라이브 이미징 및 상해 응답의 연구에 대한 마이크로 유체 칩을 사용 초파리 애벌레

다음 실험의 전반적인 목표는 변형된 미세유체 챔버를 사용하여 실시간 이미징을 위해 초파리 유충을 비침습적으로 고정하는 것입니다. 별유충의 세 번째 유충은 유충을 밀봉하는 데 도움이 되는 약간의 기름과 함께 칩에 배치됩니다. 다음으로, 칩을 유충 위에 올려 몸체가 챔버 내에 맞도록 합니다.

칩은 주사기에 연결되어 진공이 적용될 수 있습니다. 유충의 운동성이 제한되고 동물의 복부 부분에있는 구조가 덮개 슬립에 가깝게 밀려납니다. 컨포칼 현미경을 사용하면 감각 뉴런 축삭 말단의 세부 사항, 유도 신경 손상 후 분절 신경의 재생과 같은 구조를 쉽게 이미지화할 수 있습니다.

라이브 이미징, 거대한 클로로포름 에테르 또는 ISO 마취제를 위해 josepha를 고정시키는 다른 방법. 이 기술의 가장 큰 장점은 동물의 생리학을 방해하는 거대한 독소를 피한다는 것입니다. 그리고 독소가 없기 때문에 추가적인 이점은 유충 GB가 안전하고 강력한 고정화로 작동하여 더 빠른 축삭 수송 및 세포 내 칼슘의 변화와 같은 빠른 이벤트를 이미징할 수 있다는 것입니다.

단일 유충은 칩에서 여러 번 고정되고 이미지화될 수 있습니다. 이것은 시간 생활을 허용합니다. 최대 72시간 동안 수행되는 프로세스의 이미징 먼저 샘플 PDMS 칩을 구하여 이 프로토콜을 시험해 봅니다.

SU 8 금형에서 A-P-D-M-S 칩을 만드는 방법에 대한 지침은 21 게이지 디스펜싱 바늘을 사용하여 텍스트 프로토콜에서 읽을 수 있습니다. 도립 현미경을 위해 PDMS 칩의 진공 포트에 구멍을 뚫습니다. 베이스에서 23 게이지 바늘을 제거하고 몇 번 비틀어 잠금 허브를 제거합니다.

그런 다음 바늘 끝을 작은 폴리에틸렌 튜브 조각에 삽입하여 튜브가 바늘의 1mm 이상을 덮도록 합니다. 면도날을 사용하여 여분의 튜브를 잘라냅니다. 이것은 밀봉을 만들 수 있는 플라스틱 링을 남깁니다.

23 게이지 바늘 끝을 진공 포트의 구멍에 삽입합니다. 정립 현미경의 경우 21게이지 디스펜싱 바늘로 PDMS 칩 측면의 두 번째 구멍을 뚫습니다. 이 구멍을 통해 측면에서 첫 번째 구멍에 접근할 수 있습니다.

그런 다음 23 게이지 바늘 끝과 튜브 링을 측면 구멍에 삽입합니다. PDMS 칩 상단에 양면 테이프를 붙여 상단 구멍을 밀봉합니다. 칩의 진공 포트에 삽입된 바늘 끝과 3방향 밸브의 포트 중 하나 사이에 20cm 길이의 폴리에틸렌 튜브를 부착합니다.

그런 다음 20ml 주사기를 밸브의 나머지 두 포트 중 하나에 연결하고 마지막 포트는 열어 둡니다. 투명 접착 테이프로 PDMS 칩을 청소합니다. 칩 바닥에 테이프 조각을 부착합니다.

테이프가 전체 PDMS 표면에 닿았는지 확인한 다음 테이프를 떼어냅니다. 이 청소 방법을 세 번 반복합니다. PDMS 칩은 재사용이 가능하기 때문에 PDM과 유리의 접착력에 영향을 줄 수 있으므로 오일 잔여물을 제거하는 것이 매우 중요합니다.

세 번째 instar 유충은 음식에서 물이 들어있는 페트리 접시로. 칩에 올바르게 맞으려면 길이가 3.5mm에서 4mm 사이여야 합니다. 배양 배지를 제거하기 위해 유충을 목욕시킵니다.

다음으로 유리 덮개 중앙에 있는 헤일로 카본 700 오일을 작게 떨어뜨리고 집게를 사용하여 씻은 유충을 부드럽게 집습니다. 가벼운 물티슈에 간단히 올려 수건으로 닦아낸 다음 10초 동안 오일에 옮깁니다. 방울은 유충의 기관이 코팅되지 않을 정도로 충분히 작아야 합니다.

그런 다음 유충을 깨끗한 유리 덮개 슬립에 잠시 놓고 다른 커버 슬립으로 옮깁니다. 따라서 기름을 조금 더 제거합니다. 유충의 방향에 주의를 기울여 신경삭삭과 분절 신경을 이미지화합니다.

복부 쪽은 아래를 향해야 합니다. 쉽게 식별할 수 있는 기관관은 위쪽을 향해야 합니다. 이제 PDMS 칩을 유충 위에 부드럽게 놓습니다.

유충을 마이크로 챔버의 중앙에 정렬합니다. 뒤쪽이 진공 포트를 향하고 있기 때문에 유충은 챔버의 가장자리에 닿지 않아야 합니다. 정렬이 완료되면 PDMS 칩을 유리 커버 슬립에 밀어 넣어 밀봉이 잘 되도록 합니다.

그런 다음 유충이 마이크로 챔버에 완전히 둘러싸여 있는지 다시 확인하십시오. 이제 3방향 밸브를 주사기로 전환합니다. PDMS 어셈블리를 단단히 잡고 주사기 플런저를 당겨 저항이 느껴질 때까지 2-2.5mm의 공기를 빼냅니다.

따라서 진공이 생성됩니다. 그런 다음 밸브를 끕니다. 진공을 조심스럽게 유지하려면 유충을 다시 확인하십시오.

몸은 마이크로 챔버 안에서 움직이지 않아야 하며, 기관이 보여야 한다. PDMS 칩의 나머지 부분은 커버 슬립과 접촉해야 합니다.이와 같은 방향은 올바르지 않습니다. 이제 애벌레를 이미지화하십시오.

정립 현미경을 사용하는 경우 칩의 윗면을 s에 고정하십시오.tage 양면 테이프로. 이미징이 완료되면 진공 청소기를 해제합니다. 그런 다음 커버 슬립에서 PDMS 칩을 분리합니다.

유충은 집게를 사용하여 즉시 운동할 수 있어야 합니다. 회복을 위해 유충을 포도 주스 한천 접시에 다시 넣으십시오. 마취된 유충 한 마리를 포도 주스 한천 접시에 놓습니다.

실체 현미경 아래에서 동물의 복부 쪽을 위로 돌립니다. 복부 신경삭과 분절 신경을 시각화하려면 유충이 완전히 움직이지 않는지 확인하십시오. 신경삭과 타액선을 찾습니다.

이러한 구조물을 손상시키지 않는 것이 중요합니다. 세 번째 복부 분절의 끝을 찾습니다. 여기서 부상은 가장 많은 신경을 손상시키고 동물을 죽이지 않고 번식하기가 가장 쉽습니다.

부상은 또한 듀오 스타 번호 5인 겸자를 사용하여 더 많은 후방 세그먼트에서 수행할 수 있습니다. 5-10초 동안 큐티클을 통해 분절 신경을 단단히 조입니다. 올바르게 수행하면 큐티클이 손상되지 않고 체벽이 뚫리지 않습니다.

마스터리는 부상으로 인해 동물의 복부 쪽이 그레이트 플레이트에 내려간 후 연습이 필요합니다. 머리를 움직이고 먹을 수 있어야 합니다. 부상이 성공적이면 유충의 뒤쪽 절반이 마비됩니다.

유충 칩은 개별 말초 축삭돌기 내에서 시냅스 소포의 키네신 매개 수송을 이미지화하는 데 사용되었습니다. 이러한 소포의 엔테로 등급 이동은 초당 약 1.0미크론으로 측정되었습니다. 역행 운동은 초당 0.8미크론으로 측정되었습니다.

고정화 기술은 펄스 UV 염료 레이저를 사용한 레이저 미세 수술에 사용되었습니다. 칼슘 수치는 유전적으로 암호화된 지표 덕분에 특정 뉴런에서 관찰되었습니다. G camp 3.0 감각 뉴런 후에 칼슘 스파이크가 감지됩니다.

수상돌기가 횡단됩니다. 이미징 세션 사이에 동물이 휴식을 취할 수 있도록 하면 시간이 지남에 따라 세포 이벤트를 볼 수 있습니다. 에메릭 운동 뉴런의 축삭돌기를 분쇄한 후, 근위 축삭 그루터기는 새로운 싹을 틔웠습니다.

한편, 원위 축삭돌기는 정맥류를 형성하고 월러의 퇴화 과정을 통해 파편화되었습니다. 유충 칩을 사용하여 생체 내에서 변환된 형광 단백질을 추적하는 것도 가능합니다. 클래스 4 감각 뉴런에서 발현되는 DRA 2 알파 튜불린 융합 단백질은 세포체에서 광 변환되었습니다.

이틀 이내에 상당한 양의 광 변환 단백질이 세포체의 원래 위치에서 약 1mm 떨어진 감각 뉴런의 축삭 말단으로 재배치되었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 초파리 유충의 실시간 이미징을 위해 유충 칩을 활용하는 방법과 신경 압착 손상을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이러한 기술을 마스터하면 단 몇 분 만에 유충을 현미경에 배치할 수 있습니다.

신경이 곤두서는 속도도 그만큼 빠릅니다. 따라서 이러한 절차는 유전 학위와 같은 대규모 실험에 활용 될 수 있습니다. 이 칩은 초파리 유충의 복부 쪽에 있는 구조를 이미지화하는 데 사용할 수 있습니다.

여기에는 근육, 신경근 접합 시냅스, 감각 뉴런, 말초 신경 및 복부 신경삭이 포함되지만 이에 국한되지 않습니다. 이 절차는 유충 심장, 타액선 및 기관의 실시간 이미징을 수행하는 데에도 사용할 수 있습니다. 이 비디오에 사용된 애벌레 칩은 길이가 3.5mm에서 4mm 사이인 동물용 크기입니다.

이미징이 작거나 크면 챔버가 작거나 큰 동물 칩을 쉽게 만들 수 있습니다. PDMS 칩을 만들기 위한 보충 설계 파일 및 지침을 참조하십시오. PDMS 칩을 만들기 위한 지침은 서면 프로토콜에 포함되어 있습니다.

저희에게 연락하시면 샘플 칩을 보내드릴 수 있습니다.