Gramkleuring van bacteriën uit milieubronnen

1. Steekproeven nemen

1. Verzamel grondmonsters en breng deze naar het laboratorium voor microbiologisch onderzoek.
2. Weeg in het laboratorium een monster van 10 g af met een analytische weegschaal.
3. Verdun het monster 1:10 in 95 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (10 delen grond komen overeen met 5 delen vloeibare oplossing) en vortex om te mengen (Figuur 2, Stap 1).
4. Voer vervolgende 1:10 verdunningen uit tot ten minste 10^-5 g grond per ml, en verdeel geselecteerde verdunningen in replica's van twee of drie op een medium met lage voedingsstoffen (bijv. R2A) (Figuur 2, Stappen 2-3).
5. Bewaar de platen een week lang bij kamertemperatuur (Figuur 2, Stap 4).
6. Selecteer een of twee kolonies voor isolatie en streek deze op verse agar platen (Figuur 3, Stappen 1-3).
7. Bewaar de streekplaten twee tot drie dagen bij kamertemperatuur (Figuur 3, Stap 4).

2. Voorbereiding van bacteriële uitstrijkjes

1. Observeer de streekplaten op geïsoleerde kolonies.
2. Om elk uitstrijkje voor te bereiden, dompel een inoculatielus in ethanol, steriliseer deze met vlam en plaats 1 tot 2 lusjes steriel gedistilleerd water in het midden van vooraf gereinigde glazen plaatjes.
3. Steriliseer de inoculatielus opnieuw zoals eerder beschreven. Verwijder eens de lus is afgekoeld een kleine hoeveelheid cultuur uit een enkele geïsoleerde kolonie en meng deze met de waterdruppels op het plaatje (het uitstrijkje moet op verdunde mageremelk lijken). De inoculatielus moet zijn afgekoeld voordat de kolonie wordt geïsoleerd. Een lus die te heet is, zal ervoor zorgen dat de kolonie en/of het medium spatten, wat kan leiden tot aerosolisatie van bacteriën. Over het algemeen zal er een 'sissend' geluid te horen zijn wanneer de lus wordt aangebracht op de agar of kolonie wanneer de lus te heet is voor gebruik. Onjuiste koeling van de lus kan ook leiden tot minder efficiënte overdracht van cultuur naar plaatje en vervorming van de celmorfologie.
4. Verspreid het uitstrijkje over het oppervlak van het plaatje, ongeveer 2,5 cm x 2,5 cm, en laat het aan de lucht drogen. Het is belangrijk dat het uitdrogen onder laminaire stromingscondities plaatsvindt. Plaatjes mogen niet worden uitgeblazen om verstoring van het uitstrijkje te voorkomen. Plaatjes mogen ook niet worden vlam-gedroogd om de celmorfologie te behouden.
5. Na het drogen, fixeer het uitstrijkje door het plaatje 2-3 keer snel door een vlam te halen. Het plaatje mag niet stationair in de vlam worden gehouden om vervorming van de celmorfologie en/of beschadiging van het glazen plaatje te voorkomen.

3. Gram-kleuring

1. Bevestig het plaatje aan één uiteinde met een schone klemklem.
2. Bedek het uitstrijkje met kristalviolet (primaire kleurstof) en laat 2 tot 3 min. staan.
3. Was het plaatje voorzichtig met gedistilleerd water af. De waterstraal mag niet op het uitstrijkje worden gericht om schade en/of loslating van het glazen plaatje te voorkomen.
4. Bedek het uitstrijkje met Grams jodium en laat 2 min. staan, spoel het plaatje vervolgens voorzichtig met water af.
5. Ontkleuren het uitstrijkje met 95% ethanol tot de kleurstof niet meer van het plaatje wordt gewassen (dit duurt meestal niet meer dan 20 s, afhankelijk van de dikte van het uitstrijkje), spoel vervolgens onmiddellijk af met gedistilleerd water. Deze stap is cruciaal om overontkleuring van het plaatje te voorkomen, wat kan leiden tot een valse Gram-kleuring (d.w.z. Gram-variabel).
6. Voeg de tegenkleurstof (safranine) toe aan het uitstrijkje en laat 30 s. staan. Spoel het plaatje vervolgens voorzichtig af met gedistilleerd water en droog het af met absorberend papier.

4. Microscopisch onderzoek van plaatjes

1. Observeer de plaatjes met een laag (bijv. 4X of 10X), hoog-droog (bijv. 40X) en olie-immersie (100X) objectief. Voeg voor olie-immersie de olie rechtstreeks toe aan het uitstrijkje.
2. Voor representatieve resultaten van Gram-positieve en Gram-negatieve grondbacteriën, zie Figuur 4 en Figuur 5.

Figuur 2. Verdunnings- en verspreidingstechniek op platen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3. Kolonie-isolatie met behulp van de streekplate-techniek.

.css-1yui4hs{display:-webkit-box;display:-webkit-flex;display:-ms-flexbox;display:flex;grid-column:1;min-width:0px;-webkit-order:9;-ms-flex-order:9;order:9;}@media screen and (min-width: 64rem){.css-1yui4hs{-webkit-order:8;-ms-flex-order:8;order:8;}}