Name: 분석 생체 셀 마이그레이션 Zebrafish의 배아에서 세포 이식 및 시간 경과 이미징을 사용하여 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: 배우세요 제브라피쉬 배아에서 세포 이식 및 실시간 이미징을 활용한 생체 내 세포 이동 분석 방법입니다. 이 기법은 모자이크 배아를 생성하여 유전자 기능을 연구하는 데 활용됩니다.

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우리는 F. Bouallague 와 IBENS 동물 시설에 훌륭한 제브라피시 보살핌에 감사드립니다. 이 간행물에 보고된 연구는 Fondation ARC pour la recherche sur le cancer, 보조금 N° SFI20111203770 및 N° PJA 20131200143의 지원을 받았습니다.

참고도 1은이 프로토콜의 개요를 제시한다. 사출 및 이식의 바늘 1. 준비 주 : 바늘 언제든지 준비되고 저장 될 수있다. 모델링 점토의 밴드에, 페트리 접시에 보관하십시오. 먼지로부터 보호하기 위해 파라 필름으로 접시를 밀봉합니다. <ol><li> 주사 바늘의 경우, 마이크로 피펫 풀러와 (재료의 목록 참조) (필라멘트 (재료의 목록 참조)하지 않고, 직경 0.58 mm 내부 직경 1.0 mm 외부) 유리 모세관을 당기십시오. 그들은 융모막을 관통 더 효율적으로 짧고가는 바늘 (약 5mm의 테이퍼 부분)을 선호한다. 주 : 주사 바늘은 일회용이다. </li><li> 세포 이식을위한 바늘 <ol><li> 마이크로 피펫 풀러와 (필라멘트 (재료의 목록 참조)하지 않고, 직경 0.78 mm 내부 직경 1.0 mm 외부) 유리 모세관을 당겨. </li><li> 유내부 직경 (셀 직경보다 약간 더 이식 함)이 35㎛이고 시점에서 바늘의 선단을 절단하는 microforge (재료의 목록 참조) 노래. </li><li> 경사 45 °의 각도와 microgrinder (재료의 목록 참조)와 모세관의 절단 사지. </li><li> 선택적으로, microforge를 사용하여 바늘 끝에 미늘을 당긴다. 이를 위해, 베벨의 팁 뜨거운 필라멘트을 터치하고 빠르게 배아를 관통 도움을 줄 수있는 미늘을 만들어, 그것을 멀리 당기십시오. </li><li> 주사기에 부착 된 바늘 홀더에 바늘을 탑재합니다. 주사기를 사용하여, 유리 잔류 물을 제거하고, 아세톤으로 3 회 씻어 2 % 불산 바늘 세번의 내부를 헹군다. 주의 : 불산은 독성이, 장갑, 후드 조작 할 수 있습니다. 주 : 세포 이식 바늘을 여러 번 사용될 수있다. </li></ol></li></ol> 의 2. 준비사출 및 세포 이식 용 식기 <ol><li> 열 전체 전력에서 1 분 동안 전자 레인지에 아가로 오스 0.5 g을 포함 11 매체 배아의 50 ml의 배아 매체에 1 % 아가로 오스를 얻을 수 있습니다. 약 60 ° C의 아가 로스 겔 쿨하고 90mm 페트리 접시에서 50 ㎖를 붓는다. 특별히 고안된 금형 (물질의 목록 참조), 중 사출 요리 라인 또는 세포 이식의 요리 우물과 겔의 표면에 놓습니다. <ol><li> 아가로 오스가 너무 뜨겁지 않은 경우, 아가로 오스의 금형 플로트를 관찰한다. 아가로 오스 겔을 설정 한 후, 집게와 금형 (- B 그림 2A)를 제거합니다. 참고 : 요리는 몇 주까지 4 ° C에 저장할 수 있습니다. 건조를 방지하기 위해 밀폐 된 습식 상자에 보관하십시오. </li></ol></li><li> 사용하기 전에 28 ° C 배양기 30 분에서 접시를 놓습니다. </li></ol> 태아 및 사출 3. 컬렉션 <ol><li> 사출 솔루션 준비 참고 : 액틴 결합 도메인mCherry 결합 등 Lifeact 같은 단백질 140 (ABP-140)를 결합 효모 액틴의 돌출 활성을 분석하기 위하여, 세포 내에서 중합 액틴을 시각화하기 위해 사용된다 (ABP140-mCherry을 함). 후보 유전자 (지배 부정 또는 구조적으로 활성 구조의 예를 들어 mRNA의, 또는 모르 폴리 노 올리고 뉴클레오티드)의 기능을 테스트하기 위해 다른 화합물을 추가합니다. (도 3), 우리는 모르 폴리 노 올리고 뉴클레오티드를 사용한 결과에 기재된 Sin1의 기능을 평가한다. 대조군으로서, 우리는 sin1의 모르 폴리 노에 있지만 제어 모르 대상 RNA 일치하지 않도록 순서를 따라 분포 5 뉴클레오티드 동일 모르 폴리 노를 사용 하였다. <ol><li> 해동 sin1 및 5 불일치 제어 morpholinos (2 MM의 재고 솔루션), 얼음에 ABP140-mCherry의 mRNA. 의 mRNA의 375 NG (75 NG / 최종 μL) 및 sin1 또는 5 불일치 제어 모르 폴리 노 중 하나의 0.75 μL (0.3 mM의 최종) Danieau 버퍼 (58 mM의 염화나트륨, 0.7 밀리미터에 추가의 KCl, 0.4 mm의 (NO 3) 2, 5.0 mM의 HEPES pH를 7.6), 5 ㎕의 총 부피에 도달하는, 0.6 mM의 칼슘을 황산 4. </li></ol></li><li> 배아 컬렉션 참고 :이 실험은 설정 모두 기증자와 호스트 배아는 유전자 변형이며, 장래 prechordal 플레이트 (11)를 시각화하기 위해 상기 goosecoid (GSC)의 제어 발기인에서 GFP를 표현. <ol><li> (: GFP GSC) 계란의 Tg를 수집합니다. 배아 매체 가득 90mm 페트리 접시에 약 80 알을 놓고 28 ° C에서 품어. </li></ol></li><li> 기증자의 배아를 주입 <ol><li> 실체 현미경에서 부드럽게 배아 매체 가득 사출 접시의 라인에 집게로 수집 된 배아를 짠다. 집게를 사용하여, 상부를 향해 세포 배아를 배향. 배아는 4 셀 단계 (1 시간 게시물 수정)에 도달 할 때까지 28 ° C에서 인큐베이터에 주입 접시를 놓습니다. </li><li> 2 μL와 주사 바늘을로드주입 솔루션입니다. 공기 transjector에 (물질의 목록 참조) 마이크로 매니퓰레이터에 넣고 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 (PTFE) 튜브 (재료의 목록 참조)에 연결된 바늘 홀더 (물질의 목록 참조)에 바늘을 삽입 (재료의 목록을 보려면 ). </li><li> 부드럽게 미세 집게로 끝을 터치하여 모세 혈관을 엽니 다. 필요한 경우, 그 말단을 곤란에 의해 열린 모세관을 잘라. </li><li> 바늘로 4 개의 셀 중 하나를 입력하고, 셀 체적 (2 NL)의 70 %를 채우기 위해 셀 내의 용액을 주입. 30 배아를 주입한다. 주 : 원형질막 소프트와 같이 셀의 바늘을 얻기 어려울 수있다. 셀과 노른자 사이의 접합을 목표로하는 것은 바늘 침투를 용이하게한다. </li><li> 그들은 구 단계 (4 시간 후 수정)에 도달 할 때까지 28 ° C 배양기에서 배아를 놓습니다. </li></ol></li></ol> 셀 Transplantat의 배아 4. 준비이온 <ol><li> 200 μL 페니실린 / 스트렙토 마이신 (물질의 목록 참조) (펜 / 연쇄상 구균 EM)와 배아 매체의 20 ㎖를 준비합니다. </li><li> 구 단계에서 배아의 Dechorionation (4 시간 후 수정) 참고 : Dechorionated 배아 매우 깨지기하고 공기 또는 플라스틱과 접촉시 폭발 할 것입니다. 따라서 그들은 아가 코팅 접시에 넣고, 화재 연마 유리 파스퇴르 피펫으로 전달 될 필요가있다. <ol><li> 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 배아 매체에 1 % 아가 로스 코팅과 펜 / 연쇄상 구균 EM 가득이 35mm 배양 접시에 단계 3.3에서 주입 단계 3.2에서 수집 호스트 배아 기증자의 배아를 전송합니다. 두 개의 요리 호스트 배아 기증자의 배아를 유지합니다. </li><li> 수동으로 미세 핀셋 (물질의 목록 참조)과의 chorions에서 배아를 추출합니다. </li><li> 그들은 방패 단계 (6 시간 게시물 수정)에 도달 할 때까지 28 ° C를 인큐베이터에서 배아를 놓습니다. </li></ol></li></ol>5. 세포 이식 <ol><li> 세포 이식을위한 배아를 정렬합니다. <ol><li> 형광 실체 현미경에서 선택 기증자의 배아는 실드 (녹색) 내에서 ABP140-mCherry (적색)을 표현. </li><li> 화재 연마 파스퇴르 피펫을 사용하여, 펜 / 연쇄상 구균 EM 가득 세포 이식 접시의 우물에서 배아를 전송합니다. 이웃 행 한 행의 호스트 배아 및 기증자의 배아를 놓습니다. </li><li> 속눈썹을 사용하여 조심스럽게 방패 위로 배아의 방향. 주 : 실드의 위치는 GFP 발현에 의해 평가 또는 해부학 적으로 될 수있다. </li></ol></li><li> 이식 시스템 설정입니다. 참고 : 이식 시스템은 마이크로 드라이브가 장착 된 해밀턴 주사기 (물질의 목록 참조) PTFE 튜브 (재료의 목록 참조) 및 튜브 커넥터 (재료의 목록 참조)에 연결된 바늘 홀더로 구성되어있다 (목록 참조 재료). 바늘 홀더3 방향 미세 조작기에 장착된다 (재료의 목록 참조). <ol><li> 주사기에 부착 된 바늘 홀더를 사용하여, 70 % 에탄올로 세포 이식 바늘을 헹군다. 바늘로 공기를 흡입하여 건조. 이 먼지는 바늘의 테이퍼 부분에 갇히지 될 수 있으므로, 불어 건조하지 마십시오. </li><li> 위쪽으로 베벨과, 해밀턴 주사기에 연결된 바늘 홀더에 바늘을 삽입합니다. </li></ol></li><li> 방패에 방패 세포 이식 <ol><li> 이식 바늘로 기증자 배아의 방패를 입력하고 ABP140-mCherry 표지에 대한 10 ~ 20 세포를 그립니다. 조심스럽게 노른자 그리기 마십시오. </li><li> 호스트 배아 실드에 세포를 이식. 모든 호스트 배아가 이식 될 때까지 반복합니다. </li><li> 화재 연마 파스퇴르 피펫으로 손상된 배아를 제거합니다. 28 ° C에서 인큐베이터에 이식 된 배아를 배치하고 약 30 분 동안 복구 할 수 있습니다. </li><li> 바늘을 사용하여주사기에 부착 된 홀더, 물을 세포 이식 바늘을 씻어 모델링 점토의 밴드에 페트리 접시에 다시 배치합니다. 파라 필름으로 접시를 밀봉합니다. </li></ol></li></ol> 6. (선택 사항) 단일 세포 이식 참고 : 이식 바늘 하나의 셀을 그리기 어려워되도록 배아 세포는 서로 부착. 우리는 쉽게 하나의 prechordal 판 전구 세포를 이식하는 수정 된 프로토콜을 개발했다. 아이디어는 이전에 이식에 세포를 떼어 놓다하는 것입니다. 격리 판 prechordal 전구 세포들의 신원을 잃는 경향이 있기 때문에, 우리는 유전 Sox32 전사 인자의 부재하에, 절점 신호 전달 경로를 활성화하여, 장래 prechordal 판 신원을 부과. 우리는이 유도 된 세포가 내인성 prechordal 판 전구 세포 (8)처럼 행동 것을 확인했습니다. 아래는 하나의 세포 이식을 수행 할 수있는 특정 단계가있다. 셀 dissocia기 칼슘 프리 링거 11 배아 배치 체외 이식편 해부 기계적으로 교반함으로써 달성된다. <ol><li> 2.1 단계에서 대신 배아 중간의 칼슘 무료 벨소리 1 % 아가로 오스와 이식 요리를 준비합니다. </li><li> 3.1 단계에서, ABP140-mCherry RNA와 sin1 모르 폴리 노 이외에, 2에서 3 (최종 0.6 NG / μL) 마디 수용체 Taram-A의 활성 형태를 코딩하는 RNA를의 NG 및 sox32에 대한 모르 폴리 노의 1.25 μL (원액을 추가 밀리미터, 따라​​서 0.5 mM의 최종). </li><li> 4 단계, 전송 화재 연마 파스퇴르 피펫을 사용하여 펜 / 패 혈성 칼슘 무료 벨소리로 가득 세포 이식에 대한 접시에 세 가지 선택 기증자의 배아 후. 미세 핀셋, 주입 된 세포 (ABP140-mCherry 표지화 된 세포)를 함유하는 이식편 해부. 빠르게 배아의 나머지 부분을 폐기합니다. </li><li> 세포가 해리까지 속눈썹으로 부드럽게 이식편을 저어. </li><li> 이식 바늘에 하나의 고립 된 셀을 그립니다및 호스트 배아 실드로 이식. </li><li> 화재 연마 파스퇴르 피펫을 사용하여, 펜 / 연쇄상 구균 EM 가득 아가로 오스 - 코팅 접시에 배아를 전송합니다. 30 분 동안 28 ° C에서 인큐베이터에서 배아를 놓습니다. </li></ol> 설치 7. 배아 <ol><li> 영상 상공 회의소 <ol><li> 방법 1 : 한쪽 3mm 높은 가장자리 4 홀 (5.5 mm 직경), (그림 2C - D)을 관통 플라스틱 슬라이드 (75 * 25 * 0.5 mm)로 구성된 영상 실을 사용합니다. 시아 노 아크릴 레이트 접착제 (슈퍼 접착제)과 뒷면 유리 커버 슬립을 붙인다. 참고 실험의 마지막에, 커버 슬립을 제거하고 모래 종이 접착제 잔기 없애 하룻밤 동안 물에 챔버를 배치했다. </li><li> 방법 2 : 10mm 구멍 35mm 매텍 유리 바닥 요리 (재료의 목록을 참조)를 사용합니다. </li></ol></li><li> 배아 실장 <ol><li> 배아 매체의 뜨거운 0.2 % 아가로 오스 1 ml의 유리 병을 채 웁니다.열 블록에 42 ° C에서 보관하십시오. </li><li> 형광 실체 현미경에서 빨간색 이식 된 세포가 녹색으로 표시된 예상 prechordal 판 (즉, 빨간색 이식 된 세포가 녹색 미래의 prechordal 판에서, 그리고 동물 극으로 이주 시작)의 일부있는 배아를 선택합니다. </li><li> 화재 연마 파스퇴르 피펫 아가로 오스 솔루션으로 선택된 배아를 전송합니다. 피펫으로부터 배아 매체의 과잉 버린다. 아가로 피펫 배아을 그리고 아가 방울을 증착 촬상 챔버 배아 옮긴다. 아가로 오스가 설정되기 전에, 속눈썹과 배아의 방향. 직립 현미경으로 이미징 위쪽으로 예상 prechordal 플레이트를 배치, 또는 거꾸로 현미경 이미징의 유리 바닥에. 아가로 오스는 챔버의 다음 물론 다른 배아를 설치하기 전에 (실내 온도에 따라 약 1 분) 설정 될 때까지 기다립니다. 참고 : 영상의 차를mber 4 우물을 포함하는 4 배아까지 장착 할 수 있습니다. </li><li> 아가로 설정하면 건조를 피하기 위해 펜 / 스트렙토 EM과 상기 챔버를 채운다. </li></ol></li></ol> 8. 라이브 영상 <ol><li> 40 배의 물에 침수 장거리 렌즈를 사용합니다. GFP에 대한 이미지 GFP 및 mCherry (적절한 필터 세트를 사용하여, 여기 BP 40분의 470, 빔 스플리터 FT (510), 및 배출 BP의 50분의 540 mCherry에 대한 : 여기 BP 21분의 578, 빔 스플리터 FT (596), 및 배출 LP 641 / 75). 상 동성을 최적화하기 위해, 노광 시간을 조정한다. </li><li> 접시에 모든 셀 이미지 (외배엽)에서 예상 prechordal 판 위의 몇 μm의 시작 (노른자)에서 예상 prechordal 판 아래에 몇 μm의 끝, Z-스택을 취득. 2 ㎛의 Z-단계를 사용합니다. 수집 속도를 최적화하기 위해, Z-스택 사이가 아닌 프레임 사이에 색상을 전환 할 수 있습니다. 이 녹색과 빨간색 이미지 사이에 약간의 차이가 발생할 수 있지만 정확한 공동 이후 문제가되지 않습니다 참고 :녹색과 빨간색 신호 사이의 -localization가 필요합니다. 광에 상기 촬상 시간의 노출을 줄이기 위해, 녹색 번만 prechordal 플레이트 전구 세포를 식별하기에 충분한 시간마다 5 포인트를 획득 할 수있다. </li><li> 돌기 주파수와 방향을 분석 할 필요가있는 2 분의 시간 간격 내에서 4 배아, 화상 등의 설정을 사용. 돌기 수명의 분석을 위해, 더 높은 시간 해상도를 얻기 위해 30 초까지의 시간 간격을 감소시킨다. 80 % epiboly에 60 % epiboly에서 이미지. </li></ol> 9. 세포 역학 분석 <ol><li> ImageJ에있는 4D 이미지를로드 참고 : 인수에 사용되는 소프트웨어에 따라, 이미지가 다른 형식으로 저장됩니다 (이미지 당 하나의 파일, Z-스택 당 하나의 파일, 전체 실험에​​ 대한 하나의 파일). 일부 ImageJ에의 플러그인 4D 스택을 열 온라인으로 사용할 수 있습니다. 우리의 데이터는 Z-스택 당 하나의 파일로 저장됩니다. 데이터 셋이 커질 수 있기 때문에, 그것의 일부 (일부 팀을 열 편리 할 수​​있다E 지점 또는 Z - 스택, 또는 8 비트의 서브 파트는) ... 이미지 변환된다. 우리는 우리가 요청에 배포 행복 할 것이다, 그렇게하기 위해 주문 제작 ImageJ에 플러그인을 사용합니다. </li><li> 오리엔테이션의 분석 및 세포 돌기의 주파수 <ol><li> 미래의 prechordal 판 이주의 주요 방향을 결정하기 위해 GFP 이미지를 사용합니다. 세포 돌기 각도 측정을위한 기준으로서 이것을 가지고. 이 기준 방향은 화상의 한쪽면에 평행하도록 스택을 돌린다. </li><li> 하나의 셀을 따르십시오. 선택 각 도구입니다. 각 프레임의 각 돌출부를 들어, 돌출부와 기준 방향 (도 3a) 사이의 각도를 측정하는 각도 도구를 사용한다. (키보드를 누르거나 M) 값을 저장하기 위해 측정 / 분석 명령을 사용하십시오. TXT 파일로 결과를 저장합니다. 다음 셀 반복합니다. </li><li> 히스토그램과 같은 R과 플롯의 각도 분포로 데이터를 가져옵니다. 다른 조건을 비교하기 위해 콜 모고 로프 - 스 미르 노프 테스트 (R에 ks.test)를 사용합니다. 주 : 각 도구 고전 통계적 테스트 원형없는 테스트의 사용을 허용, 0 °와 180 ° 사이에 포함 된 값을 제공한다. </li><li> 이 데이터 세트 분당 셀당 돌기의 수가 발광 주파수를 계산한다. 사용 학생 T-테스트 (R에 t.test는) 다른 조건을 비교합니다. </li></ol></li><li> 셀 돌출부 수명의 분석 <ol><li> 각 셀에 각각 돌출, 측정 돌기 기간 (돌출부 프레임 사이에 X 시간 간격 동안 프레임 수)를 참조하십시오. </li><li> 다른 조건을 비교 R. 사용 학생 T-테스트 (R에 t.test)에 데이터를 가져옵니다. 참고 : 다른 마이그레이션 기능은 세포 이동을 특성화하기 위해 분석하는 흥미로운 일이 될 수 있습니다. 이 속도, 방향과 지속성 측정, 또는 세포 형태에 대한 세포 트랙을 포함한다. 일부 상용 소프트웨어 응용 프로그램은 이러한 기능을 측정 할 수 있지만, 오픈 소스 소프트웨어 어플리 많은 수의예를 들어 morphodynamics (12)를 분석에 적응으로 양이온과 ImageJ에의 플러그인도 사용할 수 있습니다 DiPer 마이그레이션 14시 셀 경계를 추적하는 세포 궤적과 방향 지속성 (13), CellTrack 볼 수 있습니다. </li></ol></li></ol>

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이 프로토콜은 생체 내에서 라이브 영상으로 세포 이식을 사용하여 키메라 배아의 생성을 결합하여 세포 이동의 후보 유전자의 역할을 연구하는 쉬운 방법을 제공합니다. 모자이크 배아의 생성 셀의 역학을 공부하는 것은 세포질 확장을 분석하기 위해 형상의 시각화가 필요합니다. 따라서 좋은 시각적 대비를 제공하고, 환경 - 또는 다르게 표시 - 이것은 그렇지 않으면 레이블이없는에 고립 된 세포를 라벨에 의해 달성 될 수있다. 확률 적 배아에서 세포의 일부를 레이블하는 쉬운 방법은 한 세포 단계 16 plasmidic DNA를 주입하는 것입니다. 주입 된 플라스미드는 무작위 불평등 세포 분열시 세포에서 분리되어 응집체를 형성한다. 이는 세포의 임의의 서브 세트 내의 플라스미드의 발현을 유도하고, 따라서 MO를 생성하는 매우 빠르고 쉽고 비 침습적 방법...

다세포 생물에서, 세포 이동은, 조직 및 기관에 대한 세포의 조직을 보장 배아의 발달과 그 조직의 항상성 (상처 치유) 및 내성에 참여한다 성인기에 대해 모두 필요하다. 이러한 생리 기능에 더하여, 세포 이동은 암 전이를 포함한 특정의 다양한 병리학 적 상황에 참여하고있다. 세포 이동은 평평한 표면에 세포의 움직임을 보장하는 분자 메커니즘의 전반적인 이해를 제공, 수십 년 동안 시험관에서 분석하고있다. 생체 내에서 그러나, 세포는 더 복잡한 환경에 직면하고 있습니다. 명확하게 마이그레이션을 안내 세포 분비 케모카인 이웃, 같은 세포 외 매트릭스 유기체 내에서 마이그레이션이 외부 단서에 의해 영향을받을 수 있다는 것을 지난 몇 년에 등장하고, 그 설명 된 내용과 다를 수 있습니다 세포 이동을 구동 메커니즘 &lt;EM&gt; 체외 1,2. 생체 내 세포의 이동에 보장 메커니즘은 체외 연구에 비해, 주로 인해 증가 된 기술적 인 어려움 때문에 훨씬 적은 관심을 받았다. 생체 특히 세포 이동의 분석 이주 세포에 직접 광 액세스를 필요로 독특한 셀 라벨을 기술 그 동역학 및 형태뿐만 아니라, 이득 또는 기능의 상실을보고하기 위해 후보 유전자의 역할을 테스트하기 위해 접근한다. 지금까지, 이러한 특성을 보유하는 몇 모델 시스템은 생체 내 세포 이동 (3)에 절개하는데 사용되어왔다. 최근 생체 세포의 이동의 제어에 4,5- 후보 유전자의 기능을 평가하기 편리한 새로운 모델 시스템으로 초기 제브라 피쉬 배아 예상 prechordal 플레이트의 이동을 사용 하였다. (또한 전방 mesendoderm라고도 함) 유망 prechordal 플레이트 가스트의 발병에 형성하는 셀 그룹배아의 등쪽면에 rulation. 낭배 동안이 그룹은 공동으로 척색에 prechordal 판, mesendodermal 비후, 전방을 형성하고, 신경 판을 기본에, 배아 6-8의 동물 극으로 이동한다. 그 후방 부분은 가능성이 중배엽 (9) 머리에 기여하면서 prechordal 판의 앞쪽 부분은 부화 선을 야기 할 것이다. 외부 개발 및 어류 배아의 광학 투명도 덕분에, 세포의 이동이 직접적으로 쉽게 구조에서 관찰 될 수있다. 세포 이식은 모자이크 배아 (10)의 신속하고 쉽게 만들 수 있습니다 매우 강력한 기술이다. 분리 된 세포의 라벨에 이식 된 세포 결과에 형광 세포 골격 마커를 표현, 형태 및 역학있는 쉽게 관찰 할 수있다. 손실 함수의 게인이 결합은 허용에게 전지 캔의 자율 기능의 분석 접근didate 유전자. 제시된 프로토콜은 우리가 생체 5 세포 이동 및 굴지 역학을 제어에 TORC2 구성 요소 Sin1의 기능을 평가하는 방법에 대해 설명합니다. 결과를 상기에 언급 된 바와 같이하지만, 이는 생체 내에서 세포의 이동을 제어하는 후보 유전자의 잠재적 의미를 분석하기 위해 사용될 수있다.

<table><tbody><tr><td>유리 모세관 (외경 1.0 mm, 내경 0.58&nbsp; mm)</td><td>Harvard Apparatus</td><td>300085</td><td>표준 두께</td></tr><tr><td>유리 모세관 (외경 1.0 mm, 내경 0.78 mm)</td><td>Harvard Apparatus</td><td>300085</td><td>얇은 벽의</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td>10&nbsp; 000개&nbsp; 단위 페니실린 및 10&nbsp; mg 스트렙토마이신 ml 파인</td></tr><tr><td>핀셋</td><td>Dumont Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td>5F</td></tr><tr><td>유리 바닥 접시</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-10-C</td><td></td></tr><tr><td>공기 트랜스젝터</td><td>Eppendorf</td><td>5246</td><td></td></tr><tr><td>Micro-forge</td><td>Narishige</td><td>MF-900</td><td></td></tr><tr><td>Microgrinder</td><td>Narishige</td><td>EG-44</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator (주입 용)</td><td>Narishige</td><td>MN-151</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator (세포 이식용)</td><td>Leica</td><td>Leica Micromanipulator</td><td></td></tr><tr><td>Hammilton 주사기</td><td>Narishige</td><td>IM-9B</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette puller</td><td>David Kopf Instruments</td><td>Model 720</td><td></td></tr><tr><td>Transplantation mold</td><td>Adapative Science Tools</td><td>PT-1</td><td></td></tr><tr><td>바늘 홀더</td><td>나리시게</td><td>HI-7</td><td></td></tr><tr><td>튜브 커넥터</td><td>나리시게</td><td>CI-1</td><td></td></tr><tr><td>PTFE 튜빙</td><td>나리시게</td><td>CT-1</td><td></td></tr></tbody></table>

분석<em&gt; 생체</em&gt; 셀 마이그레이션 zebrafish의 배아에서 세포 이식 및 시간 경과 이미징을 사용하여

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

세포 이동은 암 전이를 포함한 많은 생리학적, 병리학적 상태의 핵심입니다. 세포 이동의 세포 및 분자 기반은 in vitro에서 철저히 분석되었습니다. 그러나 in vivo 세포 이동은 in vitro migration과 다소 다르며, 분석이 더 어렵고 직접적인 관찰 및 조작에 대한 접근성이 낮은 것으로 입증되었습니다. 이 프로토콜은 세포 이동에서 후보 유전자의 기능을 연구하기 위한 모델 시스템으로 초기 제브라피시 배아에서 장래의 전형판(prechordal plate)의 이동을 사용합니다. Prechordal plate progenitors는 gastrulation 동안 배아 조직자에서 배아의 동물 극으로 지시된 이동을 겪는 세포 그룹을 형성합니다. 제안된 프로토콜은 세포 이식을 사용하여 모자이크 배아를 만듭니다. 이는 우수한 이미징의 핵심인 분리된 세포를 라벨링하고 관찰된 세포에 대한 기능 이득/손실 효과를 제한하여 세포 자율 효과를 보장하는 결합된 이점을 제공합니다. 여기에서는 세포 이동에서 TORC2 구성 요소인 Sin1의 기능을 평가한 방법을 설명하지만, 이 프로토콜은 생체 내에서 세포 이동을 제어하는 모든 후보 유전자의 기능을 분석하는 데 사용할 수 있습니다.

제시된 기법은 생체 내 세포 이동의 제어에 Sin1 상기 토 착체 2 (TORC2)의 핵심 구성 요소 중 하나의 역할을 분석 하였다. 세포 이식의 사용은 분리 된 세포 및 세포 자율 효과 분석 라벨을 허용한다. 영화 S1은 이식 prechordal 판 전구 세포의 이동을 보여줍니다. ABP140와 굴지의 표시는 굴지 풍부한 세포질 돌기 쉽게 시각화 할 수 있습니다. 우리는 그들의 주파수와 방향을 측정 하였다. 야생형 세포 이동의 방향 (도 3B)에서, 즉 동물 극 방향으로 배향 빈번한 큰 세포질 돌기를 생성한다. Sin1의 기능의 상실은 액틴 - 풍부 돌기 형성을 제어 sin1의 중요성을 입증 나머지 것들의 급격한 돌기의 수가 감소하고, 무작위로 이끈다. 흥미롭게도,이 표현형은 전자에 의해 구출 될 수있다RAC1 (15)의 구성 적 활성 형...

세포 이식, 세포골격 라벨링 및 기능 손실/이득 접근법을 결합한 이 프로토콜은 생체 내 세포 이동에서 후보 유전자의 기능을 분석하기 위해 이동하는 제브라피시 전향 prechordal plate를 사용하는 방법을 설명합니다.

분석<em&gt; 생체</em&gt; 셀 마이그레이션 Zebrafish의 배아에서 세포 이식 및 시간 경과 이미징을 사용하여

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

이 절차의 전반적인 목표는 제브라피시 배아에서 생체 내 이미징과 결합된 세포 이식을 통해, 생체 내 세포 이동을 조절하는 후보 유전자의 기능을 분석하는 것입니다. 이 방법은 생체 내 세포 이동에서 새로운 후보 유전자의 역할과 중요성을 결정하는 것과 같이 세포 이동 분야의 핵심적인 질문들을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 모자이크 배아를 생성하여 효율적인 이미징과 세포 분석이 가능하다는 점입니다.세포 이식용 바늘을 준비하려면 마이크로 피펫 풀러(micro pipette puller)를 사용하여 유리 모세관을 뽑아냅니다. 그다음 마이크로포지(microforge)를 사용하여 내경이 35 µm인 지점에서 바늘의 끝부분을 절단합니다. 마이크로그라인더(microgrinder)를 사용하여 절단된 모세관 끝을 45도 각도로 베벨 가공합니다.유리 잔여물을 제거하려면 바늘을 시린지에 장착된 바늘 홀더에 삽입한 다음, 2% hydrofluoric acid를 사용하여 용액을 빨아들였다가 내뱉는 과정을 세 번 반복하여 바늘 내부를 헹굽니다. 이어서 바늘을 acetone으로 세 번 헹굽니다. 주입 또는 세포 이식을 위한 디쉬를 준비하려면, 0.5 g의 agarose가 포함된 embryo medium 50 mL를 전자레인지의 최대 출력으로 1분간 가열하여 1% agarose를 준비합니다.아가로스 겔을 약 60 °C로 식힌 후 전체 부피를 90 mm 페트리 접시에 붓습니다. 주입을 위한 라인을 만들거나 세포 이식을 위한 웰을 만들기 위해 몰드를 삽입합니다. 아가로스 겔이 굳으면 핀셋을 사용하여 몰드를 제거합니다.공여 배아를 주입하기 위해, 실체현미경 하에서 핀셋을 사용하여 수집한 형질전환 배아를 배아 배지가 채워진 주입용 디쉬의 라인에 맞춰 조심스럽게 배치합니다. 핀셋으로 배아의 세포 부분이 위쪽을 향하도록 방향을 잡은 후, 배아가 4세포기에 도달할 때까지 디쉬를 28 °C에서 배양합니다. 다음으로, mcherry가 결합된 효모 액틴 결합 단백질 140의 액틴 결합 도메인이 포함되어 미리 준비된 주입 용액 2 µL를 주입 바늘에 충전합니다.그 다음, 바늘을 마이크로매니퓰레이터에 부착되고 에어 트랜스젝터(air transjector)에 연결된 바늘 홀더에 삽입합니다. 미세 핀셋으로 바늘 끝을 가볍게 터치하거나 끝부분을 집어 바늘을 엽니다. 그런 다음 바늘을 4개의 세포 중 하나에 삽입하고 용액을 주입하여 세포 부피의 70%를 채웁니다.유사한 방식으로 배아 30개를 주입합니다. 배아가 구형 단계(sphere stage)에 도달하면, 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 호스트 형질전환 goosecoid GFP 배아와 이전에 주입한 공여 배아를 각각 1mm 아가로스가 코팅된 배아 배지 및 Pen/Strep 배아 배지가 채워진 35mm 페트리 접시에 옮깁니다. 미세 핀셋을 사용하여 배아를 난막에서 수동으로 추출합니다.그 다음 배아를 28 °C 인큐베이터에 넣습니다. 형광 현미경 하에서 배아가 쉴드 단계(shield stage)에 도달하면, 녹색 쉴드 내에서 ABP140 mcherry를 발현하는 공여 배아를 선택합니다. 화염 연마된 파스퇴르 피펫을 사용하여 숙주 배아를 Pen/Strep EM이 채워진 세포 이식 접시의 한 줄 웰(well)들에 옮깁니다. 그 다음 공여 배아를 인접한 줄에 배치합니다.다음으로 속눈썹을 이용하여 배아의 쉴드(shield) 부분이 위로 향하도록 조심스럽게 방향을 잡습니다. 그 후 주사기에 연결된 니들 홀더를 사용하여 70% ethanol을 빨아들였다가 내뱉으며 바늘 끝을 세척합니다. 공기를 빨아들여 바늘을 건조시킵니다.바늘이 건조한 상태에서, 베벨이 위를 향하도록 하여 Hamilton 시린지에 연결된 바늘 홀더에 바늘을 삽입합니다. 쉴드 간 이식을 수행하려면 이식용 바늘로 공여 배아의 쉴드에 진입하여 ABP140 mcherry로 표지된 세포를 약 10-20개 흡입합니다. 이때 난황이 흡입되지 않도록 주의하십시오.세포를 호스트 배아의 실드(shield) 부위에 이식하고, 모든 호스트 배아의 이식이 완료될 때까지 세포 전이를 반복합니다. 이식이 완료되면 화염 연마된 파스퇴르 피펫을 사용하여 손상된 배아를 제거합니다. 이식된 배아가 회복될 수 있도록 28 °C에서 약 30분 동안 배양합니다.앞서 설명한 바와 같이 배아의 난막을 제거한 후 단일 전삭판 전구세포를 이식하려면, 화염 연마된 파스퇴르 피펫을 사용하여 공여체 배아 3개를 Pen/Strep이 함유된 칼슘 프리 링거액(calcium free ringers)이 채워진 세포 이식 접시에 옮깁니다. 미세 핀셋을 사용하여 각 배아에서 ABP140 mcherry가 표지된 세포가 주입된 외식편을 절제하고 나머지 배아 부분은 빠르게 폐기합니다. 속눈썹 붓을 사용하여 세포가 해리될 때까지 외식편을 부드럽게 젓습니다.그런 다음, 단일 분리 세포를 이식용 바늘로 흡입하여 앞서 비디오에서 시연한 대로 숙주 배아의 쉴드(shield) 부위에 이식합니다. 흡입 및 이식을 최적으로 제어하려면 공기/물 분리 지점을 바늘 끝에서 약 20 centimeters 거리에 유지하십시오. 배아를 고정하려면 유리 바닥 바이알에 EM 내의 뜨거운 0.2% agarose 1 millimeter를 채웁니다. 바이알을 42 degrees Celsius의 가열 블록에 넣습니다.선택한 배아를 아가로스 용액으로 옮기고 피펫 내의 과잉 배아 배지를 제거합니다. 그런 다음 배아를 아가로스와 함께 피펫으로 빨아들인 후, 미리 준비된 이미징 챔버로 아가로스 한 방울과 함께 옮깁니다. 아가로스가 굳기 전에 속눈썹 털을 사용하여 정위 방향을 잡는데, 정립 현미경으로 이미징할 경우에는 전삭판(prechordal plate)이 위쪽을 향하게 하고, 도립 현미경으로 이미징할 경우에는 유리 바닥 쪽을 향하게 배치합니다.실온에 따라 아가로스 겔이 굳기 전 배아의 방향을 잡는 데 약 40초의 시간이 소요됩니다. 매우 취약한 난황보다는 배엽을 조작하여 배아의 방향을 빠르게 잡으십시오. 모든 배아를 고정하고 아가로스가 굳은 후, 배아가 건조해지는 것을 방지하기 위해 Pen/Strep EM으로 챔버를 채우십시오.텍스트 프로토콜에 따라 살아있는 세포 이미징 및 세포 동태 실험을 수행하십시오. 이 비디오에서 시연된 기술은 생체 내 세포 이동을 조절하는 TOR 복합체 2의 핵심 구성 요소 중 하나인 Sin1의 역할을 분석하는 데 사용되었습니다. 이 영상은 이식된 전삭판 전구 세포의 이동을 보여줍니다.액틴 라벨링을 통해 액틴이 풍부한 세포질 돌기를 시각화할 수 있습니다. 빈도와 방향을 분석한 결과, 야생형 세포는 주로 동물극 방향 및 이동 방향으로 큰 세포질 돌기를 빈번하게 형성하는 것이 관찰되었습니다. 이 그림에서 볼 수 있듯이, Sin1의 기능 상실은 돌기의 수를 급격히 감소시키고 남은 돌기의 방향을 무작위로 만들어, 액틴 풍부 돌기 형성을 조절하는 데 있어 Sin1의 중요성을 입증합니다.흥미롭게도 Sin1 표현형은 constitutive active 형태의 Rac1 발현에 의해 회복될 수 있으며, 이는 TOR C2가 Rac1을 통해 액틴 역학 및 세포 돌출물 형성을 조절한다는 점을 강력하게 시사합니다. 이 기술은 세포 이동 시 ARP2/3 복합체의 억제제인 arpin의 역할을 분석하는 데에도 사용되었습니다. 여기서 보여지는 바와 같이, arpin의 기능 상실은 돌출물 형성 빈도가 높아지거나 돌출물의 안정성이 증가함에 따라 돌출물 발생 빈도의 증가로 이어집니다.arpin이 없는 상태에서 돌출부 수명을 측정한 결과, 돌출부의 시간적 지속성이 두 배로 증가하여 안정성이 향상되었음을 확인하였습니다. 숙달되면 약 30개의 배아 이식을 45분 만에 수행할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때는 모든 단계의 타이밍이 매우 중요하므로 배아의 발달 상태를 세밀하게 관찰하는 것이 중요합니다.이 절차 이후에는 라이브 공초점 현미경법과 같은 다른 방법을 수행하여 더 나은 이미징을 제공하고, 세포 골격 요소, 극성 마커, 접합 단백질 또는 기타 세포 구성 성분의 세포 내 조직화와 관련된 질문을 해결할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 전삭판 전구세포 이식을 사용하여 in vivo 세포 이동에서 임의의 후보 유전자의 역할을 분석하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

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여기에서 우리는 수정 후 최소 1일에서 7일 사이의 모든 단계에서 제브라피시 배아와 유충에서 높은 공간적 및 시간적 해상도로 세포를 이식하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

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