1. Steekproeven nemen
- Verzamel grondmonsters en breng deze naar het laboratorium voor microbiologisch onderzoek.
- Weeg in het laboratorium een monster van 10 g af met een analytische weegschaal.
- Verdun het monster 1:10 in 95 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (10 delen grond komen overeen met 5 delen vloeibare oplossing) en vortex om te mengen (Figuur 2, Stap 1).
- Voer vervolgende 1:10 verdunningen uit tot ten minste 10-5 g grond per ml, en verdeel geselecteerde verdunningen in replica's van twee of drie op een medium met lage voedingsstoffen (bijv. R2A) (Figuur 2, Stappen 2-3).
- Bewaar de platen een week lang bij kamertemperatuur (Figuur 2, Stap 4).
- Selecteer een of twee kolonies voor isolatie en streek deze op verse agar platen (Figuur 3, Stappen 1-3).
- Bewaar de streekplaten twee tot drie dagen bij kamertemperatuur (Figuur 3, Stap 4).
2. Voorbereiding van bacteriële uitstrijkjes
- Observeer de streekplaten op geïsoleerde kolonies.
- Om elk uitstrijkje voor te bereiden, dompel een inoculatielus in ethanol, steriliseer deze met vlam en plaats 1 tot 2 lusjes steriel gedistilleerd water in het midden van vooraf gereinigde glazen plaatjes.
- Steriliseer de inoculatielus opnieuw zoals eerder beschreven. Verwijder eens de lus is afgekoeld een kleine hoeveelheid cultuur uit een enkele geïsoleerde kolonie en meng deze met de waterdruppels op het plaatje (het uitstrijkje moet op verdunde mageremelk lijken). De inoculatielus moet zijn afgekoeld voordat de kolonie wordt geïsoleerd. Een lus die te heet is, zal ervoor zorgen dat de kolonie en/of het medium spatten, wat kan leiden tot aerosolisatie van bacteriën. Over het algemeen zal er een 'sissend' geluid te horen zijn wanneer de lus wordt aangebracht op de agar of kolonie wanneer de lus te heet is voor gebruik. Onjuiste koeling van de lus kan ook leiden tot minder efficiënte overdracht van cultuur naar plaatje en vervorming van de celmorfologie.
- Verspreid het uitstrijkje over het oppervlak van het plaatje, ongeveer 2,5 cm x 2,5 cm, en laat het aan de lucht drogen. Het is belangrijk dat het uitdrogen onder laminaire stromingscondities plaatsvindt. Plaatjes mogen niet worden uitgeblazen om verstoring van het uitstrijkje te voorkomen. Plaatjes mogen ook niet worden vlam-gedroogd om de celmorfologie te behouden.
- Na het drogen, fixeer het uitstrijkje door het plaatje 2-3 keer snel door een vlam te halen. Het plaatje mag niet stationair in de vlam worden gehouden om vervorming van de celmorfologie en/of beschadiging van het glazen plaatje te voorkomen.
3. Gram-kleuring
- Bevestig het plaatje aan één uiteinde met een schone klemklem.
- Bedek het uitstrijkje met kristalviolet (primaire kleurstof) en laat 2 tot 3 min. staan.
- Was het plaatje voorzichtig met gedistilleerd water af. De waterstraal mag niet op het uitstrijkje worden gericht om schade en/of loslating van het glazen plaatje te voorkomen.
- Bedek het uitstrijkje met Grams jodium en laat 2 min. staan, spoel het plaatje vervolgens voorzichtig met water af.
- Ontkleuren het uitstrijkje met 95% ethanol tot de kleurstof niet meer van het plaatje wordt gewassen (dit duurt meestal niet meer dan 20 s, afhankelijk van de dikte van het uitstrijkje), spoel vervolgens onmiddellijk af met gedistilleerd water. Deze stap is cruciaal om overontkleuring van het plaatje te voorkomen, wat kan leiden tot een valse Gram-kleuring (d.w.z. Gram-variabel).
- Voeg de tegenkleurstof (safranine) toe aan het uitstrijkje en laat 30 s. staan. Spoel het plaatje vervolgens voorzichtig af met gedistilleerd water en droog het af met absorberend papier.
4. Microscopisch onderzoek van plaatjes
- Observeer de plaatjes met een laag (bijv. 4X of 10X), hoog-droog (bijv. 40X) en olie-immersie (100X) objectief. Voeg voor olie-immersie de olie rechtstreeks toe aan het uitstrijkje.
- Voor representatieve resultaten van Gram-positieve en Gram-negatieve grondbacteriën, zie Figuur 4 en Figuur 5.
Figuur 2. Verdunnings- en verspreidingstechniek op platen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Kolonie-isolatie met behulp van de streekplate-techniek.
Bron: Laboratories van Dr. Ian Pepper en Dr. Charles Gerba - The University of Arizona
Demonstrerende auteur: Luisa Ikner
Het spectrum van onderzoek i…
1. Steekproeven nemen
- Verzamel grondmonsters en breng deze naar het laboratorium voor microbiologisch onderzoek.
- Weeg in het laboratorium een monster van 10 g af met een analytische weegschaal.
- Verdun het monster 1:10 in 95 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (10 delen grond komen overeen met 5 delen vloeibare oplossing) en vortex om te mengen (Figuur 2, Stap 1).
- Voer vervolgende 1:10 verdunningen uit tot ten minste 10-5 g grond per ml, en verdeel geselecteerde verdunningen in replica's van twee of drie op een medium met lage voedingsstoffen (bijv. R2A) (Figuur 2, Stappen 2-3).
- Bewaar de platen een week lang bij kamertemperatuur (Figuur 2, Stap 4).
- Selecteer een of twee kolonies voor isolatie en streek deze op verse agar platen (Figuur 3, Stappen 1-3).
- Bewaar de streekplaten twee tot drie dagen bij kamertemperatuur (Figuur 3, Stap 4).
2. Voorbereiding van bacteriële uitstrijkjes
- Observeer de streekplaten op geïsoleerde kolonies.
- Om elk uitstrijkje voor te bereiden, dompel een inoculatielus in ethanol, steriliseer deze met vlam en plaats 1 tot 2 lusjes steriel gedistilleerd water in het midden van vooraf gereinigde glazen plaatjes.
- Steriliseer de inoculatielus opnieuw zoals eerder beschreven. Verwijder eens de lus is afgekoeld een kleine hoeveelheid cultuur uit een enkele geïsoleerde kolonie en meng deze met de waterdruppels op het plaatje (het uitstrijkje moet op verdunde mageremelk lijken). De inoculatielus moet zijn afgekoeld voordat de kolonie wordt geïsoleerd. Een lus die te heet is, zal ervoor zorgen dat de kolonie en/of het medium spatten, wat kan leiden tot aerosolisatie van bacteriën. Over het algemeen zal er een 'sissend' geluid te horen zijn wanneer de lus wordt aangebracht op de agar of kolonie wanneer de lus te heet is voor gebruik. Onjuiste koeling van de lus kan ook leiden tot minder efficiënte overdracht van cultuur naar plaatje en vervorming van de celmorfologie.
- Verspreid het uitstrijkje over het oppervlak van het plaatje, ongeveer 2,5 cm x 2,5 cm, en laat het aan de lucht drogen. Het is belangrijk dat het uitdrogen onder laminaire stromingscondities plaatsvindt. Plaatjes mogen niet worden uitgeblazen om verstoring van het uitstrijkje te voorkomen. Plaatjes mogen ook niet worden vlam-gedroogd om de celmorfologie te behouden.
- Na het drogen, fixeer het uitstrijkje door het plaatje 2-3 keer snel door een vlam te halen. Het plaatje mag niet stationair in de vlam worden gehouden om vervorming van de celmorfologie en/of beschadiging van het glazen plaatje te voorkomen.
3. Gram-kleuring
- Bevestig het plaatje aan één uiteinde met een schone klemklem.
- Bedek het uitstrijkje met kristalviolet (primaire kleurstof) en laat 2 tot 3 min. staan.
- Was het plaatje voorzichtig met gedistilleerd water af. De waterstraal mag niet op het uitstrijkje worden gericht om schade en/of loslating van het glazen plaatje te voorkomen.
- Bedek het uitstrijkje met Grams jodium en laat 2 min. staan, spoel het plaatje vervolgens voorzichtig met water af.
- Ontkleuren het uitstrijkje met 95% ethanol tot de kleurstof niet meer van het plaatje wordt gewassen (dit duurt meestal niet meer dan 20 s, afhankelijk van de dikte van het uitstrijkje), spoel vervolgens onmiddellijk af met gedistilleerd water. Deze stap is cruciaal om overontkleuring van het plaatje te voorkomen, wat kan leiden tot een valse Gram-kleuring (d.w.z. Gram-variabel).
- Voeg de tegenkleurstof (safranine) toe aan het uitstrijkje en laat 30 s. staan. Spoel het plaatje vervolgens voorzichtig af met gedistilleerd water en droog het af met absorberend papier.
4. Microscopisch onderzoek van plaatjes
- Observeer de plaatjes met een laag (bijv. 4X of 10X), hoog-droog (bijv. 40X) en olie-immersie (100X) objectief. Voeg voor olie-immersie de olie rechtstreeks toe aan het uitstrijkje.
- Voor representatieve resultaten van Gram-positieve en Gram-negatieve grondbacteriën, zie Figuur 4 en Figuur 5.
Figuur 2. Verdunnings- en verspreidingstechniek op platen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Kolonie-isolatie met behulp van de streekplate-techniek.
Gramkleuring maakt een snelle visualisatie van bacteriële morfologie en een breed cellulair onderscheid mogelijk vanuit een breed scala aan milieumonsters. Om bacteriën te kleuren, wordt een uniforme uitstrijk aangebracht op een glazen plaat en wordt deze gedroogd. Na het snel verwarmen van de uitstrijk wordt kristalviolet aangebracht.
Een ontkleurmiddel spoelt het kristalviolet weg van Gram-negatieve cellen, maar niet van Gram-positieve cellen. Een tweede kleurstof, meestal safranine, wordt gebruikt als achtergrondkleurstof om de Gram-negatieve cellen zichtbaar te maken. Eenmaal gekleurd, kunnen de cellen worden beoordeeld op celmorfologie, grootte en opstelling, zoals ketens of clusters.
Deze video zal laten zien hoe je een milieumonster kunt voorbereiden, de bacteriesoorten daarin kunt isoleren en een Gramkleuring kunt uitvoeren op de geïsoleerde kolonies
Gramkleuring maakt de categorisering van de meeste bacteriën mogelijk in twee brede structurele klassen: Gram-positief en Gram-negatief. Hoewel beide klassen een onderliggende fosfolipideplasmamembraan hebben, varieert de structuur van de celwand sterk. De Gram-positieve celwand bestaat voornamelijk uit een dikke laag peptidoglycaan, een polymeer dat bestaat uit suikers en aminozuren. Gram-negatieve celwanden hebben een dunnere laag peptidoglycaan, ingeklemd tussen een tweede lipidemembraan. Dit buitenmembraan bevat meestal lipopolysacchariden.
Het positief geladen kristalviolet bindt zwak aan de negatief geladen bacteriële celwand. Gram's jodium vormt een onoplosbaar complex met de kristalvioletkleurstof, waardoor het in de celwand wordt gefixeerd.
Tijdens de ontkleurstap wordt het peptidoglycaan in de Gram-positieve cellen gedehydrateerd, waardoor het krimpt en de kristalviolet-jodiumcomplexen vasthoudt. In Gram-negatieve cellen beschadigd het ontkleurmiddel het buitenmembraan, waardoor het porositeit toeneemt. Dit maakt het mogelijk dat de kristalviolet-jodiumcomplexen worden weggespoeld.
Nu u de principes achter Gramkleuring van bodembacteriën begrijpt, laten we het proces zien dat in het laboratorium op bodembacteriën wordt uitgevoerd.
Na het verzamelen van een grondmonster in het?veld, breng het dan naar het laboratorium voor analyse. Verfijn het monster met een zeef en weeg 10 g van de gezeefde grond?met een analytische weegschaal.
Verdun het monster tot 95 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing en vortex om te mengen. Voer aanvullende 1 tot 10 verdunningen uit, waarbij tussen elke verdunning wordt gevortext. Breng aliquoten van minimaal 3 opeenvolgende verdunningen over op replicaat lage voedingsstof agarose platen.
Na sterilisatie met ethanol-vlam en afkoeling van een gebogen glazen staaf door erop te tikken op het medium, verspreidt u het monster over het oppervlak van de platen. Bewaar de platen bij kamertemperatuur. Na incubatie gedurende 3 tot 5 dagen, selecteert u de hoogste verdunning met 30 tot 300 discrete kolonies. Selecteer met een steriele inoculatielus interessante kolonies voor isolatie.
Streek de kolonie op één sectie van een verse plaat. Steriliseer de lus tussen de streken, maak opeenvolgende streken in een zigzagpatroon op elke sectie van de plaat om de daaropvolgende isolatie van discrete enkele kolonies mogelijk te maken. Bewaar de platen 1 tot 2 dagen bij kamertemperatuur.
Om met de voorbereiding van bacteriële uitstrijkjes te beginnen, bevestigt u een clip aan een vooraf schoongemaakte glazen plaat voor gemakkelijke handeling. Voor elk bacterieel uitstrijkje, reinig en steriliseer een inoculatielus met vlam. Plaats 2 lusjes steriel gedestilleerd water in het midden van de plaat.
Nadat de lus opnieuw is gesteriliseerd, verwijdert u een kleine hoeveelheid cultuur van een geïsoleerde kolonie en mengt deze met het water op de plaat. Het is belangrijk om de lus af te koelen voordat u de cultuur aanraakt door meerdere keren op een niet-geïnoculeerd deel van agar te tikken. Het uitstrijkje moet lijken op verdunde melk. Laat de plaat op kamertemperatuur drogen. Na het drogen, fixeert u het uitstrijkje door het snel door een vlam te halen.
Eenmaal droog, pipet kristalviolet op het uitstrijkje en laat het 2 - 3 min. staan. Spoel de plaat voorzichtig met gedestilleerd water door de directe stroom op de bovenkant van de plaat te richten, waardoor het water zachtjes naar beneden stroomt. Richt de waterstroom niet direct op het uitstrijkje.
Bedek de plaat met Gram's jodium. Na 2 min. spoelt u voorzichtig met gedestilleerd water. Ontkleurt u de plaat met 95% ethanol tot het kleurmiddel niet meer wegwast. Spoel onmiddellijk met gedestilleerd water. Dit beperkt overmatig ontkleuren van het uitstrijkje.
Voeg safranine toe als tegenkleurstof aan het uitstrijkje gedurende 30 s. Dit zal eventuele Gram-negatieve cellen die aanwezig zijn, kleuren. Spoel voorzichtig met gedestilleerd water en dep droog met absorberend papier. Observeer de resulterende plaat met een microscoop. Gebruik eerst een laagvermogen objectief om grove aanpassingen te maken en vind een ideale portie van het uitstrijkje voordat u overgaat naar de kleinere gezichtsvelden van de hogere vergroting.
Na verdere beeldvorming en aanpassing van het uitstrijkje met een mediumvermogen objectief, voegt u immersieolie direct toe aan het uitstrijkje. De olie is nodig voor hoogvermogen objectieven die de beste micrografen zullen bieden. Gram-positieve bacteriën zullen blauw of paars van kleur zijn, terwijl Gram-negatieve cellen rood of roze zullen zijn. Naast de celwandstructuur, worden vorm en opstelling verduidelijkt uit de resulterende micrografen.
Het vermogen van Gramkleuring om bacteriën kwalitatief te bestuderen is belangrijk voor een breed scala aan wetenschappelijke velden.
Grond is slechts een van de milieubronnen waaruit bacteriën kunnen worden geïsoleerd en geanalyseerd. Voor drinkwater moet de monstervoorbereiding worden aangepast. Monsters van kraanwater kunnen worden getrokken uit een kraan en op groeimedia worden geplaatst die
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is the difference between Gram-positive and Gram-negative bacterial cell walls?
Gram-positive bacteria have a thick peptidoglycan layer that contracts during decolorization, trapping crystal violet-iodine complexes inside the cell wall. Gram-negative bacteria possess a thinner peptidoglycan layer sandwiched between two membranes, allowing the decolorizing agent to compromise the outer membrane and wash away the dye complexes, resulting in different colors under microscopy.
Q2: How does crystal violet bind to bacterial cells during Gram staining?
Positively-charged crystal violet binds weakly to negatively-charged bacterial cell walls. Gram's iodine then forms an insoluble complex with the crystal violet dye, fixing it within the cell wall structure and enabling visualization under microscopy. This complex formation is essential for the staining process to work effectively.
Q3: What steps are involved in preparing a bacterial smear for Gram staining?
Mix a small amount of isolated bacterial culture with sterile distilled water on a glass slide to create a diluted milk-like consistency. Allow the smear to dry at room temperature, then heat-fix it by quickly passing the slide through a flame to adhere bacteria to the glass surface permanently.
Q4: Why is safranin applied as a counterstain in the Gram staining procedure?
Safranin is applied after decolorization to visualize Gram-negative bacteria, which appear red or pink under microscopy. This counterstain ensures that both Gram-positive cells appearing blue or purple and Gram-negative cells are visible and distinguishable in the final preparation for accurate bacterial classification.
Q5: How are bacterial colonies isolated from environmental soil samples?
Soil samples are diluted serially and plated onto low-nutrient agarose media. After incubation, colonies from the highest dilution with 30 to 300 discrete colonies are selected and streaked onto fresh plates in a zig-zag pattern to obtain isolated single colonies for culturing and enumerating bacteria from soil samples.
Q6: What information can be determined from observing Gram-stained bacterial cells under a microscope?
Gram staining reveals bacterial morphology, including cell shape, size, and arrangement such as chains or clusters. Color indicates Gram classification: blue or purple for Gram-positive cells and red or pink for Gram-negative cells, enabling rapid categorization of bacteria into two broad structural classes.
Q7: How does Gram staining help identify bacteria in clinical and environmental applications?
Gram staining provides rapid visual distinction of bacterial populations, enabling targeted identification strategies. For example, knowing a bacterium is Gram-positive allows selection of species-specific peptide nucleic acid probes or selective media like cycloserine agar that inhibits Gram-negative growth, facilitating isolation of bacteria of interest.
Chapters in this video
0:00
Overview
1:11
Principles of Gram Staining
2:52
Sample Collection and Isolation
4:27
Preparation of Bacterial Smears
5:26
Gram Staining and Visualization
7:16
Applications
9:07
Summary
Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. All rights reserved