얻기 위해 동형 접합 Cre 호텔 ERT 변형 (Cre 호텔 ERT / Cre 호텔 ERT)와 동형 접합 R26R - 색종이 변형 (Br2.1 / Br2.1)를 건너 (Br2.1 / +; Cre 호텔 / +) 모노 대립 유전자 모두가 하나의 Br2.1 대립 유전자를 포함하기 때문에 추적 혈통과 준비가 그단일 Cre 호텔 대립 유전자. 참고 : 한 개의 Cre 호텔 대립 (Br2.1 / +; Cre 호텔 / Cre 호텔)가 포함 된 마우스를 생성 할 수있는 표지의 효율성을 높이기 위해 두 동안 Br2.1 대립 유전자 (Br2.1 / Br2.1; Cre 호텔 / +) 것 (22에서 설명하는대로) 색상 조합을 증가시킨다. </li></ol> 4. Cre 호텔 - 재조합 효소 유도 주 :이 실험에서 타목시펜 투여는 윤부 각막 기저의 K14 양성 줄기 / 선조의 핵으로 Cre 호텔 ERT 재조합 효소의 전좌를 유도하기 위하여 3-4 일 동안 매일 복강 내 주사에 의해 행했다 상피 세포. 다음 프로토콜은 네 개의 마우스의 주입에 사용될 수있다. 또한, 안구 표면에 타목시펜의 국소 적용은 높은 효율을 얻을 수 있습니다. 타목시펜 용액 일주일까지 4 ℃에서 어둠 속에서 유지 될 수있다. 사용하기 전에 솔루션을 따뜻하게. <ol><li> 타목시펜 100 mg의 무게와 옥수수 기름 5 ㎖로에서 용해20 ㎎ / ㎖ 타목시펜 솔루션을 형성한다. </li><li> 복강 3 ~ 4 일 연속 8 주 된 쥐에 타목시펜 (4 mg)을 용액 200 μl를 주입한다. 주 : 타목시펜 용액 1 주일까지 4 ℃에서 어둠 속에서 유지 될 수있다. 사용하기 전에 솔루션을 따뜻하게. </li><li> 국소 적용 : 타목시펜 60 mg의 무게가 60 ㎎ / ㎖ 타목시펜 용액을 형성 옥수수 유 1 ㎖에 용해. 와류 65 유지 진탕 수욕 용액을 설정할 ° C가 사용 때까지 목욕 명확한 휴가를 될 때까지. <ol><li> 조심스럽게 마우스의 각 안구 표면에 타목시펜의 용액 100 μl를 적용합니다. </li></ol></li></ol> 이미징 5. 조직 준비 <ol><li> 이소 플루 란을 이용하여 희생 동물 타목시펜 주입 및 COL 다음 적절한 시점에서 CO 2 흡입 마취 하였다 (반사의 부족에 의해 적절한 마취 확인) (2 % 산소에서 기화)관련 조직을 [선택]. <ol><li> 이 실험을 위해, 다음의 시점에서의 눈을 명백히하다 : 1, 4, 8, 12, 16 주 후에 타목시펜 주입. 곡선 집게를 사용하여 안구 적출술을 얻을 수 있습니다. 안구가 눈 소켓에서 튀어 원인 눈꺼풀을 누릅니다. 시신경을 들고 안구 뒤 집게를 놓습니다. 조심스럽게 안구를 당겨을 분리합니다. 주의 : 아래에 설명한 바와 같이이 단계에서, 표지화 된 세포가 조직의 wholemount 분석을 위해 제조 될 수있다. 일반 냉동 조직 절편은 PFA로 고정하고 후술하는 바와 같이 (제 6 및 22 참조)를 묘화, 제조 할 수있다. </li></ol></li><li> PBS로 가득 60mm 접시에 각각의 눈을 놓습니다. </li><li> 입체 현미경을 사용하여 집게가 아래로 향하게 각막 시신경 근처 눈을 길게 시신경, 근육 및 결합 조직을 제거하고 눈의 후방 부에 작은 절개를하기 위하여 메스를 사용한다. </li><li> 봄 가위를 사용하여 조심스럽게 확대렌즈가 튀어과 집게를 사용하여 조리개를 제거시키는 잘라. </li><li> 메스를 사용하여 둘레 방향 중심부터 반경 4-5 절개함으로써 각막을 평탄화. </li><li> 윤부 이상 초과 주변 조직을 잘라 메스를 사용합니다. </li><li> 다음 간단히 PBS로 씻어, 10 분 동안 PFA 4 %의 각막을 고정합니다. </li><li> 10 분 동안 DAPI와 샘플을 품어 간단히 PBS로 씻는다. </li><li> 상피면이 위를 향하게하여 유리 슬라이드에 마운트 각막. 커버 유리와 각막과 커버의 상단에 미디어를 장착 한 방울을 놓습니다. 슬라이드 RT에서 O / N을 건조 시키십시오. 4 ° C에서 슬라이드를 유지합니다. </li></ol> 6. 공 초점 현미경 및 이미지 분석 <ol><li> YFP / GFP / CFP 배출의 분리를 가능하게하는 스펙트럼 공 촛점 시스템을 사용합니다. 세트 형광 여기 및 브롬 카세트의 형광 단백질에 따라 발광 파장. 크로스 최소화를 목표로 각 단백질에 대한 최적의 여기 파장을 선택할자극. 다른 단백질로부터의 신호의 누설을 최소화하기 위해 좁은 출사 범위를 선택한다. <ol><li> Br2.1 카세트를 들어,이 시작점으로 형광 여기 (예) 및 배출 (EM)의 설정 다음을 사용 : - CFP 전 405 nm의 / EM 420-480 nm의 - DAPI 전 458 nm의 / EM 470-500 나노, GFP - 전 488 nm의 / EM 497-508 nm의, YFP - 전 514 nm의 / EM 529-540 nm의, 및 RFP - 전 561 nm의 / EM은 575-615 nm의. </li></ol></li><li> 고해상도 대형 조직 영역을 시각화하기 위해서, 타일 화상을 취득. 즉,도 2A-B, 12 × 12 화상 이미지의 어레이를 획득하여 전체 각막에 도시 된 결과를, 각 필드에 위치한 4 형광 채널을 이용하여 필드 (144) (512 X 512)를 취득. 전부 576 이미지를 수집 한 후 병합합니다. </li><li> 다른 깊이와 조직의 구조에 태그 세포의 현지화를 탐색하려면, 관심의 다른 지역의 Z - 스택 이미지를 수집. 주문 T에서O 이미지 각막의 전체 깊이는, 3 μm의 간격으로 8 광학 섹션을 획득. 최대 세기에 기초하여 예측 화상뿐만 아니라 수집 섹션 직교 뷰는 종래 이미징 소프트웨어 (24)를 사용하여 구성 될 수있다. </li></ol> 타목시펜 유도 7. 각막 손상 결합 <ol><li> 이소 플루 란과 마우스 (산소에서 기화 2 %)를 마취하고 관리 진통제 (10 ㎎ / ㎏ Carpofen는 피하 주사). 발가락 핀치에 응답하지 않는하여 적절한 마취를 확인합니다. </li><li> 타목시펜 분말 1g을 달아 200 ㎎ / ㎖ 농도의 용액을 제조하기 위해 무균 DMSO 5ml에 그것을 녹인다. </li><li> 이 맑은 용액이 될 때까지 수조에서 65 ° C로 타목시펜 용액을 가온. 사용할 때까지 목욕 솔루션을 유지합니다. </li><li> 마취 중 탈수를 방지하기 위해 처리되지 않은 반대편 눈에 눈 연고를 적용합니다. 충분한 사기꾼을 회복했다 무인 때까지 동물을 방치하지 마십시오흉골 드러 누움을 유지하기 위해 대한 의식. 완전히 회복 될 때까지 다른 생쥐의 회사에 상처 눈을 시행 한 쥐를 반환하지 않습니다. 마우스가 밀접하게 부상 다음 모니터링해야한다. 그들의 체중의 10 % 이상을 상실하는 경우에, 각막 미란, 또는 불편 고통, 실험이 중단되어야한다. 반복 진통제 투여 전체 실험을하는 동안 매 24 시간. </li><li> 첨부 바늘없이 멸균 주사기를 사용하는 단계; 국소 각 마우스의 한쪽 눈의 전체 각막 표면에 200 μL 타목시펜 솔루션을 적용 할 수 있습니다. 주 : 액체 용액을 RT에서 안구 표면에 빠르게 고화. 각막 손상의 효과는 상처의 중증도에 따라 다르다. 타목시펜 / DMSO 용액 1 도포 후 부작용은 마우스에서 관찰되지 않는다. 반복되는 응용 프로그램의 경우 각막 혼탁이 관찰 될 수있다. </li><li> 종파 참조 (조직 준비 및 이미징 계속이온 (5)와 관련된 시점에서 6). 일주일 후 상처 (그림 2, 24) (단계 5.1에서 설명하는대로) 여기에 표시된 결과는 쥐를 희생. </li></ol>

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리니지 추적 실험은 수년 동안 진행되어왔다. 최근의 기술 향상과 색종이 마우스 균주의 출현은 연구에 새로운 길을 열었다. 오늘은, 연구자들은 상업적으로 이용 가능한 조직 특이 Cre 호텔 라인, 녹아웃 마우스 및 형질 전환 마우스의 많은 혜택을 누릴 수 있습니다. 이것은 견고하고 신뢰할 수있는 데이터를 제공하는 동시에, 연습 힘드는 회피 기본적인 전문 과학적 질문 어드레싱 다목적 실험 시스템을 설계하기위한 기회를 제공한다. R26R - 색종이 마우스는 효율적인 추적 및 살아있는 유기체 세포의 성격과 행동을 연구하기위한 우아한 도구입니다. 시스템 구축이 용이하며, 배아 발생 동안 단일 세포의 비 침습적 혈통 추적을 허용 줄기 세포 재생을 항상성하에, 또는 상해, 염증 및 암과 같은 상이한 상황. 얻을 수있는 데이터는 강력한 Descript를 제공정량 방식으로 대상 세포 클론 세포의 확장과 세포 이동의 생존의 이온. 중요한 단계는 확실하게 정확한 발달 단계에서 효율적인 조직 특정 표시를 허용 할 수 있습니다 적절한 유전 마우스 변형을 선택하는 것입니다. 이 시스템의 한 가지 제한은 생체 모니터링, 조직에 접근하고 투명해야한다는 것이다. 마찬가지로, 살아있는 동물 내에서 조직의 두께를 추적은 두 광자 또는 다중 광자 현미경에 의해 촉진 될 수있다. 그러나, 세포 추적은 사후 조직 섹션에 가능하며이 선명도 방법 (32, 33)에 의해 투명하게하기 위해 변환 된 후 아마도 손상 조직을 연구 할 수있다. 고려해야 할 또 다른 한계는 동일한 형광을 발현 인접 셀 가능성 동일한 클론 계보에 속할지라도, 그들은 임의로 동일한 형광성 유전자를 발현 독립적 인 기원 세포로부터 유도 될 수 있다는 것도 가능하다는 것이다. 이 possibili다수의 색상 조합을 허용하는 다수의 브롬 대립 유전자를 사용하는 경우가 매우 어려울 TY된다. 앞으로 유전자와 건강과 병리학에서의 돌연변이 연구를 허용합니다 가능한 유전 적 도구 (즉, 녹아웃, 올림피아 및 형질 전환 마우스 모델)와 색종이 시스템을 결합. 마찬가지로, 혈통 세포 운명 결정에 신호 전달 경로의 참여에 새로운 통찰력을 가져올 것이다 다른 시스템 섭동 (즉, 세포 틈새 파괴, 레이저 매개 세포 제거, 약물 치료, 줄기)에서 추적. 궁극적으로, 형광 및 생물 발광 라벨의 조합 사용은 가장자리 현미경을 신호 경로 및 절단의 유전 기자 연구자에게 그들의 자신의 네이티브 환경에서 주변에 대응하는 방법을 하나의 세포를 배울 수있는 강력한 시스템을 제공 할 것입니다.

배아 발생 동안, 조직 및 기관의 형태 형성은 세포 증식, 세포 이동 및 계통 1-4 명세서의 관점에서 기술 될 수 정확한 프로그램을 통해 일어난다. 이러한 생물학적 과정은 세포 재생 줄기 필요 성인 조직의 항상성을 유지에 참여하고 있습니다. 리니지 추적, 식별 및 세포 집단의 특정 유형의 자손의 추적, 배아를 연구하고 세포의 항상성을 막기위한 중요한 도구를 제공합니다. 실제로, 더욱 연구의 많은 분야에서 사용되고있다. 특히, 혈통 추적은 항상성과 암 발달에 기원과 줄기 세포의 운명을 식별에 필수적인 도구가되었다. 이 세포 분리에 체외 배양 또는 transplantati에 대조적으로, 최소한의 실험적인 개입은 그대로 세포 조직 또는 유기체의 컨텍스트에서 동작하는 방법에 대한 중요한 정보를 제공 할 수 있기 때문이다그에 원치 않는 편견의 원인이 될 수 있습니다. 전통적으로, 세포의 세포막에 통합 같은 지용성 카보시 등의 염료, 리니지 추적을 위해 사용되었다. 이런 종류의 실험을 성공적으로 발생 생물학 5,6- 주요 발견과 모양 독창적 개념을 주도하고 있지만, 그들은 타겟 세포의 특이성을 제어하기 어려운, 셀 동작에 염료의 원치 않는 영향 희석을 포함한 몇 가지 제한을 가지고 시간이 지남에 따라 라벨. 염기 아날로그 표시 방식은 아마도 줄기 세포 7,8은 대기에 해당 &quot;레이블 유지 셀&quot;천천히 자전거의 존재를 문서화 사용할 수 있습니다. 이 방법은 제한된 기간 동안 증식 느린 동역학에 기초한 순환 세포의 존재를 입증 할 수있는 동안 그러나 줄기 세포의 기능과 관련된 실질적인 통찰력을 제공 할 수 없었다. 최적의 혈통 추적 메타odology는 현저한 세포, 그 자손, 또는 이웃의 표시 특성에 미치는 영향을 최소화한다. 또한,이 단계 및 시간 의존적 방식으로뿐만 아니라 단일 세포 (클론) 방식에 대한 관심이 세포 집단을 태그 할 수있는 능력을 갖도록, 즉, 라벨 유도에 제어를 갖는 것이 유익 할 것이다. 레이블이 시간 유지하고, 인접하는 셀에 전사되지 해 지도록 설립자 셀의 모든 자손에게 전달되어 안정하고 비가역적인 표식 방법은 중요하다. 최근에, 세포의 표지 유전자 접근법이 개발되었다. 이러한 시스템에서, 세포 특이 적 프로모터는 녹색 형광 단백질 또는 Β 갈 락토시다 제 리포터 유전자 9-13 같이 리포터 유전자의 발현은 loxP-측면 장애물을 제거하고 허용하기 위해 Cre 호텔 재조합 발현을 유발하는데 사용될 수있다. 이 방법뿐만 아니라 세포 및 그 자손의 추적을 가능하게하지만, 또한 세포가 허용olation 및 분자 특성. 단일 세포 수준에서의 셀 추적은 단일 형광성 리포터 유전자의 발현 유도에 의해 가능하게되었다. 본 시스템의 하나의 중요한 한계는 세포의 매우 낮은 백분율이 각각의 클론을 분리하고 추적 할 수있다 표지 만 사실이다. 여러 가지 빛깔의 기자가 사용할 수있는 이러한 한계를 극복합니다. 다색 표시를 사용하는 경우, 동일한 틈새에서 인접 셀의 차동 운명의 트래킹을 효율적으로 14-17을 달성 할 수있다. 최근 Brainbow (BR) 대립 유전자의 다양한 Cre 호텔 / LOX 체계를 이용하여 다수의 형광 리포터 유전자의 발현을 활성화 스토캐스틱 리니지 추적 실험을 위해 개발되었다. Cre 호텔 / LOX 시스템은 인식하고 그러한에 loxP 사이트와 같은 특정 DNA 서열에 결합 Cre 호텔 재조합 효소로 구성되어 있습니다. 다음은 Cre 호텔 재조합 효소의 결합은, 사이트 특이 적 재조합이 발생,에 loxP의 제거 측면 시퀀스 resultin 일으키는다른 형광 단백질 발현의 임의의 g (기구에 대하여 설명한다). 브롬 라인의 다양한 (리뷰 16,18,19 참조)를 사용할 수 있습니다. 브롬 균주 사이의 주요 차이점은 2 (BR 2.0), 3 (Br1.0)에서 4 (Br1.1, Br2.1) 형광 유전자에 이르기까지, 카세트에 포함 된 형광 유전자의 수 (I)의 차이를 포함 (ⅱ) 왕복 배향 LOX 사이트의 존재는 사용되는 LOX 사이트 (III) 타입, (ⅳ) 식 또는 형광 유전자 발현의 침묵 전에 Cre 호텔 활성화에, 유전자 반전 (Br2.0-2.1)을 허용한다. 최근에 설립 Br3 등의 트리 뉴런의 여러 가지 빛깔의 이미징을위한 개선 된 방법을 제공합니다. 이 전사의 주요 특징 중 하나는 최상의 신경의 염색에도 20 처리를 가능 광 안정성 farnesylated 형광 단백질의 새로운 세트를 포함한다는 것이다. 중요한 것은, 브롬 카세트의 다른 버전 Thy1 홍보 신경 특정을 포함 할 수있다omoter 또는 재하는 CAG (CMV) 프로모터를 표명했다. 브롬 트랜스 제닉 마우스 중 일부는 단일 브롬 형질 전환 유전자를 함유 할 수있는 동안 마지막으로, 다른하여 각 셀에서 발현되는 색상의 조합 가능성의 엄청난 수의 생산을 허용하는, 다중 트랜스 유전자 카피로 구성 될 수있다 (예 16 참조). 우리의 연구에서, 우리는 브롬 2.1 카세트 (21)를 포함하는 R26R - 색종이 마우스를 사용했다. Br2.1는 고유 Cre 호텔 - 중재 DNA 반전 때문에에 loxP 사이트 (그림 1)의 역수 방향뿐만 아니라 절개를 할 수 있도록 설계되었습니다. 따라서, 색 변화로 이어질 이러한 반전 / 절단 이벤트는 한 Cre 호텔 16 존재로 계속 사용할 수 있습니다. 이러한 이유로, 유도 시간 Cre 호텔 발현 시스템은 안정적인 셀 추적 Br2.1을 사용을 위해 필수적이다. 도면에 도시 된 바와 같이. 1, Br2.1는에 loxP-측면 네오 R의 -casse 다음 유비쿼터스 CAG 프로모터를 포함전사 장애물 역할을 TTE는, 그 두 탠덤에 위치 노란색, 녹색, 4 형광 리포터 유전자, 인코딩 (GFP), (YFP), 적색 (RFP) 및 시안 (CFP) 형광 단백질,옵니다. 형광은 Cre 호텔 활성화 이전에 표시되지 않습니다. Cre 호텔 재조합 효소의 유도는 특정 세포에 4 형광 단백질 중 하나의 임의의 표현을 가능 R 네오 카세트의 제거를 야기한다. 두 번째 세그먼트에 loxP-측면 RFP와 반전 CFP을 포함하는 동안 첫 번째 세그먼트는,에 loxP-측면 GFP 및 반전 YFP가 포함되어 있습니다. 이러한 DNA 세그먼트는 연속 한 Cre 호텔 재조합 효소가 존재하는 바와 같이, (반대 방향 인에 loxP 사용) 반전, 또는 절제 될 수있다. 따라서, 과도하고 제어 Cre 호텔의 형질 전환 유전자를 사용해야합니다. YFP의 발현 및 RFP는 세포질이며, GFP는 핵이고 CFP는 세포막에 결합된다 Br2.1 카세트 위치 신호에 중첩 배출 구별하는 우수한 시스템을 제공한다. GFP및 RFP 배출량은 쉽게 기존의 형광 현미경으로 분리된다. YFP / GFP / CFP 배출을 분리하기 위해, 스펙트럼 공 초점 영상 시스템이 필요하다. 전부, Br2.1 카세트는 각 대상 셀에 1 ~ 4 중 별개의 형광 유전자의 무작위 유도하고, 조직 특이 적 발현을 할 수 있습니다. 컬러 조합의 더 큰 수 필요할 때 실제로, 하나 따라서 각 셀의 2 색 태그 식 및 (10)에 가능한 색 조합의 수를 높여 결과적 Br2.1 2 대립 유전자를 포함하는 동형 접합체 생쥐를 생성 할 수있다 카세트의 여러 복사본들이 유전체 (16)에 통합 된 이후 22. 브롬 마우스 균주의 일부는 가능한 색 조합의 더 큰 수의 표현을 가능하게한다. 그러나, 대부분의 경우, 하나의 대립 유전자 Br2.1 의해 제공된 네 가지 색상의 조합은 충분하다. 여기에 제공된 프로토콜에 따라, 하나는 spectr의 비교적 간단한 설치 프로그램을 사용하여이 방법을 설정할 수 있습니다교정 조금있는 경우 필요에 알 현미경. 여기에서 우리는 각막 상피​​의 혈통 추적 실험을 위해, 하나의 Br2.1 대립 유전자를 포함하는 R26R - 색종이 마우스의 사용에 대한 적응 프로토콜을 제공합니다. 이 트랜스 제닉 마우스 균주 결장 21,23 각막 상피 줄기 세포 (22, 24)의 원점과 거동을 연구에 사용 된, 및 국소 분절 사구체에서 신장 발 세포를 특성화 장암 25 줄기 세포 활성의 존재 (FSGS) 17.

<table><tbody><tr>Brainbow 2.1 카세트 <td>Jackson</td><td>균주 #013731</td><td></td>K14-CreERT 마우스 Jackson 균주 #005107 tamoxifen Sigma T5648 isoflurane USP Terrell Piramal Critical Care<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> Carprieve 30 b.wt에 대한 R26R-Confetti 형질전환 마우스 동형접합 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td>는 <td>4&#160의 농도에서 사용됩니다. &마이크로; g/ml</td></tr><tr><td>Immu Mount</td><td>Thermo Scientific</td><td>9990402</td><td></td></tr><tr><td>LSM 510 전동 스테이지가 장착된 도립 전동 현미경(Axiovert 200M)에 연결된 Meta 레이저 스캐닝 컨포칼 시스템</td><td>Zeiss</td><td></td><td>GFP, YFP 및 CFG 간의 스펙트럼 중첩은 형광 단백질의 방출 스펙트럼을 분리할 수 있는 스펙트럼 이미징의 사용을 필요로 합니다. 여기서는 Zeiss LSM 510 Meta 스펙트럼 컨포칼 현미경을 사용합니다. 이 시스템에 포함된 Meta 검출기에는 각각 10나노미터 파장대에서 방출을 수집하는 32개의 검출기 요소가 있습니다. "스펙트럼 핑거프린팅(spectral fingerprinting)"이라고 하는 이 기술을 통해 사용자는 파장대 필터링에 대한 가장 적절한 한계를 설정할 수 있습니다. Leica SP5(ref #21), SP8, Zeiss LSM 780(ref #22)을 포함하여 사용할 수 있는 다양한 스펙트럼 컨포칼 시스템이 있습니다.</td></tr><tr><td>Zen 2009 이미징 소프트웨어</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Duratears-eye ointment</td><td>Alcon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

멀티 컬러 형광 기자 마우스를 사용하여 각막 세포의 리니지 추적하는 방법

A Method for Lineage Tracing of Corneal Cells Using Multi-color Fluorescent Reporter Mice

혈통 추적 실험은 특정 조직이나 유기체에 있는 세포의 기원, 운명 및 행동을 정의합니다. 이 기술은 수십 년 동안 성공적으로 적용되어 발생 생물학에서 중요한 발견을 밝혔습니다. 보다 최근에는 줄기세포 생물학자들이 최소한의 실험적 개입으로 다양한 줄기세포 집단을 식별하고 추적하기 위해 이 방법을 채택했습니다. 최근 마우스 유전학의 발전, 많은 수의 마우스 균주의 가용성 및 형광 현미경 검사의 발전으로 인해 상업적으로 이용 가능한 도구를 사용하여 기본 전문 지식으로 다양한 조직에 대한 강력한 계통 추적 시스템을 간단하게 설계할 수 있습니다. 우리는 최근 R26R-Confetti 마우스를 사용하여 안구 표면에서 줄기 세포의 기원과 운명을 탐구하기 위해 이 강력한 방법론을 활용했습니다. 이 모델은 4개의 형광 유전자를 무작위로 발현할 수 있는 다색 유전 시스템을 제공합니다. 여기에서는 이 방법론의 원리를 설명하고 계통 추적 실험을 설계하기 위한 적응 가능한 프로토콜을 제공합니다. 특히 각막 상피와 다른 조직을 위해.

최근에는 줄기 세포 및 각막 상피 (24)의 전구 세포의 기원, 생존 및 이주를 식별 목적. 증거를 축적하면 각막 상피​​는 각막 윤부 틈새 시장, 각막 주변에 링 모양의 지역에 독점적으로있는 줄기 세포가 재생되는 교리를 지원합니다. 이 이론은 시험 관내 및 생체 내 데이타에 의해, 그리고 성공적인 선구 윤부 줄기 세포 요법 27-29위한 기초를 제공 임상 증거에 의해지지된다. 그러나,이 주제는 매우 인해 마우스 윤부 각막 갱신 (30)에 참여하지 않는 것이 좋습니다 윤부 이식 실험을 기반으로 연구에 최근 몇 년 동안 논쟁 남아 있었다. 이 흥미로운 가설을 테스트하기 위해, R26R - 색종이 마우스를 실시했다 사용 혈통 추적 실험은 최대 120 일 (24)에 대한 정상 상태 조건에서 윤부 각막 상피 줄기 / 전구 세포의 운명을 따르십시오.눈을 적출하고 평탄한 장착 각막 10 120 일 타목시펜 주입을 게시 스펙트럼 공 초점 레이저 주사 현미경으로 형광 분석 하였다. 예상대로 각막 중심을 향해 윤부에서 연장 1-4개월 이상 (그림 2B, 24), 긴 줄무늬가 천천히 개발하면서, 형광 세포의 작은 산발적 클러스터는 10 일 주사 후 안구 표면에 걸쳐 관찰되었다. 이 결과는 각막은 각막의 중심을 향해 윤부 세포에서 마이그레이션에 의해 재생되는 것을 시사한다. 다음에, 부상 상태에서 각막 재생을 조사 하였다. 효율적인 세포 추적을 유도하면서 조건 하에서 부상 K14 양성 윤부 / 각막 세포의 운명을 시험하기 위해, 우리는 국소 적용시 각막 손상을 야기 디메틸 술폭 시드에 타목시펜 (DMSO)에 용해. 하나의 국소 적용 (그림 2C에게), 미주리 적용된 경우이 방법으로 우리는 가벼운 상처를 유도하기 위해 관리<html> 추가 DMSO 단독 치료가 타목시펜 유도 또는 DMSO 혼자 국소 타목시펜 유도 이전에 2 연속 일에 적용되었다 심한 상처 전날에 적용된 경우 부상 레이팅. 천천히 개발되고 정상 상태 조건 하에서 4개월 내의 각막 중심에 도달 얇은 줄무늬 윤부 달리 손상 후 세포의 이동이 빨랐다. 놀랍게도, 길고 두꺼운 각막 윤부 줄무늬는 이미 7 일 이내에 이러한 조건에서 개발되었다. 흥미롭게도, 색상의 다양성은 종종 최소 (도 2D)이었다. 우리의 손에, 때때로, 주로 적혈구 특정 형광 편중 될 수 색상의 다양성을 나타내는, 전체 각막에 확인되었다. Br1.0L 31 및 21 Br2.1 이전에보고 된이 불필요한 바이어스 용량 반응 시험에 의해 교정 될 수있다. 레 / ftp_upload / 53370 / 53370fig1.jpg &quot;/&gt; R26R - 색종이 구조 그림 1. 도식입니다. (A) R26R - 색종이 구조가 높은 발현 수준에 대한 CAG 프로모터를 포함에 loxP (검은 색 삼각형)는 네오 R의 -roadblock 및 Rosa26의 궤적 16,21에서 Brainbow2.1 카세트를 -flanked. Brainbow2.1 카세트는 두 개의 머리 - 꼬리에 loxP-측면 이량 체를 포함한다. 한 이량 체는 핵 지역화 된 녹색 형광 단백질 (GFP)과 역 중심의 세포질 노란색 형광 단백질 (- PFY 반전 방향이 지정되어 YFP)로 구성되어 있습니다. 16 - 두 번째 이량 체는 세포질 RFP 및 역 중심의 막 닿는 시안 형광 단백질 (PFC 반전 방향이 지정되어 CFP 등)이 포함되어 있습니다. (B - E) Cre 호텔 - 재조합 효소 활성화되면, 다른 절제와 반전 이벤트가 발생할 수 있습니다; 가능한 결과는 exemplifi 있습니다B의 ED - E. Cre 호텔 활동 따라서 유전자 제거 및 / 또는 역전 4 개의 형광 단백질 중 하나의 랜덤 식의 결과로 이어지는 카세트의 확률 재 배열을 유도한다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53370/53370fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53370/53370fig2.jpg" /> 그림 2. 항상성 및 부상에서 추적 각막 혈통. R26R-색종이 / 프로토콜에 자세히 K14-Cre 호텔 마우스는 4 mg의 타목시펜 주사 하였다. (A - B) 지점을 게시 지정된 시간에 유도는 각막이 몇 군데 있었다 평평. Cre 호텔 유도 결합 각막 상처가 DMSO에 용해 타목시펜의 국소 적용에 의해 달성되었다 (C - D). 모자이크 화상을 얻을스펙트럼 공 초점 현미경을 타일링 멀티 채널으로 표시됩니다 (- D). 항상성, 슬로우 마이그레이션 세포의 방사상 각막 윤부 줄무늬 윤부 각막 중심 사이의 확장. 이 줄무늬 4-5 개월 (B) 내에서 각막 중심에 도달, 천천히 개발했다. 각막 세포의 클러스터뿐만 아니라 (흰색 화살표, B) 분명했다. 반면에, 큰 윤부 줄무늬가 상처를 입는 조건 (C)에서 하나의 주일 이내에 나타났다. 적혈구 (D)으로 컬러 다양성의 바이어스에 대한 예. 윤부 - 각막 테두리 점선으로 주석된다. 스케일 바는 500 μm의입니다. 요약 : CFP, 시안 형광 단백질; GFP, 녹색 형광 단백질; RFP, 적색 형광 단백질; YFP, 노란색 형광 단백질. 이 수치가 24에서 수정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53370/53370fig2large.jpg" target="_blank">더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오</a>이 그림.

이 기사에서는 R26R-Confetti 마우스를 사용하여 다중 색상 계통 추적 실험을 설계하고 수행하는 원칙을 설명합니다. 당사는 다른 관심 조직에 대해 변형될 수 있는 각막 상피 세포를 추적하기 위한 특정 프로토콜을 제공합니다.

Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied ...

이 방법의 전반적인 목표는 각막 상피 내 줄기세포와 전구세포의 이동, 확장 및 생존을 찾아내고 추적하는 것입니다. 이 방법은 항상성, 조직 재생, 노화 및 병리학과 관련된 각막 상피 세포 생물학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 구축이 용이하며, 세포의 가계 추적을 클론 방식으로 비침습적으로 수행할 수 있다는 점입니다.먼저, 각막 가장자리와 각막 상피 전구세포 및 줄기세포를 표지하기 위해 유도성 조직 특이적 프로모터가 포함된 Cree 형질전환 마우스 계통을 선택합니다. 여기서는 Tamoxifen 유도성 K 14 Cree ERT 라인을 사용합니다. 다음으로, 연구 질문과 사용 가능한 Cree 라인에 따라 적절한 brainbow 카세트를 선택합니다.본 사례에서는 Brainbow 2.1 라인이 사용됩니다. homozygous R 26 R confetti 계통과 homozygous K 14 Cree ERT 계통을 교배하여 4색의 K 14 양성 세포를 가진 마우스를 생성합니다. 형질전환 마우스에서 재조합을 유도하기 위해, 먼저 Tamoxifen 80 milligrams를 정밀하게 측정하여 1 milliliter의 corn oil에 넣고 Vortexing하여 용해시킵니다.용액을 65°C로 유지되는 진탕 수조에 넣고 완전히 용해될 때까지 둔 다음, 다음 마취 시 사용할 때까지 수조에 보관하십시오. 8주령의 Brainbow 2.1 Cre ERT 이형접합체 마우스를 준비하고, 발가락 꼬집기(toe pinch)로 마취 깊이를 주의 깊게 확인한 후 각 안구 표면에 타모キシ펜(Tamoxifen) 용액 100 µL를 도포하십시오. 타모キシ펜을 직접 도포하면 Cre 유도 효율이 높아집니다. 남은 타모キシ펜 용액은 빛을 차단하여 4°C에서 최대 1주일 동안 보관하십시오.용액을 도포하기 전에 가온하며, 이 과정은 각 마우스에 대해 3일 연속으로 반복합니다. 먼저 1 g의 Tamoxifen 분말을 5 mL의 멸균 dimethyl sulfoxide에 녹입니다. 200 mg/mL 용액을 제조하기 위해 용액을 65 °C로 유지되는 진탕 수조에 넣고, 용액이 투명해질 때까지 기다린 후 사용 시까지 수조에 보관합니다.그 후 마우스를 마취하고 발가락 꼬집기(toe pinch)를 통해 마취 깊이를 확인한 다음, 처치하지 않는 쪽 눈에 안연고를 도포하여 시술 중 건조를 방지하고 적절한 진통제를 투여합니다. 다음으로, 바늘이 없는 주사기에 Tamoxifen 용액 200 µL를 취해 각막 전체에 국소적으로 도포합니다. 해당 액체는 상온에서 조직 위에 응고됩니다.마우스가 복와위 자세를 유지할 때까지 관찰하고, 완전히 의식을 회복한 후에만 다른 마우스들과 함께 둡니다. 유도 후 적절한 시점에 마우스를 희생시킨 다음, 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 안구 손상을 유도합니다. 먼저 눈꺼풀을 눌러 안구가 소켓에서 튀어나오게 하여 안구를 적출합니다.곡선 핀셋을 안구 뒤쪽으로 밀어 넣어 시신경을 잡고, 안구를 위로 당겨 분리합니다. 각 안구를 PBS가 담긴 60mm 배양 접시에 넣습니다. 안구가 담긴 플레이트를 외과용 실체 현미경 아래에 배치합니다.눈의 기본 구조인 각막, 각막연 및 시신경을 확인하십시오. 눈 주변의 시신경, 근육 및 결합 조직을 제거합니다. 각막이 아래를 향하도록 눈의 후측부를 잡고, 스프링 가위를 사용하여 안구 뒤쪽의 공막에 절개창을 냅니다.렌즈가 튀어 나올 수 있도록 절개 부위를 넓히고 포셉을 사용하여 홍채를 제거합니다. 다음으로, 중심부에서 주변부 방향으로 4~5회의 방사형 절개를 가해 각막을 평평하게 만든 후, 얇고 평평한 스패튤라로 남은 홍채 부분을 제거합니다. 마지막으로, 각막을 고정하기 위해 각막연 주변의 과잉 주변 조직을 절단합니다.분리한 조직을 12웰 플레이트로 옮기고 4% 파라포름알데히드(formaldehyde)에서 10분 동안 배양합니다. 그 후, 세포핵을 염색하기 위해 조직을 PBS로 짧게 세척합니다. 각막을 2 µg/mL의 DPI 용액에서 10분 동안 배양한 후, PBS로 짧게 세척합니다.다음으로, 각막의 상피 쪽이 위로 향하게 하여 유리 슬라이드 위에 놓습니다. 그 후 각막 위에 마운팅 용액 한 방울을 떨어뜨리고 커버슬립으로 덮습니다. 슬라이드를 실온에서 하룻밤 동안 건조시킨 후 4 °C에서 보관하십시오.각막 이미징을 위해 R-F-P-Y-F-P-G-F-P 및 CFP 방출광을 분리할 수 있는 스펙트럼 공초점 시스템을 사용하십시오. 먼저 뇌의 형광 단백질에 따라 형광, 들뜸 및 방출 파장을 설정하십시오. Bo 카세트를 사용하여 들뜸의 교차 발생이나 방출 신호의 중첩이 일어나지 않도록 주의하십시오.다음으로, 각막 전체를 고해상도로 시각화하기 위해 타일형 이미지를 획득합니다. 여기서는 4개의 모든 형광 채널에서 12 by 12 이미지 배열을 얻습니다. 마지막으로, 이미지들을 병합하여 합성 계통도를 생성합니다.limbal 및 corneal epithelial progenitor 세포의 운명을 추적하기 위해 R 26 R confetti 마우스를 이용한 추적 실험을 수행하였습니다. 정상 상태 조건에서는 예상대로 유도 10일 후에 작은 형광 세포 군집이 관찰되었습니다. 4개월 후에는 limbus에서 각막 중심부까지 이어지는 줄무늬가 발달하였으며, 이는 각막 손상 후 세포가 limbus에서 이동하여 각막을 재생시킨다는 것을 시사합니다.각막 주변부로부터의 이동은 빠르게 일어났으며, 7일 이내에 길고 두꺼운 주변부 줄무늬가 형성되었습니다. 이 모델은 다양한 상황에서 각막 줄기세포 및 전구세포를 추적하고 연구하는 데 매우 유용합니다. 이를 통해 향후 정상 상태뿐만 아니라 상처, 화학적 화상 돌연변이 등과 같은 스트레스 조건 하에서의 클론 세포 확장, 생존 및 이동에 대한 조사가 가능해질 것입니다.이 모델은 정상 및 병적 각막 재생의 기저에 있는 분자적 메커니즘을 분석하는 데에도 사용될 수 있습니다. 이 기술은 각막 이영양증, 화상, 각막 외상과 같은 다양한 병적 상태에 대한 이해를 높이는 데 기여할 수 있으며, 각막 재생, 세포 증식 및 이동에 미치는 다양한 치료법의 영향을 평가하는 데에도 활용될 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

여기에서 우리는 필요한 도구를...

생체 마우스 Neuroepithelium에서 단일 세포 분열의 라이브 영상

출처: Laboissonniere, et. al입니다. 망막 신경절 세포의 정의된 부분 집합의 단일 세포 RNA-seq. J. Vis. Exp. (2017).   이 비디오는 형질전환 마우스 망막에서 망막 신경절 세포(RGC) 아형을 식별하는 형광 추적 기술을 보여줍니다. 이 프로세스에는 기록 챔버에 분리된 망막을 고정하고, 산소 관류로 세포 생존력을 유지하고, 추적자가 있는 피펫을 사용하여 형광 표지된 망막 신경절 세포를 표적으로 하는 것이 포함됩니다. 이 방법은 수지상 형태 및 성층화를 분석함으로써 별개의 망막 신경절 세포 아형을 분류할 수 있습니다.

Identification of Mouse Retinal Ganglion cell subtypes via fluorescent tracing (형광 추적을 통한 마우스 망막 신경절 세포 아형의 식별)

두개 안면 뼈의 세포 조직은 긴 가설하지만 직접 시각화 적이있다. 멀티 스펙트럼 셀 라벨 및 생체 라이브에서   영상은 제브라 피쉬 아래턱에 동적 셀 동작을 시각화 할 수 있습니다. 여기, 우리 세부 프로토콜은 Zebrabow에게 유전자 변형 물고기를 조작하고 직접 세포 인터 및 멕켈의 연골에서 연골 세포의 형태 학적 변화를 관찰한다.

배아 멕켈의 연골에 Zebrabow 클론 세포 분석을 통해 연골 세포 인터와 방향 확산의 시각화

여기서는 서로 다른 마우스 조직 내에서 IL-22 생성 세포를 시각화하기 위한 형질전환 리포터 마우스 모델을 설명합니다. 이 방법은 마우스에서 다른 사이토카인 또는 비서 단백질의 위치를 추적하는 데 사용할 수 있습니다.

기자 마우스를 사용하여 IL-22 발현 림프구의 시각화

여기서 우리는 두 가지 색상으로 일반 전구 세포에서 파생 된 신경 세포의 시각화를 허용하는 모자이크 라벨 기술에 대한 프로토콜을 제시한다. 이것은 다른 사람의 동일한 뉴런에서 출생 데이트 개별 뉴런의 기능과 공부 유전자 기능과 신경 계통 분석을 용이하게한다.

쌍둥이 자리 MARCM를 사용하여 세포 계보 분석 및 유전자 기능 연구

이 방법은 R26R-Confetti (Confetti) 마우스 모델을 사용하여 광물화된 조직을 연구하고 번식 전략에서 이미지 획득에 이르는 모든 단계를 포괄하는 방법을 설명합니다. 모든 연조직에 적용될 수 있는 일반적인 프로토콜과 광물화된 조직에 적용될 수 있는 변형된 프로토콜이 포함된다.

광물화된 조직을 연구하기 위해 색종이 마우스를 사용한 클로날 유전자 추적

여기에 제시 라이브 마우스 안구 표면 이미징을위한 다광 현미경 플랫폼입니다. 형광 형질 전환 마우스는 안구 표면 내의 세포 핵, 세포 막, 신경 섬유 및 모세 혈관의 시각화를 가능하게합니다. 콜라주 구조에서 파생된 비선형 제2 고조파 생성 신호는 기질 아키텍처에 대한 라벨없는 이미징을 제공합니다.

마우스 각막과 결막의 라이브 이미징을 위한 맞춤형 다광현미경 플랫폼

이중 마커(MADM)를 이용한 모자이크 분석을 이용하여 단일 세포 수준에서 후보 유전자의 계보 추적 및 기능성 유전자 분석을 수행하는 프로토콜이 제시된다. MADM 클로날 분석은 개별 전조자와 그들의 딸 세포의 증식 행동, 세포 출력 및 혈통 관계를 측정하는 정량적인 틀을 제공합니다.

이중 마커를 이용한 모자이크 분석을 이용한 대뇌 피질 개발의 계보 추적 및 클론 분석(MADM)

유도성 트랜스제닉 계보 추적 마우스 라인을 사용하여 줄기 세포 및 그의 자손을 형광단으로 영구적으로 표시하는 능력은 생체내에서 활성화, 증식, 이동 및/또는 분화의 공간적 및 시간적 분석을 가능하게 한다. 계보 추적은 혈통 헌신, 개입에 대한 반응 및 다능성에 대한 새로운 정보를 나타낼 수 있습니다.

성인 마우스 뇌에서 유도성 형광 표지 줄기 세포의 계보 추적

여기서는 각막을 자극하는 감각 섬유를 손상시키는 세 가지 방법을 제안합니다. 이러한 방법은 생쥐의 축삭 재생에 대한 연구를 용이하게 합니다. 다른 동물 모델에 적용할 수 있는 이 세 가지 방법은 각막 신경 분포 생리학 및 재생 연구에 이상적입니다.

쥐 각막의 신경 영양성 각막염 및 신경 재생을 유도하는 세 가지 전략

학습하세요 R26R-Confetti 마우스를 이용한 다색 형광 계보 추적법으로 각막 상피 줄기세포의 이동과 생존을 관찰하는 방법입니다. 이 기술은 재생의학 연구에 활용됩니다.

멀티 컬러 형광 기자 마우스를 사용하여 각막 세포의 리니지 추적하는 방법

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