분석 생체 셀 마이그레이션 Zebrafish의 배아에서 세포 이식 및 시간 경과 이미징을 사용하여

이 절차의 전반적인 목표는 제브라피시 배아에서 라이브 이미징과 결합된 세포 이식을 사용하여 생체 내 세포 이동을 제어하는 후보 유전자의 기능을 분석하는 것입니다. 이 방법은 생체 내 세포 이동에서 새로운 후보 유전자의 역할과 중요성을 결정하는 것과 같은 세포 이동 분야의 주요 질문을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 좋은 이미징과 세포 선근증을 허용하는 모자이크 배아를 생성한다는 것입니다.

세포 이식 바늘을 준비하려면 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 유리 모세혈관을 당깁니다. 그런 다음 마이크로 단조로 내경이 35 마이크로 미터 인 지점에서 바늘 끝을 자릅니다. 마이크로 그라인더를 사용하여 모세관의 절단 끝을 45도 각도로 베벨

유리 잔여물을 제거하려면 주사기에 장착된 바늘 홀더에 바늘을 삽입한 다음 2% 불산을 사용하여 용액을 안팎으로 당겨 바늘 내부를 세 번 헹굽니다. 그런 다음 아세톤으로 바늘을 세 번 헹굽니다. 주사 또는 세포 이식을 위한 요리를 준비하려면 0.5g의 아가로스가 포함된 배아 배지 50ml를 전자레인지에서 최대 전력으로 1분 동안 가열하여 1% 아가로스를 준비합니다.

아가로스 젤을 섭씨 60도 정도로 식히고 90mm 페트리 접시에 전체 부피를 붓습니다. 주형을 삽입하여 주입을 위한 라인을 만들거나 세포 이식을 위한 웰을 만듭니다. 아가로스 젤이 설정되면 집게를 사용하여 곰팡이를 제거합니다.

기증자 배아를 주입하려면 실체현미경으로 집게를 사용하여 수집된 형질전환 배아를 배아 배지로 채워진 주입 접시의 라인에 부드럽게 짜냅니다. 겸자를 사용하여 세포가 위쪽을 향하도록 배아를 배양한 다음 배아가 4개의 세포 단계에 도달할 때까지 섭씨 28도에서 접시를 배양합니다. 다음으로, mcherry에 결합된 효모 액틴 결합 단백질 140의 액틴 결합 도메인을 포함하는 미리 준비된 주사 용액 2마이크로리터를 주입 바늘에 로드합니다.

그런 다음 미세 조작기에 부착되고 공기 트랜스젝터에 연결된 바늘 홀더에 바늘을 삽입합니다. 미세한 집게를 사용하여 바늘 끝을 부드럽게 만지거나 끝부분을 꼬집어 바늘을 엽니다. 그런 다음 4개의 세포 중 하나에 바늘을 삽입하고 세포 부피의 70%를 채우도록 용액을 주입합니다.

비슷한 방법으로 30개의 배아를 주입합니다. 배아가 구 단계에 도달했을 때, 플라스틱 목초지 피펫을 사용하여 숙주 형질전환 구스코이드 GFP 배아와 이전에 주입된 기증자 배아를 배아 배지에 1mm 아가로스로 코팅하고 펜/연쇄상구균 배아로 채운 별도의 35mm 페트리 접시에 전달합니다. 가는 핀셋을 사용하여 맥락막에서 배아를 수동으로 추출합니다.

그런 다음 배아를 섭씨 28도의 인큐베이터에 넣습니다. 배아가 형광 현미경으로 차폐 단계에 도달하면, 녹색 차폐 내에서 ABP140 mcherry를 발현하는 기증자 배아를 선택합니다. 불로 연마된 목초지 피펫을 사용하여 숙주 배아를 Pen/Strep EM으로 채워진 세포 이식 접시의 한 줄의 웰로 옮깁니다. 그런 다음 기증자 배아를 옆줄에 놓습니다.

다음으로, 속눈썹으로 보호막이 위로 향하게 하여 배아의 방향을 조심스럽게 잡습니다. 그런 다음 주사기에 부착된 바늘 홀더를 사용하여 70%의 에탄올을 빨아들여 빼내어 바늘 끝을 헹굽니다. 바늘에 공기를 빨아 바늘을 말리십시오.

바늘이 마르면 베벨이 위를 향하도록 하여 Hamilton 주사기에 연결된 바늘 홀더에 삽입합니다. Shield to Shield 이식을 수행하려면 이식 바늘로 기증자 배아의 보호막에 들어가 ABP140 mcherry로 표지된 약 10-20개의 세포를 추출합니다. 노른자를 그리지 않도록 주의하세요.

세포를 숙주 배아의 보호막에 이식하고 모든 숙주 배아가 이식될 때까지 세포 전달을 반복합니다. 이식이 완료되면 불에 광택이 나는 목초지 피펫을 사용하여 손상된 배아를 제거합니다. 이식된 배아를 섭씨 28도에서 약 30분 동안 배양하여 회복할 수 있도록 합니다.

배아를 탈퇴한 후 단일 prechordal plate pregenitor 세포를 이식하려면 앞에서 설명한 바와 같이 불에 닦인 목초지 피펫을 사용하여 3개의 기증자 배아를 Pen/Strep 칼슘이 없는 링거로 채워진 세포 이식 접시에 이식합니다. 각 배아에 대해 미세한 핀셋을 사용하여 주입된 ABP140 mcherry 표지된 세포를 포함하는 외식세포를 해부하고 나머지 배아를 빠르게 폐기합니다. 속눈썹을 사용하여 세포가 해리될 때까지 외식식물을 부드럽게 저어줍니다.

그런 다음 이식 바늘에서 분리된 단일 세포를 추출하고 비디오의 앞부분에서 설명한 것처럼 숙주 배아의 보호막에 이식합니다. 흡인 및 이식을 최적으로 제어하려면 바늘 끝에서 약 20cm의 공기/수분 간격을 유지하십시오. 배아를 장착하기 위해 유리 바닥 바이알에 1mm의 뜨거운 0.2% 아가로스를 EM으로 채웁니다. 바이알을 섭씨 42도의 열 블록에 놓습니다.

선택한 배아를 아가로스 용액으로 옮기고 피펫에서 초과 배아 배지를 폐기합니다. 그런 다음 아가로스와 함께 배아를 피펫으로 끌어들이고 아가로스 한 방울과 함께 미리 준비된 이미징 챔버로 옮깁니다. 아가로스를 설정하기 전에 속눈썹을 사용하여 정립 현미경으로 이미징하기 위해 투시 프리코드 플레이트를 위쪽으로 배치하거나 도립 현미경으로 이미징하기 위해 유리 바닥에 배치하여 배아의 방향을 지정합니다.

실온에 따라 아가로스 겔이 굳어지기 전에 배아의 방향을 잡는 데 약 40초가 걸립니다. 매우 연약한 난황(yolk)보다는 배배엽(blastoderm)을 조작하여 배아를 빠르게 배아의 방향을 잡습니다. 모든 배아를 장착하고 아가로스를 설정한 후 Pen/Strep EM을 사용하여 챔버를 채워 배아가 건조되는 것을 방지합니다.

텍스트 프로토콜에 따라 라이브 셀 이미징 및 세포 역학 실험을 수행합니다. 이 비디오에서 시연된 기술은 생체 내 세포 이동을 제어하는 데 있어 TOR complex 2의 핵심 구성 요소 중 하나인 Sin1의 역할을 분석하는 데 사용되었습니다. 이 동영상은 이식된 prechordal plate pregenitor cell의 이동을 보여줍니다.

Actin 라벨링을 통해 actin이 풍부한 세포질 돌출부를 시각화할 수 있습니다. 빈도와 방향에 대한 분석을 통해 야생형 세포가 종종 동물의 극 방향과 이동 방향으로 배향된 큰 세포질 돌기를 생성하는 것이 관찰되었습니다. 이 그림에서 볼 수 있듯이 Sin1의 기능 상실은 돌출부의 수를 급격히 감소시키고 나머지 돌출부의 무작위화로 이어지며, 이는 액틴이 풍부한 돌출 형성을 제어하는 데 Sin1의 중요성을 보여줍니다.

흥미롭게도, Sin1 표현형은 Rac1의 구조적 활성 형태의 발현에 의해 구제될 수 있으며, 이는 TOR C2가 Rac1을 통한 액틴 역학 및 세포 돌출 형성을 제어한다는 것을 강력하게 시사합니다. 이 기술은 또한 세포 이동에서 ARP2/3 복합체의 억제제인 arpin의 역할을 분석하는 데 사용되었습니다. 여기에서 볼 수 있듯이, arpin의 기능 상실은 더 빈번한 돌출 형성 또는 돌출 안정성의 증가로 인해 돌출 빈도의 증가로 이어집니다.

arpin이 없는 상태에서 돌출 수명을 측정하면 돌출부의 시간적 지속성이 두 배로 증가하여 안정성이 증가함을 나타내는 것으로 나타났습니다. 일단 숙달되면 약 30개의 배아를 이식하는 데 45분 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 모든 단계가 매우 시기적으로 진행되므로 배아의 발달을 주시하는 것이 중요합니다.

이 절차에 따라 라이브 컨포칼 현미경 검사와 같은 다른 방법을 수행하여 더 나은 이미징을 제공하고 세포경 요소, 극성 마커, 부가 단백질 또는 기타 세포 구성 요소의 하위 세포 조직과 관련된 질문을 해결할 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 in vivo 세포 이동에서 후보 유전자의 역할을 분석하기 위해 prechordal plate pregenitor의 이식을 사용하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.