1. Making the Mobile Phase
- Bereidt de mobiele fase voor door 400 mL acetonitril toe te voegen aan ongeveer 1,5 L gezuiverd DI-water.
- Voeg voorzichtig 2,4 mL glazuurzuur toe aan deze oplossing.
- Verdun de oplossing tot een totaal volume van 2,0 L in een volumetrische kolf met gezuiverd DI-water. De resulterende oplossing moet een pH hebben tussen 2,8 en 3,2.
- Stel de pH in op 4,2 door 40% natriumhydroxide toe te voegen, druppelsgewijs met behulp van een gekalibreerd digitaal pH-meter. Voeg heel langzaam toe zodra de pH 4,0 bereikt. Dit zou ongeveer 50 druppels moeten kosten.
- Filter de mobiele fase door een 0,47-µm Nylon 66-membraanfilter onder vacuüm om de oplossing te ontgassen en vaste stoffen te verwijderen die de chromatografische kolom zouden kunnen verstoppen. Het is belangrijk om de mobiele fase te ontgassen om te voorkomen dat er een bubbel ontstaat, die ofwel een lege ruimte in de stationaire fase bij de inlaat van de kolom kan veroorzaken ofwel in de detectorcel terecht kan komen, wat onstabielheid met de UV-absorptie kan veroorzaken.
2. Het maken van de componentenoplossingen
De drie componenten die gemaakt moeten worden zijn cafeïne (0,8 mg/mL), kaliumbenzoaat (1,4 mg/mL) en aspartaam (L-aspartyl-L-fenylalanine methylester) (6,0 mg/mL). Deze concentraties, eenmaal op dezelfde manier verdund, brengen de standaarden op de niveaus die in de soda-monsters worden gevonden.
- Voeg 0,40 g cafeïne toe aan een 500-mL volumetrische kolf en verdun tot de 500-mL markering met DI-water.
- Voeg 0,70 g benzoaat toe aan een 500-mL volumetrische kolf en verdun tot de 500-mL markering met DI-water.
- Voeg 0,60 g aspartaam toe aan een 100-mL volumetrische kolf en verdun tot de 100-mL markering met DI-water. Plaats deze oplossing in een koelkast om ontbinding tijdens opslag te voorkomen.
3. Het maken van de 7 standaardoplossingen
De drie componenten hebben allemaal verschillende verdelingscoëfficiënten, wat van invloed is op hoe elk met beide fasen interacteert. Hoe groter de verdelingscoëfficiënt, hoe meer tijd het component in de stationaire fase doorbrengt, wat resulteert in langere retentietijd bij het bereiken van de detector.
- Volg de tabel in Tabel 1 en pipet de juiste hoeveelheid van elke component in een 50-mL volumetrische kolf.
- Verdun elke voorraadoplossing tot de 50-mL markering op de volumetrische kolven met mobiele fase.
- Giet elke standaardoplossing in gelabelde kleine flesjes in een monsterrek.
- Bewaar de rekken met monsters in een koelkast, samen met de resterende oplossingen in de 50-mL volumetrische kolven.
4. Controle van de initiële instellingen van het HPLC-systeem
- Bevestig dat de afvoerlijn in een afvalcontainer staat en niet terugrecycleert in de mobiele fase.
- Controleer of de stromingssnelheid van de mobiele fase is ingesteld op 0,5 mL/min. Dit is hoog genoeg om alle pieken binnen 5 min te laten elueren en langzaam genoeg om een mooie resolutie mogelijk te maken.
- Controleer of de minimale en maximale druk en de stromingssnelheid zijn ingesteld op de juiste waarden op het voorpaneel van het systeem voor het leveren van oplosmiddelen (de pomp).
- Minimale drukinstelling: 250 psi (dit is om de pomp uit te schakelen, als er een lek optreedt).
- Maximale drukinstelling: 4.000 psi (dit is om de pomp te beschermen tegen breken, als er een verstopping ontstaat).
- Druk op "nul" op het voorpaneel van de detector om de blanco (de blanco is de pure mobiele fase) in te stellen.
- Spoel een 100-µL-spuit met gedeïoniseerd water en vervolgens met verschillende volumes van een van de te analyseren werkstandaarden en vul de spuit met die oplossing. Begin met de 3 enkele componenten-monsters, waardoor de piek van elke component van belang kan worden geïdentificeerd.
5. Handmatig injecteren van het monster en gegevensverzameling
- Met de injectorhendel in de laadpositie, injecteer langzaam 100 µL oplossing door de septumpoort.
- Controleer of het gegevensverzamelingprogramma is ingesteld om gegevens te verzamelen gedurende 300 s, wat voldoende tijd geeft voor alle 3 pieken om door de detector te elueren.
- Wanneer u klaar bent om de proef te starten, draai de injectorhendel naar de injectiepositie (die het monster in de mobiele fase injecteert) en klik onmiddellijk op "Start Trial" op het computergegevensverzamelingprogramma. Voor standaarden 1-3 verschijnt slechts een van de drie opeenvolgende pieken op het scherm gedurende de run (Figuur 1).
- Zodra 300 s is verstreken, stuurt de gegevensverzameling een prompt om het gegevensbestand op te slaan. Sla de gegevens op onder een geschikte bestandsnaam (bijv. STD#1).
- Noteer de tijd in seconden voor de piek van elke proef, wat wordt gebruikt bij het identificeren van die component.
- Verwijder de spuit uit het septum en herhaal het proces voor elk van de overige werkstandaarden, met dezelfde tijd per chromatogram zoals bepaald uit de eerste run.
Bron: Dr. Paul Bower - Purdue University
Hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC) is een belangrijke analytische methode die vaak wordt gebruikt om comp…
1. Making the Mobile Phase
- Bereidt de mobiele fase voor door 400 mL acetonitril toe te voegen aan ongeveer 1,5 L gezuiverd DI-water.
- Voeg voorzichtig 2,4 mL glazuurzuur toe aan deze oplossing.
- Verdun de oplossing tot een totaal volume van 2,0 L in een volumetrische kolf met gezuiverd DI-water. De resulterende oplossing moet een pH hebben tussen 2,8 en 3,2.
- Stel de pH in op 4,2 door 40% natriumhydroxide toe te voegen, druppelsgewijs met behulp van een gekalibreerd digitaal pH-meter. Voeg heel langzaam toe zodra de pH 4,0 bereikt. Dit zou ongeveer 50 druppels moeten kosten.
- Filter de mobiele fase door een 0,47-µm Nylon 66-membraanfilter onder vacuüm om de oplossing te ontgassen en vaste stoffen te verwijderen die de chromatografische kolom zouden kunnen verstoppen. Het is belangrijk om de mobiele fase te ontgassen om te voorkomen dat er een bubbel ontstaat, die ofwel een lege ruimte in de stationaire fase bij de inlaat van de kolom kan veroorzaken ofwel in de detectorcel terecht kan komen, wat onstabielheid met de UV-absorptie kan veroorzaken.
2. Het maken van de componentenoplossingen
De drie componenten die gemaakt moeten worden zijn cafeïne (0,8 mg/mL), kaliumbenzoaat (1,4 mg/mL) en aspartaam (L-aspartyl-L-fenylalanine methylester) (6,0 mg/mL). Deze concentraties, eenmaal op dezelfde manier verdund, brengen de standaarden op de niveaus die in de soda-monsters worden gevonden.
- Voeg 0,40 g cafeïne toe aan een 500-mL volumetrische kolf en verdun tot de 500-mL markering met DI-water.
- Voeg 0,70 g benzoaat toe aan een 500-mL volumetrische kolf en verdun tot de 500-mL markering met DI-water.
- Voeg 0,60 g aspartaam toe aan een 100-mL volumetrische kolf en verdun tot de 100-mL markering met DI-water. Plaats deze oplossing in een koelkast om ontbinding tijdens opslag te voorkomen.
3. Het maken van de 7 standaardoplossingen
De drie componenten hebben allemaal verschillende verdelingscoëfficiënten, wat van invloed is op hoe elk met beide fasen interacteert. Hoe groter de verdelingscoëfficiënt, hoe meer tijd het component in de stationaire fase doorbrengt, wat resulteert in langere retentietijd bij het bereiken van de detector.
- Volg de tabel in Tabel 1 en pipet de juiste hoeveelheid van elke component in een 50-mL volumetrische kolf.
- Verdun elke voorraadoplossing tot de 50-mL markering op de volumetrische kolven met mobiele fase.
- Giet elke standaardoplossing in gelabelde kleine flesjes in een monsterrek.
- Bewaar de rekken met monsters in een koelkast, samen met de resterende oplossingen in de 50-mL volumetrische kolven.
4. Controle van de initiële instellingen van het HPLC-systeem
- Bevestig dat de afvoerlijn in een afvalcontainer staat en niet terugrecycleert in de mobiele fase.
- Controleer of de stromingssnelheid van de mobiele fase is ingesteld op 0,5 mL/min. Dit is hoog genoeg om alle pieken binnen 5 min te laten elueren en langzaam genoeg om een mooie resolutie mogelijk te maken.
- Controleer of de minimale en maximale druk en de stromingssnelheid zijn ingesteld op de juiste waarden op het voorpaneel van het systeem voor het leveren van oplosmiddelen (de pomp).
- Minimale drukinstelling: 250 psi (dit is om de pomp uit te schakelen, als er een lek optreedt).
- Maximale drukinstelling: 4.000 psi (dit is om de pomp te beschermen tegen breken, als er een verstopping ontstaat).
- Druk op "nul" op het voorpaneel van de detector om de blanco (de blanco is de pure mobiele fase) in te stellen.
- Spoel een 100-µL-spuit met gedeïoniseerd water en vervolgens met verschillende volumes van een van de te analyseren werkstandaarden en vul de spuit met die oplossing. Begin met de 3 enkele componenten-monsters, waardoor de piek van elke component van belang kan worden geïdentificeerd.
5. Handmatig injecteren van het monster en gegevensverzameling
- Met de injectorhendel in de laadpositie, injecteer langzaam 100 µL oplossing door de septumpoort.
- Controleer of het gegevensverzamelingprogramma is ingesteld om gegevens te verzamelen gedurende 300 s, wat voldoende tijd geeft voor alle 3 pieken om door de detector te elueren.
- Wanneer u klaar bent om de proef te starten, draai de injectorhendel naar de injectiepositie (die het monster in de mobiele fase injecteert) en klik onmiddellijk op "Start Trial" op het computergegevensverzamelingprogramma. Voor standaarden 1-3 verschijnt slechts een van de drie opeenvolgende pieken op het scherm gedurende de run (Figuur 1).
- Zodra 300 s is verstreken, stuurt de gegevensverzameling een prompt om het gegevensbestand op te slaan. Sla de gegevens op onder een geschikte bestandsnaam (bijv. STD#1).
- Noteer de tijd in seconden voor de piek van elke proef, wat wordt gebruikt bij het identificeren van die component.
- Verwijder de spuit uit het septum en herhaal het proces voor elk van de overige werkstandaarden, met dezelfde tijd per chromatogram zoals bepaald uit de eerste run.
Hogedrukvloeistofchromatografie, of HPLC, is een zeer veelzijdige techniek die componenten van een vloeibare mengsel scheidt op basis van hun verschillende interacties met een stationaire fase.
HPLC is een aanpassing van kolomchromatografie. Bij kolomchromatografie is een kolom gevuld met microschaalkralen genaamd de stationaire fase. De stationaire fasekralen zijn functioneel gemaakt met chemische groepen die een interactie induceren tussen de kraal en de componenten van een mengsel dat zich in de vloeistof, of mobiele fase, bevindt. Terwijl het mengsel door de kolom stroomt, interageren de componenten anders met de stationaire fase.
Bij HPLC wordt kolomchromatografie uitgevoerd bij een hogere stroomsnelheid, en daarom hogere druk, dan klassieke kolomchromatografie. Dit maakt het gebruik mogelijk van kleinere stationaire fasekralen met een groter oppervlakte-volume-verhouding, wat de interactie van de stationaire fase en componenten in de mobiele fase aanzienlijk verhoogt.
Deze video introduceert de basisprincipes van de werking van HPLC door de scheiding van componenten van verschillende dieetfrisdranken te demonstreren.
Er zijn twee soorten HPLC die in het laboratorium worden gebruikt: analytisch en preparatief. Bij analytische HPLC wordt het instrument gebruikt om componenten van een klein volume te identificeren, en het geanalyseerde monster wordt vervolgens als afval weggegooid. Bij preparatieve HPLC wordt het instrument gebruikt om een mengsel te zuiveren en wordt een gewenste hoeveelheid van elk component verzameld in fracties.
De HPLC-instrumentatie bestaat uit een reeks eenvoudige componenten. Eerst wordt de mobiele fase, gehouden in oplosmiddelreservoirs, door één of meer pompen met een constante stroomsnelheid door het systeem gepompt. Het monster wordt in de stroom van de mobiele fase geïnjecteerd door de monsterinjector. Het monster, verdund door de mobiele fase, wordt vervolgens naar de HPLC-kolom gevoerd, waar de componenten van het monster worden gescheiden. De componenten worden vervolgens geanalyseerd door de detector, en ofwel opgeslagen in fracties voor later gebruik, ofwel overgebracht naar een afvalfles.
De HPLC-kolom is het belangrijkste onderdeel van het systeem. Het bestaat uit een metalen of plastic cilinder, gevuld met microschaalkralen van stationaire fase, of chromatografiehars. Het monstersmengsel stroomt met een constante stroomsnelheid door de verpakte deeltjesbed en elke component interageert met de stationaire fase terwijl het langsstroomt.
De verbindingen interageren anders met de stationaire fase, en reizen daarom met een andere snelheid langs de lengte van de kolom naar de detector. De tijd die nodig is voor een component om de kolom te verlaten, of elueren, wordt de retentietijd genoemd. Het resultaat is een plot van retentietijd versus intensiteit, of een chromatogram. De retentietijd wordt gebruikt om de component te identificeren. De piekgrootte, specifiek het gebied onder de piek, wordt gebruikt om de hoeveelheid van de verbinding in de initiële oplossing te kwantificeren.
De keuze van de stationaire fase hangt af van de eigenschappen van de componenten in het monstersmengsel. De meest gebruikte stationaire fase zijn silicakralen, omdat ze een inert nonpolair materiaal zijn dat microschaalkralen vormt en voldoende pakkingsdichtheid bereikt. Het meest voorkomende type HPLC is omgekeerde fase chromatografie, die een hydrofobe stationaire fase gebruikt, meestal silicakralen met C18-ketens gebonden aan het oppervlak van de kralen. De componenten worden geëlueerd in volgorde van afnemende polariteit.
De mobiele fase die wordt gebruikt in omgekeerde fase chromatografie is typisch een mengsel van water en een organisch oplosmiddel, zoals acetonitriool. Afhankelijk van het monster, kan de mobiele fase een constante verhouding van water en organisch oplosmiddel blijven, bekend als isocratische modus. Dit kan echter leiden tot brede pieken, in het geval van hoog watergehalte, of overlappende pieken in het geval van hoog organisch gehalte.
De verhouding van de mobiele fase kan ook lineair of stapsgewijs worden gewijzigd tijdens de scheiding, om een mobiele fasegradiënt te creëren. Een gradiëntelutie kan piekverbreding van de minder polaire componenten voorkomen, waardoor de scheiding wordt verbeterd en de elutietijd wordt verkort.
Nu de basisprincipes van HPLC zijn beschreven, zal de HPLC-techniek worden gedemonstreerd in het laboratorium. In dit experiment zal HPLC worden gebruikt om drie veelvoorkomende componenten van dieetfrisdranken te scheiden en te kwantificeren.
Voeg eerst 400 mL acetonitriool toe aan 1,5 L gezuiverd gedeïoniseerd water om de mobiele fase voor te bereiden. Voeg vervolgens voorzichtig 2,4 mL glazuurzuur toe. Verdun de oplossing tot een totaal volume van 2 L. De resulterende oplossing moet een pH hebben tussen 2,8 en 3,2.
Pas de pH aan tot 4,2 door 40% NaOH druppelsgewijs toe te voegen aan de roerende oplossing, met behulp van een gekalibreerd pH-meter.
Filtreer de mobiele fase door een 0,47-μm membraanfilter onder vacuüm om de oplossing te ontgassen en vaste stoffen te verwijderen die de kolom kunnen verstoppen. Het is belangrijk om de oplossing te ontgassen, omdat bellen leegtes in de stationaire fase kunnen veroorzaken, of zich een weg naar de detectorcel kunnen banen en instabiliteit in metingen kunnen veroorzaken.
Bereid drie componentenoplossingen van cafeïne, benzoaat en aspartaam voor, wat drie typische componenten van dieetfrisdranken zijn. Deze componentenoplossingen worden vervolgens gebruikt om de standaardoplossingen voor te bereiden die zullen worden gebruikt om de onbekenden te bepalen. Bereid 500 mL van de cafeïne- en benzoaatoplossing voor.
Bereid 100 mL van de aspartaamcomponentoplossing voor. Bewaar de oplossing in de koelkast wanneer deze niet wordt gebruikt om ontbinding te voorkomen.
Bereid vervolgens 7 standaardoplossingen voor, elk met verschillende concentraties cafeïne, benzoaat en aspartaam. Pipet de juiste hoeveelheid van elk component in een volumetrische kolf en verdun tot de 50-mL markering met mobiele fase.
De eerste 3 oplossingen bevatten elk één component, om piekidentificatie mogelijk te maken. De andere 4 oplossingen bevatten een
Q1: How does HPLC separate components in a liquid mixture?
HPLC separates components based on their different interactions with a stationary phase. A liquid mobile phase is pumped through a column packed with small beads of stationary phase. Components interact differently with these beads and travel through the column at different rates, causing separation. The time each component takes to exit the column, called retention time, identifies the component.
Q2: What is the difference between analytical and preparative HPLC?
Analytical HPLC identifies components in a small sample volume, which is then discarded as waste. Preparative HPLC purifies a mixture and collects a desired amount of each component in fractions for later use. Both use the same separation principle but differ in their purpose and sample handling after analysis.
Q3: Why is degassing the mobile phase important in HPLC?
Degassing removes dissolved gases from the mobile phase before it enters the column. Bubbles in the mobile phase can create voids in the stationary phase or travel to the detector cell, causing measurement instability. Filtering the mobile phase through a membrane filter under vacuum effectively removes gases and solid particulates that could clog the column.
Q4: What does the chromatogram tell you about separated components?
A chromatogram plots retention time versus signal intensity. The retention time identifies each component, while the peak area quantifies the amount of compound in the original solution. By correlating peak areas to known concentrations using calibration curves principles and applications, you can determine unknown sample concentrations.
Q5: What is reversed-phase chromatography and when is it used?
Reversed-phase chromatography uses a hydrophobic stationary phase, typically silica beads with C18 chains bonded to the surface, paired with a polar mobile phase of water and organic solvent like acetonitrile. Components elute in order of decreasing polarity. This is the most common HPLC mode and works well for water-soluble samples.
Q6: How does gradient elution improve HPLC separation?
Gradient elution changes the mobile phase ratio linearly or stepwise during separation, increasing the organic solvent concentration over time. This prevents peak broadening of less polar components that occurs with constant isocratic conditions, thereby improving separation quality and shortening elution time for complex mixtures.
Q7: Why are smaller stationary phase beads used in HPLC compared to column chromatography?
HPLC operates at higher flow rates and pressures than classical column chromatography, enabling the use of smaller stationary phase beads. These micro-scale beads have a greater surface area to volume ratio, which greatly increases interaction between the stationary phase and sample components, improving separation efficiency and resolution.
Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. All rights reserved