Het gebruik van Drip Flow en roterende schijf reactoren voor Staphylococcus aureus Biofilm Analyse
27 december 2010
Protocollen voor het gebruik van open systeem stroom biofilms met drip stroom reactoren en roterende schijf reactoren worden in detail.
Het algemene doel van deze procedure is om bacteriële biofilms te laten groeien onder lage of matige schuifkrachten met behulp van een druppelstroom biofilmreactor of een roterende schijfreactor. Coupons in de biofilm reageren als eerste worden geïnoculeerd met bacteriën en geïncubeerd bij 37 graden Celsius om de bacteriële cellen aan de groeioppervlakken te laten hechten. Zodra de cellen zich aan de coupons hebben gehecht, wordt een stroom van groeimedia gestart waardoor een schuifkracht ontstaat die tijdens de ontwikkeling van de biofilm werkt.
Volwassen biofilms kunnen vervolgens worden geoogst voor analyse en observatie van de biofilms. Met behulp van scanning elektronenmicroscopie kan de ultrastructuur van de geproduceerde biofilms worden bepaald. Ik ben Blaze Balls.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals flow cellen is dat hoge biomassaproductie en meerdere identieke biofilms gemakkelijk kunnen worden bereikt. Rachel Stevenson en Kelly Schwartz, een technicus en afgestudeerde student uit mijn laboratorium, zullen deze procedure demonstreren. De druppelstroom biofilmreactor bestaat uit vier kamers met invoerpoorten voor media-invoer en uitvoerpoorten voor afvoer van afval.
In elke kamer zit een verwijderbare coupon waarop de biofilm groeit. Om de druppelstroom biofilmreactor samen te stellen, plaatst u de coupons in elke parallelle kamer en bevestigt u de kamerdeksels. Steriliseer het geassembleerde reactor evenals de inkomende nutriëntenbuis door de reactor te autoclaven voor gebruik.
Steriliseer ook het biofilm groeimedium om de gesteriliseerde druppelstroom reactor te inoculeren. Plaats het apparaat op een vlakke ondergrond en klem de uitlaatlijnen vast. Vul vervolgens elke kamer met 10 milliliter steriel tryptische sojabouillon op basis van groeimedium en voeg 100 microliter staphylococcus aureus toe.
Kweek de overnachtcultuur in hetzelfde medium in elke kamer afzonderlijk. Plaats de geïnoculeerde reactor in een 37 graden Celsius incubator gedurende 18 uur om de cellen aan het couponoppervlak te laten hechten. Na de incubatie klemt u de uitlaatbuising af en plaatst u de reactor op een hellend houten blok om een hoek van 10 graden. Aseptiek.
Verbind de nutriëntenbuis met een fles die continu stromende nutriëntenbouillon bevat. Leid de slang door de pomp en zet de slang aan door de pomp op volle snelheid te laten draaien. Zodra de nutriëntenslang is geprimed, stopt u de pomp en bevestigt u 22 gauge een inch naalden aan het uiteinde van elke buis.
Veeg de kamerinlaatstop af met een ethanoldoekje en aseptiek. Steek de naalden door de inlaatstop. Zet de pomp aan en laat het medium over de coupons druppelen.
Bij een stromingssnelheid van ongeveer 125 microliter per minuut, zou het medium vanaf de inlaatstoppoort naar de uitlaatpoort moeten stromen. Laat de reactor drie dagen lang continu stromen. Controleer af en toe de reactor op correcte afvoer.
De afvoer wordt gecontroleerd door visuele inspectie van de kamers om ervoor te zorgen dat het medium zich niet verzamelt in de kamers. Als het medium zich verzamelt, zal het knijpen, het afvoerbuisje meestal een goede afvoer bevorderen om de biofilms te oogsten, stop de pomp en verwijder de naalden uit de reactor. Plaats vervolgens de reactor op een vlak oppervlak.
Na drie dagen van continue stroming verschijnen staphylococcus aureus biofilms als gele biomassa verspreid over de lengte van de geïnoculeerde coupons. Een scanning elektronenmicrograaf van de biofilm onthult staphylococcus aureus die de coupon bedekt in een oppervlakte-geassocieerde biofilmgemeenschap. Om de verkregen biomassa te kwantificeren, gebruikt u steriele pincetten om de coupons asseptiek te verwijderen, de bacteriën te verzamelen met een celschraper en vervolgens over te brengen naar een conische buis met vijf milliliter steriele PBS.
Gebruik een weefselhomogenisator om de bacterieklompjes te desintegreren totdat een uniforme suspensie is verkregen. Kolonievormende eenheden worden gekwantificeerd door seriële verdunningen op tryptische sojaagar platen te plateren, 24 uur bij 37 graden Celsius te incuberen en kolonies te tellen. De roterende schijfbiofilmreactor bestaat uit een chemostaat waardoor groeimedium wordt gepompt.
Een draaiende schijf met een staartbar en 18 coupons die zijn ontworpen om in de draaiende schijf te passen. Om de reactor samen te stellen, laadt u eerst de draaiende schijfcoupons in de gleuven van de draaiende schijf. Plaats vervolgens de geladen schijf in een glazen beker van één liter met een overlooppoort en sluit u de reactor af met een nummer 15 rubberen stop met één gat voor mediastroming en één gat voor beluchting.
Autoclaveer de geassembleerde reactor en de inlaatbuis om het systeem te steriliseren. Om de reactor te inoculeren, vult u de beker met 250 milliliter steriel kweekmedium en voegt u 500 microliter van een overnachtcultuur van staphylococcus aureus toe die is gekweekt in tryptische sojabouillon. Plaats de reactor op een roerplaat ingesteld op 250 rotaties per minuut en incubeer deze een nacht bij 37 graden Celsius om de cellen aan de coupons te laten hechten.
Verbind na de overnachtelijke incubatie de inlaatbuis met de poort op het mediareservoir en met de peristaltische pomp. Zet de pomp aan en stel de stroming in op 0,25 milliliter per minuut. Laat de reactor 24 uur bij 37 graden Celsius draaien om de resulterende biofilms te oogsten.
Stop de reactor en aseptiek. Verwijder de schijf zonder de coupons aan te raken. Gebruik steriele pincetten om de coupons te verwijderen en dompel elk voorzichtig in steriele PBS om losjes gehechte bacteriën te verwijderen voor antimicrobiële verbindingentesten.
Aseptiek plaatst u de coupons in afzonderlijke putjes van een 96-wellsplaat met verbindingen van belang. Incubeer de plaat vier uur bij 37 graden Celsius. Breng vervolgens de coupons over in 1,5 milliliter microcentrifugebuisjes met eenmaal PBS en verspreid de biofilms met behulp van een homogenisator.
Plateer tenslotte seriële verdunningen van de cellen op voedingsagarmedium om het aantal levensvatbare kolonievormende eenheden per monster te bepalen zoals eerder beschreven. Deze grafiek toont het aantal kolonievorm
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert protocollen voor het kweken van bacteriële biofilms met behulp van druppelstroomreactoren en roterende schijfreactoren. De procedures beschrijven in detail het inoeculeren van coupons met bacteriën en de daaropvolgende ontwikkeling van biofilms onder gecontroleerde schuifkrachten.
Belangrijke onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Microbiologie
- Biofilm Engineering
- Biotechnologie
Achtergrond
- Bacteriele biofilms zijn complexe gemeenschappen die zich hechten aan oppervlakken.
- Het begrijpen van biofilmontwikkeling is cruciaal voor verschillende toepassingen.
- Schuifkrachten beïnvloeden de structuur en functie van biofilms.
- Verschillende reactorontwerpen kunnen de grodynamiek van biofilms beïnvloeden.
Doel van het onderzoek
- Om gedetailleerde protocollen voor biofilmgroei te bieden.
- Om de effectiviteit van druppelstroom- en roterende schijfreactoren te vergelijken.
- Om de analyse van volwassen biofilms te vergemakkelijken.
Gebruikte methoden
- Inoeculeren van coupons met bacteriële cellen.
- Incubatie bij 37 graden Celsius voor aanhechting.
- Doorstroming van groeimedia om schuifkrachten te creëren tijdens ontwikkeling.
- Scannende elektronenmicroscopie voor biofilmanalyse.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle groei van bacteriële biofilms onder gespecificeerde omstandigheden.
- Vergelijking van biofilmstructuren van verschillende reactortypen.
- Inzichten in de effecten van schuifkracht op de morfologie van biofilms.
- Gedetailleerde beeldvorming van biofilms met behulp van elektronenmicroscopie.
Conclusies
- De beschreven protocollen zijn effectief voor biofilmonderzoek.
- Reactorkeuze heeft een significante invloed op biofilmkenmerken.
- Verdere studies kunnen op deze methoden voortbouwen voor geavanceerde toepassingen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Robust biofilm models are essential for evaluating antimicrobial strategies and material performance in pharmaceutical and biotechnology R&D. Drip flow and rotating disk reactors enable reproducible, high-biomass Staphylococcus aureus biofilm formation under controlled shear, supporting predictive confidence in compound screening and device testing. These systems address critical early discovery and preclinical inflection points by standardizing biofilm growth for downstream quantitative analysis.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of antimicrobial hypotheses in disease-relevant biofilm models.
- Supports functional validation of anti-biofilm targets and materials.
- Facilitates mechanistic de-risking by controlling shear and growth conditions.
- Provides reproducible platforms for portfolio triage of candidate compounds.
Screening & Assay Development
- Generates standardized, high-biomass biofilms for quantitative compound evaluation.
- Enables parallel production of identical biofilm samples for reproducibility.
- Supports scalable screening of antimicrobial efficacy and material performance.
- Delivers quantitative outputs such as colony forming units for assay comparability.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro biofilm models with clinically relevant device and material testing.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation of anti-biofilm strategies.
- Supports risk-adjusted advancement of candidates based on robust biofilm challenge data.
- Provides mechanistic insight into biofilm resilience and removal under defined shear.
Pipeline & Workflow Integration
Drip flow and rotating disk reactors position biofilm analysis from early discovery through preclinical evaluation, bridging hypothesis testing, screening, and translational research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven testing of antimicrobial and anti-fouling interventions in controlled biofilm systems.
- Screening: Provides reproducible, quantitative biofilm assays for compound and material evaluation.
- Analytics: Enables measurement of colony forming units and biofilm biomass for comparative analysis.
- Translational Research: Facilitates alignment with device and material testing relevant to clinical applications.
- Enterprise Reuse: Offers standardized, scalable platforms for repeated use across R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in anti-biofilm efficacy and material performance.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable biofilm production workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in anti-infective and device portfolios.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of candidates based on robust biofilm data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in aseptic technique and biofilm quantification.
- Needs access to specialized reactors, incubators, and analytical tools such as homogenizers and microscopy.
- Demands cross-team standardization of protocols for reproducibility.
- Adaptable to various coupon materials and device-relevant surfaces.
- Limited to in vitro modeling; translation to in vivo systems requires further validation.
