1. Making the Mobile Phase
- Bereidt de mobiele fase voor door 400 mL acetonitril toe te voegen aan ongeveer 1,5 L gezuiverd DI-water.
- Voeg voorzichtig 2,4 mL glazuurzuur toe aan deze oplossing.
- Verdun de oplossing tot een totaal volume van 2,0 L in een volumetrische kolf met gezuiverd DI-water. De resulterende oplossing moet een pH hebben tussen 2,8 en 3,2.
- Stel de pH in op 4,2 door 40% natriumhydroxide toe te voegen, druppelsgewijs met behulp van een gekalibreerd digitaal pH-meter. Voeg heel langzaam toe zodra de pH 4,0 bereikt. Dit zou ongeveer 50 druppels moeten kosten.
- Filter de mobiele fase door een 0,47-µm Nylon 66-membraanfilter onder vacuüm om de oplossing te ontgassen en vaste stoffen te verwijderen die de chromatografische kolom zouden kunnen verstoppen. Het is belangrijk om de mobiele fase te ontgassen om te voorkomen dat er een bubbel ontstaat, die ofwel een lege ruimte in de stationaire fase bij de inlaat van de kolom kan veroorzaken ofwel in de detectorcel terecht kan komen, wat onstabielheid met de UV-absorptie kan veroorzaken.
2. Het maken van de componentenoplossingen
De drie componenten die gemaakt moeten worden zijn cafeïne (0,8 mg/mL), kaliumbenzoaat (1,4 mg/mL) en aspartaam (L-aspartyl-L-fenylalanine methylester) (6,0 mg/mL). Deze concentraties, eenmaal op dezelfde manier verdund, brengen de standaarden op de niveaus die in de soda-monsters worden gevonden.
- Voeg 0,40 g cafeïne toe aan een 500-mL volumetrische kolf en verdun tot de 500-mL markering met DI-water.
- Voeg 0,70 g benzoaat toe aan een 500-mL volumetrische kolf en verdun tot de 500-mL markering met DI-water.
- Voeg 0,60 g aspartaam toe aan een 100-mL volumetrische kolf en verdun tot de 100-mL markering met DI-water. Plaats deze oplossing in een koelkast om ontbinding tijdens opslag te voorkomen.
3. Het maken van de 7 standaardoplossingen
De drie componenten hebben allemaal verschillende verdelingscoëfficiënten, wat van invloed is op hoe elk met beide fasen interacteert. Hoe groter de verdelingscoëfficiënt, hoe meer tijd het component in de stationaire fase doorbrengt, wat resulteert in langere retentietijd bij het bereiken van de detector.
- Volg de tabel in Tabel 1 en pipet de juiste hoeveelheid van elke component in een 50-mL volumetrische kolf.
- Verdun elke voorraadoplossing tot de 50-mL markering op de volumetrische kolven met mobiele fase.
- Giet elke standaardoplossing in gelabelde kleine flesjes in een monsterrek.
- Bewaar de rekken met monsters in een koelkast, samen met de resterende oplossingen in de 50-mL volumetrische kolven.
4. Controle van de initiële instellingen van het HPLC-systeem
- Bevestig dat de afvoerlijn in een afvalcontainer staat en niet terugrecycleert in de mobiele fase.
- Controleer of de stromingssnelheid van de mobiele fase is ingesteld op 0,5 mL/min. Dit is hoog genoeg om alle pieken binnen 5 min te laten elueren en langzaam genoeg om een mooie resolutie mogelijk te maken.
- Controleer of de minimale en maximale druk en de stromingssnelheid zijn ingesteld op de juiste waarden op het voorpaneel van het systeem voor het leveren van oplosmiddelen (de pomp).
- Minimale drukinstelling: 250 psi (dit is om de pomp uit te schakelen, als er een lek optreedt).
- Maximale drukinstelling: 4.000 psi (dit is om de pomp te beschermen tegen breken, als er een verstopping ontstaat).
- Druk op "nul" op het voorpaneel van de detector om de blanco (de blanco is de pure mobiele fase) in te stellen.
- Spoel een 100-µL-spuit met gedeïoniseerd water en vervolgens met verschillende volumes van een van de te analyseren werkstandaarden en vul de spuit met die oplossing. Begin met de 3 enkele componenten-monsters, waardoor de piek van elke component van belang kan worden geïdentificeerd.
5. Handmatig injecteren van het monster en gegevensverzameling
- Met de injectorhendel in de laadpositie, injecteer langzaam 100 µL oplossing door de septumpoort.
- Controleer of het gegevensverzamelingprogramma is ingesteld om gegevens te verzamelen gedurende 300 s, wat voldoende tijd geeft voor alle 3 pieken om door de detector te elueren.
- Wanneer u klaar bent om de proef te starten, draai de injectorhendel naar de injectiepositie (die het monster in de mobiele fase injecteert) en klik onmiddellijk op "Start Trial" op het computergegevensverzamelingprogramma. Voor standaarden 1-3 verschijnt slechts een van de drie opeenvolgende pieken op het scherm gedurende de run (Figuur 1).
- Zodra 300 s is verstreken, stuurt de gegevensverzameling een prompt om het gegevensbestand op te slaan. Sla de gegevens op onder een geschikte bestandsnaam (bijv. STD#1).
- Noteer de tijd in seconden voor de piek van elke proef, wat wordt gebruikt bij het identificeren van die component.
- Verwijder de spuit uit het septum en herhaal het proces voor elk van de overige werkstandaarden, met dezelfde tijd per chromatogram zoals bepaald uit de eerste run.
Bron: Dr. Paul Bower - Purdue University
Hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC) is een belangrijke analytische methode die vaak wordt gebruikt om componenten van vloeibare monsters te scheiden en te kwantificeren. Bij deze techniek wordt een oplossing (eerste fase) door een kolom gepompt die een vulling van kleine poreuze deeltjes bevat met een tweede fase die aan het oppervlak is gebonden. De verschillende oplosbaarheden van de monsterscomponenten in de twee fasen zorgen ervoor dat de componenten met verschillende gemiddelde snelheden door de kolom bewegen, waardoor een scheiding van deze componenten ontstaat. De gepompte oplossing wordt de mobiele fase genoemd, terwijl de fase in de kolom de stationaire fase wordt genoemd.
Er zijn verschillende modi van vloeistofchromatografie, afhankelijk van het type stationaire en/of mobiele fase dat wordt gebruikt. Dit experiment maakt gebruik van omgekeerde fase chromatografie, waarbij de stationaire fase niet-polair is en de mobiele fase polair is. De te gebruiken stationaire fase bestaat uit C18 koolwaterstofgroepen die gebonden zijn aan 3-µm silicadeeltjes, terwijl de mobiele fase een waterige buffer is met een polair organisch modificator (acetonitril) toegevoegd om de elutiekracht te variëren. In deze vorm kan de silica worden gebruikt voor monsters die wateroplosbaar zijn, wat een breed scala aan toepassingen mogelijk maakt. In dit experiment worden de mengsels van drie componenten die vaak in dieet frisdranken worden aangetroffen (namelijk cafeïne, benzoaat en aspartaam) gescheiden. Zeven bereide oplossingen met bekende hoeveelheden van de drie soorten worden gebruikt en hun chromatogrammen worden vervolgens geregistreerd.
1. Making the Mobile Phase
- Bereidt de mobiele fase voor door 400 mL acetonitril toe te voegen aan ongeveer 1,5 L gezuiverd DI-water.
- Voeg voorzichtig 2,4 mL glazuurzuur toe aan deze oplossing.
- Verdun de oplossing tot een totaal volume van 2,0 L in een volumetrische kolf met gezuiverd DI-water. De resulterende oplossing moet een pH hebben tussen 2,8 en 3,2.
- Stel de pH in op 4,2 door 40% natriumhydroxide toe te voegen, druppelsgewijs met behulp van een gekalibreerd digitaal pH-meter. Voeg heel langzaam toe zodra de pH 4,0 bereikt. Dit zou ongeveer 50 druppels moeten kosten.
- Filter de mobiele fase door een 0,47-µm Nylon 66-membraanfilter onder vacuüm om de oplossing te ontgassen en vaste stoffen te verwijderen die de chromatografische kolom zouden kunnen verstoppen. Het is belangrijk om de mobiele fase te ontgassen om te voorkomen dat er een bubbel ontstaat, die ofwel een lege ruimte in de stationaire fase bij de inlaat van de kolom kan veroorzaken ofwel in de detectorcel terecht kan komen, wat onstabielheid met de UV-absorptie kan veroorzaken.
2. Het maken van de componentenoplossingen
De drie componenten die gemaakt moeten worden zijn cafeïne (0,8 mg/mL), kaliumbenzoaat (1,4 mg/mL) en aspartaam (L-aspartyl-L-fenylalanine methylester) (6,0 mg/mL). Deze concentraties, eenmaal op dezelfde manier verdund, brengen de standaarden op de niveaus die in de soda-monsters worden gevonden.
- Voeg 0,40 g cafeïne toe aan een 500-mL volumetrische kolf en verdun tot de 500-mL markering met DI-water.
- Voeg 0,70 g benzoaat toe aan een 500-mL volumetrische kolf en verdun tot de 500-mL markering met DI-water.
- Voeg 0,60 g aspartaam toe aan een 100-mL volumetrische kolf en verdun tot de 100-mL markering met DI-water. Plaats deze oplossing in een koelkast om ontbinding tijdens opslag te voorkomen.
3. Het maken van de 7 standaardoplossingen
De drie componenten hebben allemaal verschillende verdelingscoëfficiënten, wat van invloed is op hoe elk met beide fasen interacteert. Hoe groter de verdelingscoëfficiënt, hoe meer tijd het component in de stationaire fase doorbrengt, wat resulteert in langere retentietijd bij het bereiken van de detector.
- Volg de tabel in Tabel 1 en pipet de juiste hoeveelheid van elke component in een 50-mL volumetrische kolf.
- Verdun elke voorraadoplossing tot de 50-mL markering op de volumetrische kolven met mobiele fase.
- Giet elke standaardoplossing in gelabelde kleine flesjes in een monsterrek.
- Bewaar de rekken met monsters in een koelkast, samen met de resterende oplossingen in de 50-mL volumetrische kolven.
4. Controle van de initiële instellingen van het HPLC-systeem
- Bevestig dat de afvoerlijn in een afvalcontainer staat en niet terugrecycleert in de mobiele fase.
- Controleer of de stromingssnelheid van de mobiele fase is ingesteld op 0,5 mL/min. Dit is hoog genoeg om alle pieken binnen 5 min te laten elueren en langzaam genoeg om een mooie resolutie mogelijk te maken.
- Controleer of de minimale en maximale druk en de stromingssnelheid zijn ingesteld op de juiste waarden op het voorpaneel van het systeem voor het leveren van oplosmiddelen (de pomp).
- Minimale drukinstelling: 250 psi (dit is om de pomp uit te schakelen, als er een lek optreedt).
- Maximale drukinstelling: 4.000 psi (dit is om de pomp te beschermen tegen breken, als er een verstopping ontstaat).
- Druk op "nul" op het voorpaneel van de detector om de blanco (de blanco is de pure mobiele fase) in te stellen.
- Spoel een 100-µL-spuit met gedeïoniseerd water en vervolgens met verschillende volumes van een van de te analyseren werkstandaarden en vul de spuit met die oplossing. Begin met de 3 enkele componenten-monsters, waardoor de piek van elke component van belang kan worden geïdentificeerd.
5. Handmatig injecteren van het monster en gegevensverzameling
- Met de injectorhendel in de laadpositie, injecteer langzaam 100 µL oplossing door de septumpoort.
- Controleer of het gegevensverzamelingprogramma is ingesteld om gegevens te verzamelen gedurende 300 s, wat voldoende tijd geeft voor alle 3 pieken om door de detector te elueren.
- Wanneer u klaar bent om de proef te starten, draai de injectorhendel naar de injectiepositie (die het monster in de mobiele fase injecteert) en klik onmiddellijk op "Start Trial" op het computergegevensverzamelingprogramma. Voor standaarden 1-3 verschijnt slechts een van de drie opeenvolgende pieken op het scherm gedurende de run (Figuur 1).
- Zodra 300 s is verstreken, stuurt de gegevensverzameling een prompt om het gegevensbestand op te slaan. Sla de gegevens op onder een geschikte bestandsnaam (bijv. STD#1).
- Noteer de tijd in seconden voor de piek van elke proef, wat wordt gebruikt bij het identificeren van die component.
- Verwijder de spuit uit het septum en herhaal het proces voor elk van de overige werkstandaarden, met dezelfde tijd per chromatogram zoals bepaald uit de eerste run.
Hogedrukvloeistofchromatografie, of HPLC, is een zeer veelzijdige techniek die componenten van een vloeibare mengsel scheidt op basis van hun verschillende interacties met een stationaire fase.
HPLC is een aanpassing van kolomchromatografie. Bij kolomchromatografie is een kolom gevuld met microschaalkralen genaamd de stationaire fase. De stationaire fasekralen zijn functioneel gemaakt met chemische groepen die een interactie induceren tussen de kraal en de componenten van een mengsel dat zich in de vloeistof, of mobiele fase, bevindt. Terwijl het mengsel door de kolom stroomt, interageren de componenten anders met de stationaire fase.
Bij HPLC wordt kolomchromatografie uitgevoerd bij een hogere stroomsnelheid, en daarom hogere druk, dan klassieke kolomchromatografie. Dit maakt het gebruik mogelijk van kleinere stationaire fasekralen met een groter oppervlakte-volume-verhouding, wat de interactie van de stationaire fase en componenten in de mobiele fase aanzienlijk verhoogt.
Deze video introduceert de basisprincipes van de werking van HPLC door de scheiding van componenten van verschillende dieetfrisdranken te demonstreren.
Er zijn twee soorten HPLC die in het laboratorium worden gebruikt: analytisch en preparatief. Bij analytische HPLC wordt het instrument gebruikt om componenten van een klein volume te identificeren, en het geanalyseerde monster wordt vervolgens als afval weggegooid. Bij preparatieve HPLC wordt het instrument gebruikt om een mengsel te zuiveren en wordt een gewenste hoeveelheid van elk component verzameld in fracties.
De HPLC-instrumentatie bestaat uit een reeks eenvoudige componenten. Eerst wordt de mobiele fase, gehouden in oplosmiddelreservoirs, door één of meer pompen met een constante stroomsnelheid door het systeem gepompt. Het monster wordt in de stroom van de mobiele fase geïnjecteerd door de monsterinjector. Het monster, verdund door de mobiele fase, wordt vervolgens naar de HPLC-kolom gevoerd, waar de componenten van het monster worden gescheiden. De componenten worden vervolgens geanalyseerd door de detector, en ofwel opgeslagen in fracties voor later gebruik, ofwel overgebracht naar een afvalfles.
De HPLC-kolom is het belangrijkste onderdeel van het systeem. Het bestaat uit een metalen of plastic cilinder, gevuld met microschaalkralen van stationaire fase, of chromatografiehars. Het monstersmengsel stroomt met een constante stroomsnelheid door de verpakte deeltjesbed en elke component interageert met de stationaire fase terwijl het langsstroomt.
De verbindingen interageren anders met de stationaire fase, en reizen daarom met een andere snelheid langs de lengte van de kolom naar de detector. De tijd die nodig is voor een component om de kolom te verlaten, of elueren, wordt de retentietijd genoemd. Het resultaat is een plot van retentietijd versus intensiteit, of een chromatogram. De retentietijd wordt gebruikt om de component te identificeren. De piekgrootte, specifiek het gebied onder de piek, wordt gebruikt om de hoeveelheid van de verbinding in de initiële oplossing te kwantificeren.
De keuze van de stationaire fase hangt af van de eigenschappen van de componenten in het monstersmengsel. De meest gebruikte stationaire fase zijn silicakralen, omdat ze een inert nonpolair materiaal zijn dat microschaalkralen vormt en voldoende pakkingsdichtheid bereikt. Het meest voorkomende type HPLC is omgekeerde fase chromatografie, die een hydrofobe stationaire fase gebruikt, meestal silicakralen met C18-ketens gebonden aan het oppervlak van de kralen. De componenten worden geëlueerd in volgorde van afnemende polariteit.
De mobiele fase die wordt gebruikt in omgekeerde fase chromatografie is typisch een mengsel van water en een organisch oplosmiddel, zoals acetonitriool. Afhankelijk van het monster, kan de mobiele fase een constante verhouding van water en organisch oplosmiddel blijven, bekend als isocratische modus. Dit kan echter leiden tot brede pieken, in het geval van hoog watergehalte, of overlappende pieken in het geval van hoog organisch gehalte.
De verhouding van de mobiele fase kan ook lineair of stapsgewijs worden gewijzigd tijdens de scheiding, om een mobiele fasegradiënt te creëren. Een gradiëntelutie kan piekverbreding van de minder polaire componenten voorkomen, waardoor de scheiding wordt verbeterd en de elutietijd wordt verkort.
Nu de basisprincipes van HPLC zijn beschreven, zal de HPLC-techniek worden gedemonstreerd in het laboratorium. In dit experiment zal HPLC worden gebruikt om drie veelvoorkomende componenten van dieetfrisdranken te scheiden en te kwantificeren.
Voeg eerst 400 mL acetonitriool toe aan 1,5 L gezuiverd gedeïoniseerd water om de mobiele fase voor te bereiden. Voeg vervolgens voorzichtig 2,4 mL glazuurzuur toe. Verdun de oplossing tot een totaal volume van 2 L. De resulterende oplossing moet een pH hebben tussen 2,8 en 3,2.
Pas de pH aan tot 4,2 door 40% NaOH druppelsgewijs toe te voegen aan de roerende oplossing, met behulp van een gekalibreerd pH-meter.
Filtreer de mobiele fase door een 0,47-μm membraanfilter onder vacuüm om de oplossing te ontgassen en vaste stoffen te verwijderen die de kolom kunnen verstoppen. Het is belangrijk om de oplossing te ontgassen, omdat bellen leegtes in de stationaire fase kunnen veroorzaken, of zich een weg naar de detectorcel kunnen banen en instabiliteit in metingen kunnen veroorzaken.
Bereid drie componentenoplossingen van cafeïne, benzoaat en aspartaam voor, wat drie typische componenten van dieetfrisdranken zijn. Deze componentenoplossingen worden vervolgens gebruikt om de standaardoplossingen voor te bereiden die zullen worden gebruikt om de onbekenden te bepalen. Bereid 500 mL van de cafeïne- en benzoaatoplossing voor.
Bereid 100 mL van de aspartaamcomponentoplossing voor. Bewaar de oplossing in de koelkast wanneer deze niet wordt gebruikt om ontbinding te voorkomen.
Bereid vervolgens 7 standaardoplossingen voor, elk met verschillende concentraties cafeïne, benzoaat en aspartaam. Pipet de juiste hoeveelheid van elk component in een volumetrische kolf en verdun tot de 50-mL markering met mobiele fase.
De eerste 3 oplossingen bevatten elk één component, om piekidentificatie mogelijk te maken. De andere 4 oplossingen bevatten een
Tijdens een HPLC-experiment neemt een hogedrukpomp de mobiele fase uit een reservoir door een injector. Deze reist vervolgens door een reverse-phase C18-gevulde kolom voor componentscheiding. Ten slotte beweegt de mobiele fase naar een detectorcel, waar de absorptie wordt gemeten bij 220 nm, en eindigt in een afvalfles. De hoeveelheid tijd die een component nodig heeft om van de injectorpoort naar de detector te reizen, wordt de retentieduur genoemd.
In dit experiment wordt een vloeistofchromatograaf gebruikt, waarbij scheiding wordt uitgevoerd op een reverse-phase kolom. De kolomdimensies zijn 3 mm (i.d.) x 100 mm, en de silicavulling (3-µm deeltjesgrootte) is gefunctionaliseerd met C18 octadecylsilane (ODS). Een Rheodyne 6-poorts roterende injectieklep wordt gebruikt om de monster in een kleine lus op te slaan en introduceert het monster in de mobiele fase bij het draaien van de klep.
Detectie vindt plaats door absorptiespectroscopie bij een golflengte van 220 nm. Dit experiment kan bij 254 nm worden uitgevoerd als een detector niet variabel is. Gegevens van de detector hebben een analoog spanningsuitgang, die wordt gemeten met een digitaal multimeter (DMM) en wordt gelezen door een computer geladen met een data-acquisitieprogramma. Het resulterende chromatogram heeft een piek voor elke component in het monster. Voor dit experiment elueren alle drie de componenten binnen 5 minuten.
Dit experiment gebruikt een enkele mobiele fase en pomp, die een isocratische mobiele fase wordt genoemd. Voor monsters die moeilijk te scheiden zijn, kan een gradiënt mobiele fase worden gebruikt. Dit is wanneer de initiële mobiele fase voornamelijk een waterige is, en na verloop van tijd een tweede organische mobiele fase geleidelijk wordt toegevoegd aan de algehele mobiele fase. Deze methode verhoogt de polariteit van deze fase in de loop van de tijd, wat de retentietijden van de componenten verlaagt en werkt op een vergelijkbare manier als een temperatuurgradiënt op een gaschromatograaf. Er zijn enkele gevallen waarin de kolom wordt verwarmd (meestal tot 40 °C), wat eventuele retentietijden fouten wegneemt die geassocieerd zijn met een verandering van omgevingstemperatuur.
Bij reverse-phase HPLC is de stationaire fase vulling van de kolom meestal een C4-, C8- of C18-vulling. De C4-kolommen zijn voornamelijk voor eiwitten met grote molecuulgewichten, terwijl de C18-kolommen zijn voor peptiden en basische monsters met lagere molecuulgewichten.
Detectie door absorptiespectroscopie is overweldigend de detectiemethode bij uitstek, aangezien de absorptiespectra van de componenten allemaal gemakkelijk beschikbaar zijn. Sommige systemen gebruiken elektrochemische metingen, zoals geleidbaarheid of amperometrie, als hun detectiemethode.
Voor dit experiment is de mobiele fase voornamelijk 20% acetonitril en 80% gezuiverd gedeïoniseerd (DI) water. Een kleine hoeveelheid azijnzuur wordt toegevoegd om de pH van de mobiele fase te verlagen, wat de silanol in de stationaire vullingfase in een niet-gedissocieerde toestand houdt. Dit vermindert de adsorptiepiek van staartvorming, waardoor nauwere pieken ontstaan. Vervolgens wordt de pH aangepast met 40% natriumhydroxide om de pH te verhogen en de retentietijden van de componenten te helpen verlagen.
Elke groep gebruikt een set van de 7 flesjes met verschillende concentraties van de standaardoplossingen (Tabel 1). De eerste 3 worden gebruikt om elke piek te identificeren, en de laatste 4 zijn voor het maken van een kalibratiegrafiek voor elke component. Standaarden 1–3 worden ook gebruikt voor de kalibratiegrafiek.
| Nummer | Caffeïne (mL) | Benzoate (mL) | Aspartaam (mL) |
| 1 | 4 | 0 | 0 |
| 2 | 0 | 4 | 0 |
| 3 | 0 | 0 | 4 |
| 4 | 1 | 1 | 1 |
| 5 | 2 | 2 | 2 |
| 6 | 3 | 3 | 3 |
| 7 | 5 | 5 | 5 |
Tabel 1. Volumes van stockstandaarden die worden gebruikt om de 7 verstrekte werkstandaarden voor te bereiden (totaal volume van elke standaard is 50 mL).
De HPLC-chromatogrammen zijn in staat om elk van de 3 componenten voor alle monsters te kwantificeren op basis van de kalibratiecurven van de standaarden (Figuur 3).
Uit deze reeks experimenten werd vastgesteld dat een blikje van 12 oz van deze dieet-soda's de volgende hoeveelheden van elke component bevatte:
Diet Coke: 50,5 mg cafeïne; 217,6 mg aspartaam; 83,6 mg benzoaat.
Coke Zero: 43,1 mg cafeïne; 124,9 mg aspartaam; 85,3 mg benzoaat.
Diet Pepsi: 34,1 mg cafeïne; 184,7 mg aspartaam; 79,5 mg benzoaat.
Het is niet verrassend dat alle 3 ongeveer dezelfde hoeveelheid benzoaat bevatten, omdat het slechts een conserveermiddel is. De Coke-producten bevatten iets meer cafeïne, en de Coke Zero bevatte veel minder aspartaam dan de andere twee soda's, omdat het ook citroenzuur bevat voor wat smaak.
De volgende getallen zijn de werkelijke hoeveelheden cafeïne en aspartaam in een blikje van 12 oz van de 3 dieet-soda's (Het cafeïnegehalte werd verkregen van de Coca-Cola en Pepsi websites. Het aspartaamgehalte werd verkregen van zowel LiveStrong.com als DiabetesSelfManagement.com.):
Diet Coke: 46 mg cafeïne; 187,5 mg aspartaam
Coke Zero: 34 mg cafeïne; 87,0 mg aspartaam
Diet Pepsi: 35 mg cafeïne; 177,0 mg aspartaam
Voorbeeldboortrekingen (Tabel 2):
Concentratie van cafeïne in STD#1: De componentoplossing voor cafeïne had 0,400 g cafeïne verdund tot 500 mL = 0,500 L → 0,800 g/L = 0,800 mg/mL.
STD#1 had 1 mL van deze oplossing verdund tot 50,0 mL
0,800 mg/mL * (1,0 mL / 50,0 mL) = 0,016 mg/mL = 16,0 mg/L.
STD#2 had 2 mL van deze oplossing verdund tot 50,0 mL
0,800 mg/mL * (2,0 mL / 50,0 mL) = 0,032 mg/mL = 32,0 mg/L.
De resultaten van de drie kalibratiegrafieken (Figuur 4) leverden de volgende vergelijkingen op:
Caffeïne Piekgebied = 0,1583*[Caffeïne mg/L] - 0,574
Aspartaam Piekgebied = 0,02696*[Aspartaam mg/L] - 0,405
Benzoaat Piekgebied = 0,1363*[Benzoaat mg/L] - 1,192
Diet Coke: Caffeïne Piekgebied = 10,68 = 0,1583*[Caffeïne mg/L] - 0,574
[Caffeïne mg/L] = (10,68 + 0,574)/ (0,1583) = 71,1 mg/L in de geïnjecteerde steekproef.
Aangezien het monster met een factor 2 werd verdund, had de Diet Coke 141,2 mg/L cafeïne.
De hoeveelheid per blikje van 12 oz = (141,2 mg/L)(0,3549 mL/blikje van 12 oz) = 50,5 mg cafeïne/blikje.
Figuur 3. De HPLC-chromatogrammen van de 5 standaarden en de 3 monsters.
Figuur 4. De kalibratiecurven voor elk van de 3 componenten.
Tabel 2. De datatabellen voor de HPLC-proeven die werden gebruikt voor het genereren van de kalibratiecurven.
HPLC is een veelgebruikte techniek voor de scheiding en detectie voor vele toepassingen. Het is ideaal voor niet-vluchtige verbindingen, omdat gaschromatografie (GC) vereist dat de monsters in gasvorm zijn. Niet-vluchtige verbindingen omvatten suikers, vitaminen, geneesmiddelen en metabolieten. Ook is het niet-destructief, waardoor elke component kan worden verzameld voor verdere analyse (zoals massaspectrometrie). De mobiele fasen zijn praktisch onbeperkt, wat veranderingen in de polariteit van pH mogelijk maakt om een betere resolutie te bereiken. Het gebruik van gradiëntmobiele fasen maakt deze wijzigingen mogelijk tijdens de daadwerkelijke proeven.
Er is bezorgdheid over de mogelijke gezondheidsproblemen die mogelijk geassocieerd zijn met het kunstmatige zoetstof aspartaam. Huidige productetiketten tonen niet de hoeveelheid van deze componenten in de diëtdrankjes. Deze methode maakt het mogelijk om deze hoeveelheden te kwantificeren, samen met de cafeïne en benzoaat.
Andere toepassingen omvatten het bepalen van de hoeveelheden pesticiden in water; het bepalen van de hoeveelheid paracetamol of ibuprofen in pijnstillers; het bepalen of er prestatiebevorderende middelen aanwezig zijn in de bloedbaan van atleten; of gewoon het bepalen van de aanwezigheid van drugs in een forensisch laboratorium. Hoewel de concentraties van deze monsters, en vaak de identiteit van de componenten, gemakkelijk kunnen worden bepaald, is de enige beperking dat verschillende monsters bijna identieke retentietijden kunnen hebben, wat resulteert in co-elutie.
Videos from this collection:
Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. All rights reserved