멀티 컬러 형광 기자 마우스를 사용하여 각막 세포의 리니지 추적하는 방법

이 방법의 전반적인 목표는 각막 상피에서 줄기세포와 전구 세포의 이동, 확장 및 생존을 찾고 추적하는 것입니다. 이 방법은 항상성, 조직 복구, 노화 및 병리학에 관한 각막 상피 세포 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 확립이 쉽고 클론 방식으로 세포의 비침습적 계통 추적이 가능하다는 것입니다.

먼저 유도성 조직 특이적 프로모터가 있는 Cree 형질전환 마우스 균주를 선택하여 윤부 및 각막 상피 전구 세포와 줄기 세포를 라벨링합니다. Tamoxifen Inducible K 14 Cree ERT 라인이 사용됩니다. 다음으로, 연구 질문과 사용 가능한 Cree 라인에 따라 적절한 brainbow 카세트를 선택하십시오.

이 경우 Brainbow 2.1 라인이 사용됩니다. 동형접합 R 26 R 색종이 종이 종주를 동형접합 K 14 Cree ERT 균주와 교차시켜 4개의 색상 K 14 양성 세포를 갖는 마우스를 생성하여 형질전환 마우스에서 재조합을 유도합니다. 먼저 80mg의 타목시펜의 무게를 측정하고 Vortexing에 의해 1밀리리터의 옥수수 기름에 용해시킵니다.

용액을 완전히 녹을 때까지 섭씨 65도로 유지되는 흔들리는 수조에 넣고 다음에 마취할 때까지 수조에 그대로 두십시오. 8 주 된 Brainbow 2.1 크리어 ERT 이형 접합 마우스, 발가락 핀치로 마취의 깊이를 확인하고 조심스럽게 마우스의 각 안구 표면에 Tamoxifen 용액 100 마이크로 리터를 적용합니다. Tamoxifen의 직접적인 신청은 크리어 감응작용의 고능률을 열매를 산출합니다, 상점, 4 섭씨 온도에 빛에서 보호된 어떤 잔여 Tamoxifen 해결책든지, 1주일까지 주일 동안

적용하기 전에 용액을 따뜻하게 하고 각 마우스에 대해 3일 연속으로 반복합니다. 먼저 1g의 Tamoxifen 분말을 5 밀리리터의 멸균 디메틸 설폭 사이드에 녹입니다. 밀리리터당 200밀리그램의 용액을 생산하려면 용액을 흔들리는 수조에 넣고 투명해질 때까지 섭씨 65도를 유지한 다음 사용할 때까지 수조에 그대로 두십시오.

그런 다음 마우스를 마취하고 발가락 꼬집음을 사용하여 마취 깊이를 확인하고, 치료되지 않은 마우스의 눈에 안연고를 바르고 절차 중 탈수로부터 보호하고 적절한 진통제를 투여합니다. 다음으로, 바늘을 꽂지 않은 주사기에 200마이크로리터의 타목시펜 용액을 뽑아 눈의 각막 전체에 국소적으로 바릅니다. 액체는 실온에서 조직에서 응고됩니다.

쥐가 흉골 누운 상태를 유지할 때까지 주의를 기울이고 완전히 의식이 있을 때만 다른 사람들과 함께 돌려줍니다. 유도 후 적절한 시점에 마우스를 희생시킨 후, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 눈에 부상을 입었습니다. 먼저 눈꺼풀을 눌러 안구를 소켓에서 빼내어 눈에 핵을 생성합니다.

구부러진 집게를 안구 뒤로 밀어 시신경을 잡고 안구를 위로 당겨 분리합니다. PBS가 들어 있는 60mm 접시에 각 안구를 놓습니다. 안구 함유 플레이트를 수술용 실체 현미경 아래에 놓습니다.

눈, 각막, 윤부 및 시신경의 기본 구조를 인식해야 합니다. 눈 주위의 시신경, 근육 및 결합 조직을 제거합니다. 각막이 아래를 향하도록 뒤쪽 부분을 잡고 안구 뒤쪽의 공막을 스프링 가위로 절개합니다.

렌즈가 튀어나오도록 컷을 확대하고 집게로 홍채를 제거합니다. 다음으로, 각막을 중앙에서 주변부로 절개하여 4-5개의 방사상 절개를 한 다음 얇고 평평한 주걱으로 홍채의 나머지 부분을 제거합니다. 마지막으로, 각막을 고정하기 위해 윤부를 둘러싼 여분의 주변 조직을 잘라냅니다.

절개된 조직을 12웰 접시에 옮기고 포름알데히드 4%파라에서 10분 동안 배양합니다. 그런 다음 PBS에서 조직을 잠시 씻어 세포핵을 염색합니다. DPI 용액 밀리리터당 2마이크로그램에 각막을 10분 동안 배양한 다음 PBS에서 간단히 세척합니다.

다음으로, 상피 쪽이 위를 향하도록 유리 슬라이드에 각막을 놓습니다. 그런 다음 각막 위에 장착 매체 한 방울을 놓고 커버 슬립으로 덮습니다. 슬라이드를 실온에서 밤새 건조시키고 섭씨 4도에서 보관하십시오.

각막 영상의 경우 R-F-P-Y-F-P-G-F-P 및 CFP 방출을 분리할 수 있는 스펙트럼 컨포칼 시스템을 사용합니다. 먼저 뇌의 형광 단백질에 따라 형광, 여기, 방출 파장을 설정합니다. Bo cassette, 방출 신호의 교차 여기 또는 중복을 방지하기 위해 주의합니다.

다음으로, 타일 이미지를 획득하여 전체 각막을 고해상도로 시각화합니다. 여기에서 4개의 형광 채널 모두에서 12 x 12 이미지의 배열을 얻습니다. 마지막으로 이미지를 병합하여 복합 계보를 만듭니다.

R26 R 색종이 마우스를 사용한 추적 실험은 윤부 및 각막 상피 전구 세포의 운명을 추적하기 위해 수행되었습니다. 정상 상태 조건하에서, 형광 세포의 작은 클러스터는 예상대로 유도 10일 후에 관찰되었습니다. 4개월 후, 각막 가장자리에서 각막 중앙까지 줄무늬가 생겼는데, 이는 세포가 각막 손상 후 각막을 재생하기 위해 가장자리에서 이동하는 것을 시사합니다.

엿봄 가장자리로부터의 이동은 7일 이내에 길고 두꺼운 엎데기 줄무늬가 발달하면서 빠르게 일어났다. 이 모델은 다양한 상황에서 각막 줄기 및 전구 세포를 추적하고 연구하는 데 유용합니다. 이를 통해 미래에 상처, 화학적 화상 돌연변이 등과 같은 안정적인 상태와 스트레스 조건 하에서 클론 세포 확장, 생존 및 이동을 조사

이 모델은 정상 및 병리학적 각막 재생의 기저에 있는 분자 메커니즘을 해부하는 데에도 사용할 수 있습니다. 이 기술은 각막 이영양증, 화상 및 각막 외상과 같은 다양한 병리학적 상태에 대한 이해에 기여할 수 있으며, 각막 재생, 세포 확장 및 이동에 대한 다양한 치료의 영향을 평가하는 데 기여할 수 있습니다.