Name: Het gebruik van Drip Flow en roterende schijf reactoren voor Staphylococcus aureus Biofilm Analyse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-27T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Leer biofilmkweek met drip flow- en roterende schijfreactoren voor microbiologisch onderzoek met Staphylococcus aureus. Deze methoden produceren hoge biomassa voor antimicrobiële testen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

NIAID verlenen K22AI081748.

1. De Druppel Flow Biofilm Reactor <ol><li> Het infuus stroom biofilm reactor (verkrijgbaar bij Biosurface Technologies of op maat gemaakte versies kunnen meestal worden gedaan door de universiteit machine winkels, zie figuur 1) is gemonteerd en geautoclaveerd. Vergadering gaat om het aanbrengen van coupons in kamers en het veiligstellen van kamer deksels. De kamer, samen met biofilm medium (tryptische soja-bouillon 2 gram / L en glucose 2 gram / L) en de invloedrijke voedingsstoffen buizen worden in de autoclaaf. </li><li> Enten van het infuus stroming reactor is voorgevormd door het plaatsen van de reactor op een vlakke ondergrond, klem het effluent buis lijnen, het vullen van elke kamer met 10 ml tryptische soja bouillon en het toevoegen van 10 pi van een S. aureus cultuur 's nachts gegroeid in tryptische soja bouillon. De geïnoculeerde reactor wordt vervolgens plaats in een 37 ° C incubator gedurende 18 uur. </li><li> Na 18 uur incubatie, is het effluent buizen ontspannen is en de reactor wordt geplaatst op een houten blok gesneden een 10 ° hoek. </li><li> Aseptisch sluit de influent voedingsstoffen slang aan op de fles met de continue stroom voedingsstoffen bouillon. Voer de slang lijn door de pomp en de eerste de buizen door het uitvoeren van de pomp met een maximale snelheid (afhankelijk van model pomp). </li><li> Zodra het influent slang gevuld stopt de pomp en hechten sluit naalden (22 gauge, 1 inch) aan het einde van elke buis. Veeg de kamer inlaat stop met een veeg ethanol en aseptisch de naalden te voegen via de inlaat stop. </li><li> Zet de pomp en laat de media langzaam te druppelen (debiet ~ 125 pL / minuut) over de coupons. De media moet neerwaartse stroming langs de coupon van de inlaat stop-poort aan de effluent-poort. Bedien de reactor in continue stroom voor 2-5 dagen (afhankelijk van de toepassing), af en toe controleren van de reactor voor een goede drainage. </li><li> Om de oogst het infuus stromingsreactor biofilms, stop de pomp en voorzichtig de naalden uit de reactor. De reactor kan dan worden geplaatst op een vlakke ondergrond en de bonnen kan aseptisch worden verwijderd met behulp van steriel pincet. Als microscopie is gewenst, de coupons kan nu dus worden verwerkt (Figuur 2B is een scanning electronen microscoop foto van een S. aureus biofilm gekweekt in een druppel biofilm reactor). Indien kwantificering van de biofilm biomassa of fysiologie studies zijn het doel van het onderzoek, kan de biofilm worden verwijderd uit de coupon behulp van een mobiele schraper. Terwijl u de coupons met een tang voorzichtig de biofilm af te schrapen van de coupon in een conische buis met fosfaat gebufferde zoutoplossing met behulp van een cel schraper. Let op: te kwantificeren van de kolonievormende eenheden in de biofilms, is het noodzakelijk om te homogeniseren het geoogste biofilms met een tissue homogenisator om klonten disaggregeren en een homogene suspensie te vormen. Verschillende modellen van weefsel homogenisatoren zijn geschikt voor deze toepassing. We maken gebruik van een Fisher Scientific Tissuemiser Homogenizer (product # 15-338-420) op volle snelheid gedurende 1 minuut tot biofilm monsters homogeniseren. Als de biofilm homogeniseren zal resulteren in een onderschatting van de kolonievormende eenheden in het monster aanwezig. </li></ol> 2. De draaiende schijf Biofilm Reactor <ol><li> De roterende schijf biofilm reactor (beschikbaar vanaf die beschikbaar zijn vanaf Biosurface Technologies of kunnen op maat gemaakt, zie figuur 3) is gemonteerd en geautoclaveerd. Monteer de reactor door eerste plaats de draaiende schijf coupons in de sleuven van de draaiende schijf en te plaatsen in een 1-liter glazen beker met een overloop-poort. Een aantal 15-rubber stop met gaten geboord in het aan de media flow en beluchting toe wordt gebruikt als de reactor dop. De reactor, biofilm media (tryptische soja-bouillon 2 g / L en glucose 2 g / L), en inlaat slangen worden dan gesteriliseerd door autoclaaf. </li><li> De roterende schijf biofilm reactor wordt geënt door het plaatsen van 250 ml van steriel medium in de reactor, en het toevoegen van 0,5 ml van een overnachting S. aureus cultuur gekweekt in tryptische soja bouillon. De reactor wordt vervolgens geplaatst op een roer plaat ingesteld op 250 tpm en 's nachts geïncubeerd op de gewenste temperatuur. </li><li> Na 16 uur incubatie sluit de inlaat slang aan op de poort op de middellange reservoir en sluit deze aan op de peristaltische pomp. De pomp wordt dan ingeschakeld en de stroom ingesteld op ~ 0,25 ml / min (stroom kan worden gewijzigd afhankelijk van de gewenste groei). </li><li> Na 24 uur stoppen met de reactor en aseptisch de disk te verwijderen zonder het aanraken van de biofilm coupons. Verwijder de coupons met steriele pincet en duik ieder een in fosfaat gebufferde zoutoplossing aan een los bijgevoegde bacteriën te verwijderen. </li><li> Voor antimicrobiële stof testen, kan de chips worden geplaatst in afzonderlijke wells van een 96 wells plaat die verbindingen van belang. Na de incubatie zijn chips overgebracht naar 1,5 ml microcentrifugebuizen met 1 mL fosfaatbuffer zoutoplossing en gehomogeniseerd met een tissue homogenisator om de intacte biofilm verspreiden. </li><li> Cellen worden dan serieel verdund en uitgeplaat op voedingsagar medium om levensvatbare kolonie Formi te bepalenng eenheden. </li><li> Let op: vele variaties kunnen worden gemaakt op de bovenstaande protocol. Zo kan bijvoorbeeld draaiende schijf coupons worden bekleed met of gemaakt van potentiële anti-biofilm verbindingen om de werkzaamheid te testen. Biofilm dispergeermiddelen kan ook worden geëvalueerd worden incuberen coupons in dispergeermiddel verbindingen en kwantificeren van bacteriën bevestigd versus vrijstaand. </li></ol> 3. Representatieve resultaten Een voorbeeld van een set-up infuus flow reactor wordt weergegeven als figuur 1. Na drie dagen van stroom overvloedig biofilm zal verzamelen op de coupon oppervlak, figuur 2A. De totale biomassa zal variëren afhankelijk van bacteriestammen en nauwkeurige groeiomstandigheden. Een scanning electronen microscoop van een S. aureus biofilm gegroeid in de drip stroming reactor is weergegeven in figuur 2B. Een roterende schijf reactor is weergegeven in figuur 3A. De beschreven protocol kan worden aangepast aan de specifieke eisen van het algemeen een micro-organisme in staat is de vorming van een biofilm. Figuur 3B toont de draaiende schijf met 18 plastic schijven aangebracht. Deze disk-grown biofilms zijn bijzonder goed geschikt voor het testen van antimicrobiële en opbrengst zeer reproduceerbare resultaten 11. <img src="/files/ftp_upload/2470/2470fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Infuus stroming reactor setup. Belangrijke onderdelen zijn gemerkt. <img src="/files/ftp_upload/2470/2470fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Voorbeeld van een infuus stroom S. aureus biofilm. A) Dit biofilm werd geteeld voor drie dagen na de beschreven protocol. Deksels van de eerste twee kamers van de reactor zijn verwijderd om de gele S. tonen aureus biofilm biomassa. B) Sacnning electronen microscoop foto van een S. aureus biofilm gegroeid in het infuus stroming reactor. <img src="/files/ftp_upload/2470/2470fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. De roterende schijf reactor. A) Voorbeeld van een draaiende draaiende schijf reactor. Belangrijk onderdeel zijn gelabeld. B) Close up van een draaiende schijf.

<ol><li>Costerton, J. W., Lewandowski, Z., Caldwell, D. E., Korber, D. R., Lappin-Scott, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+Biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Microbial Biofilms.</a> Annu. Rev. Microbiol. 49, 711-745 (1995).</li>
<li>Costerton, J. W., Cheng, K. J., Gessey, G. G., Ladd, T. I., Nickel, J. C., Dasgupta, M., Marrie, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+biofilms+in+nature+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacterial biofilms in nature and disease.</a> Ann. Rev. Microbiol. 41, 435-464 (1987).</li>
<li>O'Toole, G. A., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+biofilm+formation+in+Pseudomonas+fluorescens+WCS365+proceeds+via+multiple%2C+convergent+signaling+pathways%3A+a+genetic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Micro%22%5BJournal%5D)">Initiation of biofilm formation in Pseudomonas fluorescens WCS365 proceeds via multiple, convergent signaling pathways: a genetic analysis.</a> Mol. Micro. 28, 449-461 (2002).</li>
<li>Boles, B. R., Horswill, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agr-mediated+dispersal+of+Staphylococcus+aureus+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Agr-mediated dispersal of Staphylococcus aureus biofilms.</a> PLoS Pathog. 4, e1000052-e1000052 (2008).</li>
<li>Goeres, D. M., Haamilton, M. A., Beck, N. A., Buckingham-Meyer, K., Hilyard, J., Loetterle, L. A., Walker, D. K., Stewart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+growing+a+biofilm+under+low+shear+at+the+air-liquid+interface+using+the+drip+flow+biofilm+reactor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A method for growing a biofilm under low shear at the air-liquid interface using the drip flow biofilm reactor.</a> Nature Protocols. 4, 783-788 (2009).</li>
<li>Fu, W., Forster, T., Mayer, O., Curtin, J. J., Lehman, S. M., Donlan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriophage+cocktail+for+the+prevention+of+biofilm+formation+by+Pseudomonas+aeruginosa+on+catheters+in+an+in+vitro+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Bacteriophage cocktail for the prevention of biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa on catheters in an in vitro model system.</a> Antimicrob Agents Chemother. 54, 397-404 (2010).</li>
<li>Xu, K. D., McFeters, G. A., Stewart, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+resistance+to+antimicrobial+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Biofilm resistance to antimicrobial agents.</a> Microbiology. 146, 547-549 (2000).</li>
<li>Xu, K. D., Stewart, P. S., Xia, F., Huang, C. T., McFeters, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+physiological+heterogeneity+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+is+determined+by+oxygen+availability%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Spatial physiological heterogeneity in Pseudomonas aeruginosa biofilm is determined by oxygen availability.</a> Appl. Environ. Microbiol. 64, 4035-4039 (1998).</li>
<li>Boles, B. R., Thoendel, M., Singh, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-generated+diversity+produces+%22insurance+effects%22+in+biofilm+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Self-generated diversity produces "insurance effects" in biofilm communities.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 16630-16635 (2004).</li>
<li>Pitts, B., Willse, A., McFeters, G. A., Hamilton, M. A., Zelver, N., Stewart, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+repeatable+laboratory+method+for+testing+the+efficacy+of+biocides+against+toilet+bowl+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A repeatable laboratory method for testing the efficacy of biocides against toilet bowl biofilms.</a> J. Appl. Microbiol. 91, 117-11 (2001).</li>
<li>Boles, B. R., Thoendel, M., Singh, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhamnolipids+mediate+detachment+of+Pseudomonas+aeruginosa+from+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rhamnolipids mediate detachment of Pseudomonas aeruginosa from biofilms.</a> Mol. Microbiol. 57, 1210-1223 (2005).</li>
<li>Hentzer, M., Teitzel, G. M., Balzer, G. J., Heydorn, A., Molin, S., Givskov, M., Parsek, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alginate+overproduction+affects+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Alginate overproduction affects Pseudomonas aeruginosa biofilm structure and function.</a> J. Bacteriol. 183, 5395-5401 (2001).</li>
<li>Lin, H. Y., Chen, C. T., Huang, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+merocyanine+540+for+photodynamic+inactivation+of+Staphylococcus+aureus+planktonic+and+biofilm+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of merocyanine 540 for photodynamic inactivation of Staphylococcus aureus planktonic and biofilm cells.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70, 6453-6458 (2004).</li>
</ol>

Biofilms gekweekt in verschillende reactoren hebben vaak verschillende eigenschappen en elke reactor heeft verschillende toepassingen. In dit werk beschrijven we het gebruik van twee reactoren biofilm: een druppel stroom biofilm reactor en een roterende schijf reactor. Drip reactoren zijn nuttig voor de teelt van lage shear biofilms op een lucht-water grensvlak en zijn aanpasbaar aan verschillende omstandigheden. We vinden ze erg handig voor studies waar een grote hoeveelheid van biofilm biomassa is wenselijk. Deze opst...

Erratum: The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

<table><tbody><tr><td>Drip-flowreactoren</td><td>BioSurface Technologies Corporation</td><td>DFR 110</td><td></td></tr><tr><td>Roterende schijfreactoren</td><td>BioSurface Technologies Corporation</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

het gebruik van drip flow en roterende schijf reactoren voor staphylococcus aureus biofilm analyse

The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

De meeste microben in de natuur worden verondersteld te bestaan ​​als oppervlakte-geassocieerde gemeenschappen in biofilms. Bacteriële biofilms een zijn gevat in een matrix en gehecht aan een oppervlak. Twee biofilm vorming en ontwikkeling worden vaak onderzocht in het laboratorium met behulp van batch-systemen zoals microtiterplaten of stroom systemen, zoals flow-cellen. Deze methoden zijn bruikbaar voor het screenen mutant en chemische bibliotheken (microtiterplaten) 3 of groeiende biofilms voor visualisatie (flow-cellen) 4. Hier presenteren wij gedetailleerde protocollen voor de teelt van Staphylococcus aureus in de twee andere soorten van flow systeem biofilms: het infuus stroom biofilm reactor en de roterende schijf biofilm reactor. Drip stroom biofilm reactoren zijn ontworpen voor de studie van biofilms gegroeid onder lage afschuiving omstandigheden. 5 De drip flow reactor bestaat uit vier parallelle test kanalen, die elk kunnen houden een standaard glas microscoopglaasje grote coupon, of een lengte van katheter of stint. Het infuus flow reactor is ideaal voor microsensor monitoring, algemeen biofilm studies, biofilm cryosectioning monsters, een hoge productie van biomassa, medisch materiaal evaluaties en inwoning medische apparatuur testen. 6,7,8,9 De roterende schijf reactor bestaat uit een teflon schijf met uitsparingen voor uitneembare coupons. 10 De verwijderbare coupons kan door gemaakt van een machinaal materiaal. De onderkant van de draaiende schijf bevat een staafmagneet, zodat schijf draaien om vloeibare slijtvastheid van het oppervlak te creëren over het oppervlak-flush coupons. De hele schijf met 18 coupons is geplaatst in een 1000 ml glas side-arm reactorvat. Een vloeibaar groei media is verspreid via het vat, terwijl de schijf wordt gedraaid door een magnetische roerder. De coupons worden verwijderd uit het reactorvat en dan geschraapt om de biofilm monster te verzamelen voor verdere studie of microscopie beeldvorming. Draaiende schijf reactoren zijn ontworpen voor laboratorium evaluaties van biocide werkzaamheid, biofilm verwijdering, en de prestaties van anti-fouling materialen. 9,11,12,13

Protocollen voor het gebruik van open systeem stroom biofilms met drip stroom reactoren en roterende schijf reactoren worden in detail.

Het gebruik van Drip Flow en roterende schijf reactoren voor Staphylococcus aureus Biofilm Analyse

Men gaat ervan uit dat de meeste microben in de natuur voorkomen als oppervlaktgeassocieerde gemeenschappen in biofilms.1 Bacteriële biofilms zijn ingekapseld in een matrix en gehecht ...

Het algemene doel van deze procedure is het kweken van bacteriële biofilms onder lage of matige schuifkracht met behulp van een drip flow biofilm-reactor of een roterende schijfreactor. Coupons in de biofilm-reactoren worden eerst geïnoculeerd met bacteriën en geïncubeerd bij 37 °C om de bacteriële cellen de mogelijkheid te geven zich aan de groeioppervlakken te hechten. Zodra de cellen aan de coupons zijn gehecht, wordt een stroom groeimedium gestart die een schuifkracht produceert die tijdens de ontwikkeling van de biofilm inwerking treedt.Rijpe biofilms kunnen vervolgens worden geoogst voor analyse en observatie van de biofilms. Scanningelektronenmicroscopie kan worden toegepast om de ultrastructuur van de geproduceerde biofilms te bepalen. Ik ben Blaze Balls.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals flowcellen, is dat een hoge biomassa-productie en meerdere identieke biofilms eenvoudig kunnen worden gerealiseerd. Deze procedure zal worden gedemonstreerd door Rachel Stevenson en Kelly Schwartz, een technicus en een promovendus uit mijn laboratorium. De drip flow biofilmreactor bestaat uit vier kamers met inlaatpoorten voor de toevoer van medium en uitlaatpoorten voor de afvoer van afval.In elke kamer bevindt zich een verwijderbaar coupon waarop de biofilm groeit. Om de druppelstroom-biofilmreactor te assembleren, plaatst u de coupons in elke parallelle kamer en sluit u de kamerdeksels stevig. Autoclaveer de geassembleerde reactor samen met de toevoerslangen voor voedingsstoffen om het systeem vóór gebruik te steriliseren.Autoclaveer daarnaast het biofilm-groeimedium om de gesteriliseerde drip-flow-reactor te inoculeren. Plaats het apparaat op een vlak oppervlak en klem de effluentleidingen af. Vul vervolgens elke kamer met 10 milliliters steriel groeimedium op basis van triptische soja-bouillon en voeg 100 microliters staphylococcus aureus toe.Overnight-cultuur gekweekt in hetzelfde medium voor elke kamer afzonderlijk. Plaats de geïnoculeerde reactor gedurende 18 uur in een incubator bij 37 °C om de cellen de mogelijkheid te geven aan het couponoppervlak te hechten. Klem na de incubatie de effluentleiding af en plaats de reactor aseptisch op een houten blok met een helling van 10 graden.Verbind de slang voor de vloeibare voedingsbodem met een fles die continue-flow voedingsbouillon bevat. Leid de slang door de pomp en ontlucht de slang door de pomp op volle snelheid te laten draaien. Zodra de slang is ontlucht, stop dan de pomp en bevestig 22 gauge naalden van één inch aan het uiteinde van elke slang.Veeg de stop van de kamerinlaat schoon met een ethanoldoekje en doe dit aseptisch. Steek de naalden door de inlaatstop. Zet de pomp aan en laat het medium over de coupons druppelen.Bij een stroomsnelheid van ongeveer 125 microliters per minuut moet het medium van de inlaatstop poort naar de uitlaatpoort naar beneden stromen. Laat de reactor gedurende drie dagen in continue stroom werken. Controleer de reactor af en toe op een goede afwatering.De drainage wordt gecontroleerd door visuele inspectie van de kamers om er zeker van te zijn dat het medium niet in de kamers blijft staan. Als het medium zich ophoopt, kan het dichtknijpen van de uitstroomslang meestal een goede drainage bevorderen om de biofilms te oogsten; stop de pomp en verwijder de naalden uit de reactor. Plaats de reactor vervolgens op een vlak oppervlak.Na drie dagen continue doorstroming verschijnen Staphylococcus aureus-biofilms als gele biomassa die over de lengte van de geinoculeerde coupons is verspreid. Een scanning elektronenmicroscoopopname van de biofilm laat zien dat Staphylococcus aureus de coupon bedekt in een oppervlakte-geassocieerde biofilmgemeenschap. Om de verkregen biomassa te kwantificeren, worden de coupons met steriele pincetten zo aseptisch mogelijk verwijderd, worden de bacteriën geoogst met een celschraper en vervolgens overgebracht naar een conische buis met vijf milliliters steriele PBS.Gebruik een weefselhomogenisator om de bacteriële klonten te desaggregeren tot er een uniforme suspensie is verkregen. Kolonievormende eenheden worden gekwantificeerd door seriële verdunningen uit te platen op triptisch soja-agarplaten, deze 24 uur bij 37 °C te incuberen en de koloniën te tellen. De roterende schijf biofilmreactor bestaat uit een chemostaat waardoor groeimedium wordt gepompt.Een draaiende schijf met een stervormige stuurstang en 18 coupons die zijn ontworpen om in de draaiende schijf te passen. Om de reactor te assembleren, plaatst u eerst de coupons in de sleuven van de draaiende schijf. Plaats vervolgens de geladen schijf in een glazen bekerglas van één liter met een overloopopening en sluit de reactor af met een rubberen stop nummer 15 met één gat voor de mediastroom en één gat voor beluchting.Autoclaveer de gemonteerde reactor en de toevoerleidingen om het systeem te steriliseren. Om de reactor te inoculeren, vult u het bekerglas met 250 milliliters steriel cultuurmedium en voegt u 500 microliters toe van een overnight-cultuur van staphylococcus aureus gekweekt in triptych soy broth. Plaats de reactor op een roerplaat ingesteld op 250 rotations per minute en incubeer deze overnight bij 37 degrees Celsius om de cellen op de coupons te laten hechten.Sluit na de incubatie gedurende de nacht de inlaatslang aan op de poort van het mediumreservoir en op de peristaltische pomp. Zet de pomp aan en stel de stroomsnelheid in op 0,25 milliliters per minuut. Laat de reactor 24 uur lang draaien bij 37 graden Celsius om de resulterende biofilms te oogsten.Stop de reactor en werk aseptisch. Verwijder de schijf zonder de coupons aan te raken. Verwijder de coupons met een steriele pincet en dip elke coupon voorzichtig in steriele PBS om losjes gebonden bacteriën te verwijderen voor het testen van antimicrobiële verbindingen.Plaats de coupons aseptisch in afzonderlijke wells van een 96-wells plaat die de betreffende verbindingen bevat. Incubeer de plaat vier uur bij 37 °C. Draag de coupons vervolgens over naar 1,5 mL microcentrifugebuisjes met 1× PBS en disperseer de biofilms met behulp van een homogenisator.Plat tenslotte seriële verdunningen van de cellen uit op nutriëntenagarmedium om het aantal levensvatbare colony forming units per monster te bepalen, zoals eerder beschreven. Deze grafiek toont het aantal colony forming units in biofilms die zijn geprepareerd met de spinning disc reactor en zijn blootgesteld aan waterstofperoxide, wat de mogelijkheid aantoont om tot 18 identieke biofilms te produceren. Door gebruik te maken van de spinning disc reactor is deze techniek bij uitstek geschikt voor het testen van antimicrobiële verbindingen.Na het bekijken van deze video heeft u een goed begrip van het runnen van biofilms in drip flow- en roterende schijfreactoren. Deze biofilmreactoren bieden alternatieven voor biofilms in flow-cellen en microtiterplaten en zijn ideaal wanneer een grote hoeveelheid biofilmbio-massa nodig is of wanneer antimicrobiële testen op gevestigde biofilms gewenst zijn.

the-use-drip-flow-rotating-disk-reactors-for-staphylococcus-aureus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Protocol beschrijft de toepassing van een flow cel-systeem voor de teelt en het analyseren van microbiële biofilms voor Confocale Laser Scanning Microscopie (CLSM).

Pseudomonas aeruginosa en Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow cellen

In this video, we demonstrate the preparation of in vitro biofilm by S. aureus in a poly-L-Lysine-coated multi-well plate. The biofilm-formed plate can be used for downstream experiments.

In Vitro Biofilm Synthesis by Staphylococcus aureus

Biofilms hebben complexe interacties met hun omgeving. Om biofiel-omgevingsinteracties grondig te onderzoeken, presenteren we hier een reeks methoden om een heterogene chemische omgeving te creëren voor biofilmontwikkeling, om lokale stroomsnelheid te kwantificeren en om massatransport in en rond biofilmkolonies te analyseren.

Methoden voor het karakteriseren van de co-ontwikkeling van biofilm en Habitat Heterogeniteit

De meeste bacteriële infecties produceren een biofilm. Vanwege hun omgeving zijn biofilm-geassocieerde bacteriën vaak fenotypisch resistent tegen geneesmiddelen. Nieuwe antibacteriële moleculen die bacteriën in biofilms doden, hebben dus een hoge prioriteit. We stellen een test op om snel te screenen op antimicrobiële verbindingen die effectief zijn bij het uitroeien van biofilms.

Gericht op biofilm geassocieerde<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Met behulp van Resazurin Gebaseerd Drug-gevoeligheid Assay

We beschrijven de vergadering, operatie, en schoonmaken van een apparaat van de stroom ontworpen om schimmel biofilm beeldvorming in real-time terwijl onder stroom. Wij bieden ook en bespreken van kwantitatieve algoritmen worden gebruikt op de verworven beelden.

Real-time Imaging en kwantificering van schimmel Biofilm ontwikkeling met behulp van een bewerking in twee fasen recirculatie-stroomsysteem

Hier beschrijven we het gebruik van een hogere gegevensdoorvoer microfluidic bioreactor in combinatie met een fluorescente microscoop voor de analyse van shear stress effecten op Pseudomonas aeruginosa biofilms uiting van groen fluorescent eiwitten, met inbegrip van instrument instellen, de bepaling van biofilm dekking, groei en morfologische eigenschappen.

Cel analyse van Shear Stress voortleven Pseudomonas aeruginosa met behulp van een geautomatiseerde hoger-Throughput Microfluidic systeem

Dit artikel beschrijft methoden die drie gangbare biofilmoogst- en desaggregatietechnieken op twee oppervlaktetypen demonstreren, robuustheidstests van een oogstmethode en minimale informatie om te overwegen bij het kiezen en optimaliseren van oogst- en desaggregatietechnieken om de reproduceerbaarheid te vergroten.

Oogsten en uitsplitsen: een over het hoofd geziene stap in onderzoek naar biofilmmethoden

Dit protocol presenteert methodologie om biofilmgroei- en biomassametingen uit te voeren met behulp van zelfgeassembleerde pcr-plaatapparaten met diepe put voor statische biofilmscreening met hoge doorvoer en 96-well gekoppelde deksels.

Generatie van grotere bacteriële biofilmbiomassa met behulp van PCR-Plate Deep Well Microplate-apparaten

Dit protocol beschrijft een aanpak die statische en dynamische methoden combineert om de werkzaamheid van organische peroxyzuren voor het uitroeien van biofilms in de zuivelindustrie te evalueren. Deze aanpak kan ook worden gebruikt om de effectiviteit van nieuwe biologische of chemische formuleringen voor de bestrijding van biofilms te testen.

Evaluatie van de werkzaamheid van organische peroxyzuren voor het uitroeien van zuivelbiofilms met behulp van een aanpak die statische en dynamische methoden combineert

Een muismodel voor huid- en weke deleninfecties wordt gebruikt om de virulentiefunctie van methicilline-resistente Staphylococcus aureus (MRSA) en de immunologische respons van de gastheer te beoordelen. Hier presenteren wij een subcutaan infectiemodel voor huid- en weke deleninfecties.

Subcutane Infectie van Methicilline Resistente Staphylococcus Aureus (MRSA)

Leer biofilmkweek met drip flow- en roterende schijfreactoren voor microbiologisch onderzoek met Staphylococcus aureus. Deze methoden produceren hoge biomassa voor antimicrobiële testen.

Het gebruik van Drip Flow en roterende schijf reactoren voor Staphylococcus aureus Biofilm Analyse

Meer video's verkennen