Gebruik van een hemacytometer voor het tellen van cellen

Cel telling is een belangrijke stap in veel celgebaseerde assays om het aantal cellen en de levensvatbaarheid te bepalen. In het algemeen is het doel van het tellen om vast te stellen in welke mate een monster met een onbekende celconcentratie moet worden verdund voor verder gebruik. Het meest gebruikte laboratoriuminstrument voor het tellen van cellen is de hemocytometer.

De hemocytometer is een telinstrument dat oorspronkelijk is ontwikkeld voor het tellen van bloedcellen. In het midden van de hemocytometer bevinden zich twee telkamers, waarin een met laser geëtst raster is aangebracht.

Het raster bestaat uit 9 hoofdkvadranten. De vier hoekkvadranten zijn verder onderverdeeld in 16 kleinere kwadranten. Het centrale kwadrant is verdeeld in 25 van deze kleinere kwadranten, die elk nogmaals zijn onderverdeeld in 16 micro-kwadranten.

Aan het uiteinde van elke kamer bevinden zich poorten voor monsterintroductie, waarin het te tellen celmonster wordt aangebracht.

Aan weerszijden van de telkamers bevinden zich de steunen voor het dekglas, waarop het kwartshadekglas rust, meestal ongeveer 0.1 mm boven de telkamer.

Aangezien de oppervlakte van elk groot vierkant 1 mm2 is, is het volume van elk groot vierkant 0.1 mm3 of 1/10.000ste van een ml.

Neem voor het tellen altijd even de tijd om met ethanol en een kimwipe eventuele pluisjes, vingerafdrukken of watervlekken van het dekglas en de telkamer te verwijderen en te drogen.

Voeg vervolgens voorzichtig een kleine hoeveelheid water toe aan elke montagehouder van het dekglas; de oppervlaktespanning van het water houdt het dekglas op zijn plaats.

Tritureer nu voorzichtig de celsuspensie, of pipetteer deze op en neer, om eventuele celklontjes los te maken. Gebruik een micropipet om ongeveer 10 μl van de suspensie op te nemen en vul vervolgens een van de vulpoorten met de monsteroplossing. De oplossing wordt door capillaire werking in de telkamer getrokken en moet het gehele raster bedekken.

Terwijl de cellen bezinken, selecteert u het objectief. Plaats daarna de hemacytometer op de objecttafel.

Bekijk vervolgens de cellen onder de microscoop. Als er minder dan 5 cellen in elk van de grote kwadranten aanwezig zijn, moet u het monster mogelijk opnieuw centrifugeren en het pellet resuspenderen in een kleiner volume. Als de cellen elkaar overlappen of simpelweg te dicht op elkaar zitten om ze gemakkelijk van elkaar te onderscheiden, moet u het monster mogelijk verdunnen in een groter volume oplossing. Houd nauwkeurig bij met welke factor u de cellen verdunt; u heeft dit nodig voor een latere berekening.

Nu is het tijd om de cellen te tellen!

Zoals we eerder hebben besproken, is de telkamer voorzien van een lasergeëtst raster. De lijnen van de kwadranten maken het gemakkelijker om de cellen die u telt bij te houden. Kies de grootte van het kwadrant voor het tellen op basis van de dichtheid van de cellen in uw monster. Als er bijvoorbeeld een laag aantal cellen aanwezig is, telt u alle cellen in een van de hoekkwadranten. Voor monsters met een gemiddelde hoeveelheid cellen kiest u een van de 16 kleinere kwadranten. Bij een zeer hoge celldichtheid telt u de cellen in een van de 25 centrale kwadranten. Ongeacht welk kwadrant u kiest of de dichtheid van het celmonster, telt u ten minste 20-50 cellen per kwadrant.

Niet alle cellen zullen netjes binnen de kwadranten vallen. U kunt de cellen tellen die de bovenste en linkerlijnen raken, maar negeer de cellen die de onderste of rechterlijnen raken. Voor de meest nauwkeurige telling gebruikt u een celteller om de cellen bij te houden en neemt u het gemiddelde van het aantal cellen in 4 kwadranten van dezelfde grootte.

Om het aantal cellen in een volume van 1 ml te berekenen, vermenigvuldigt u het aantal getelde cellen met 10.000, omdat, zoals we eerder hebben vermeld, elk groot vierkant op het raster 1/10.000ste van een ml is. Als u een van deze grotere kwadranten hebt geteld, vermenigvuldigt u dit getal simpelweg met 1. Als u een van de kleinere vierkantjes in een van de hoekkwadranten hebt geteld, vermenigvuldigt u dit getal met 16. Als u alle cellen in een van de 25 centrale kwadranten hebt geteld, vermenigvuldigt u dit getal met 25. Mocht u uw celsuspensie hebben verdund voordat u de hemocytometer vulde, dan moet u ook vermenigvuldigen met de verdunningsfactor.

Om vervolgens het aantal cellen in 1 ml van dit monster te berekenen, vermenigvuldigen we de 20 cellen in dit centrale kwadrant met 10⁴ en 25, om uit te komen op een totaal van 5 x 10⁶ cellen in 1 ml van het monster.

Nu we het totale aantal cellen in 1 ml van het monster weten, moeten we dit getal vermenigvuldigen met het totale volume van onze oplossing. Dus als we bijvoorbeeld 5 x 10⁶ cellen in 1 ml hebben, dan hebben we in 2 ml een totaal van 1 x 10⁷ cellen.

Vul vervolgens de andere zijde van de kamer om fouten door verkeerd tellen, ongelijkmatige distributie van cellen of pipetteerfouten te voorkomen, en tel uw celmonster voor een tweede keer.

Het tellen van de cellen onder de microscoop is ook een uitgelezen moment om de viabiliteit van de cellen in uw monster te evalueren. Trypaanblauw, een vitale kleurstof, wordt voor dit doel vaak met het monster gemengd voordat het in de hemocytometer wordt geladen.

Levende cellen sluiten deze kleurstof uit, omdat levende cellen zeer selectief zijn over wat zij door hun membranen laten passeren. Een dode cel heeft echter geen intact membraan, waardoor het trypaanblauw kan binnendringen en het cytoplasma kleurt.

Om de viabiliteit van uw celmonster te controleren, verdunt u een aliquot van uw celsuspensie in trypaanblauw en laadt u het met trypaanblauw gekleurde monster vervolgens op dezelfde wijze als het reguliere celmonster. Onder fasecontrast zullen de levende cellen helder en goudkleurig verschijnen en moeten deze worden geteld; tel de doffe, dode, blauwe cellen niet mee.

Bereken het aantal cellen zoals voorheen, maar vermenigvuldig ditmaal het eindgetal met de verdunningsfactor van het trypaanblauw. Als ons oorspronkelijke representatieve monster dus eerst was verdund in trypaanblauw, zouden we het totale aantal cellen vermenigvuldigen met onze 1:10 trypaanblauw-verdunning, wat neerkomt op een totaal van 1x108 cellen in ons monster.

Vergeet na het tellen niet om het dekglas en de telkamer te reinigen!

Nu u een expert bent in het tellen van cellen, bespreken we enkele redenen waarom het belangrijk kan zijn om te weten hoeveel cellen u heeft in een specifiek experiment.

Na het isoleren van cellen uit een normaal of experimenteel weefsel is het essentieel om te weten hoeveel cellen er zijn teruggewonnen. In dit geval willen de onderzoekers weten hoeveel splenocyten, of miltcellen, zij hebben geïsoleerd uit deze muizmilt.

Wanneer u een experiment uitvoert om te zien hoe twee verschillende celpopulaties reageren, is het belangrijk om te weten hoeveel van elk celtype u mengt, zoals in dit co-cultuurexperiment met B- en T-cellen.

U wilt weten hoeveel cellen u heeft voor veel andere soorten celgebaseerde assays. Hier wordt een ELISPOT-assay opgezet om het aantal cellen in een monster te bepalen dat IFNγ, een inflammatoir eiwit, zal secreteren als reactie op het humane papillomavirus.

Bij het uitvoeren van een experiment waarbij mRNA uit de cellen van belang moet worden geëxtraheerd of geïsoleerd, is het belangrijk om te weten met hoeveel cellen u begint, om een voldoende hoeveelheid mRNA voor het experiment te verkrijgen.

De hemocytometer is een goedkoop en relatief eenvoudig te gebruiken instrument voor het tellen van cellen, maar het kan tijdrovend zijn en is gevoelig voor menselijke fouten.

De Scepter Handheld Automatic Counter is, zoals de naam al zegt, een handmatig telapparaat met een verbeterde telnauwkeurigheid vergeleken met de hemocytometer, dat zowel de grootte als het volume van de cellen in een celmonster kan differentiëren.

De TC10 automatische celsteller evalueert zowel het celaantal als de levensvatbaarheid, berekent automatisch het totale aantal cellen in uw monster en maakt het mogelijk om de cellen ook op het display te bekijken.

U heeft zojuist de inleiding over cel telling van JoVE bekeken. In deze video hebben we besproken: wat een hemocytometer is, hoe u cellen telt en de cellevensvatbaarheid bepaalt, en enkele verschillende redenen waarom het tellen van cellen noodzakelijk kan zijn. Bedankt voor het kijken en vergeet niet om de blauwe cellen niet mee te tellen!