Real-time Imaging en kwantificering van schimmel Biofilm ontwikkeling met behulp van een bewerking in twee fasen recirculatie-stroomsysteem

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de microbiologie veld, zoals hoe vloeistofstroom verandert schimmel biofilm groei en ontwikkeling. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het ons in staat stelt om de effecten van flow op de groei en ontwikkeling van biofilm in real time kwantitatief te evalueren. Begin dit experiment met de montage van het stroomapparaat, zoals beschreven in het tekstprotocol.

De dag van het experiment, bevestig de bubble trap, temperatuur sonde, en alle componenten voor eenmalig gebruik. Om het filter te monteren, verwijder de zuiger uit een spuit van één milliliter om er een adapter van te maken. Forceer de slang van de filterfles in dit uiteinde en bevestig een 2 micron filter aan de slang die leidt naar de groeifles.

Breng siliconenvacuümvet aan rond de weerhaak van de schuifadapter voordat u deze aansluit, omdat dit helpt om luchtlekken in het systeem te voorkomen. Vul de bevestigingskolf met 100 milliliter YPD en vul de groeikolf met 200 milliliter YPD. Zorg ervoor dat de groene zijslang de media in elke kolf bereikt.

Zorg ervoor dat alle kleppen open zijn. Bevestig de bellenval aan een vacuüm en sluit de pomp aan op de groene zijbuizen stroomafwaarts van de bellenval. Pomp de vloeistof met een stroomsnelheid van 3,3 milliliter per minuut om de groene kant volledig te vullen.

Dan, afzien en gooi ongeveer een tot twee milliliter van de media, omdat de eerste paar milliliter bevatten vaak dode cellen of willekeurig puin. Zorg ervoor dat de groene kant van de slang is gevuld met media en heeft geen bubbels stroomafwaarts van de bubble trap voordat u verdergaat. Vul de kanaalschuif en het reservoir met YPD, waarbij u ervoor zorgt dat er geen bellen worden geïntroduceerd.

Sluit de glijbaan aan op het stroomapparaat. Pomp dan meer vloeistof om een buffer van ongeveer 5 meter aan de oranje kant te creëren. Dit om te voorkomen dat er per ongeluk lucht in de glijbaan wordt vastgestroomd in geval van terugstroom.

Bereid nu het stroomapparaat voor op transport naar de microscoop door eerst de inlaat en uitlaat van de gesloten bellenval te planten. Klem vervolgens de groene en oranje zijzijdekolfkleppen gesloten. Zorg ervoor dat de schroefdoppen voor de pulsatiedemper en filterfles strak zitten, omdat ze tijdens autoplating los kunnen komen.

Koppel de pomp los aan de slang om het transport gemakkelijker te maken. Verplaats vervolgens alle componenten, inclusief de hete plaat roerder, in een secundaire container in de buurt van de microscoop. Bevestig de temperatuursonde aan de hete plaat roerder, en beginnen met het verwarmen van de bevestigingskolf tot 37 graden Celsius.

Roer de media op 300 RPM, en onderhoud dit voor het hele experiment. Monteer de glijbaan op de microscoop en gebruik indien nodig tape om deze stevig vast te zetten. Bevestig vervolgens de bellenval aan een vacuüm.

Sluit nu de pomp aan op het stroomapparaat. Start de pomp met een stroomsnelheid van 3,3 milliliter per minuut, en laat het draaien voor ongeveer vijf tot 10 seconden. Verwijder vervolgens de bubble trap in let-out deksel clan.

Laat de pomp blijven draaien terwijl de bevestigingskolf opwarmt. Zodra de bevestigingskolf en incubatiekamer beide op 37 graden Celsius zijn, voeg voldoende nachtelijke cultuur van de schimmelcellen toe aan de bevestigingsfles om een miljoen cellen per milliliter te bereiken. Wacht 15 minuten om de cellen te laten acclimatiseren.

Open zowel groene als oranje zijbevestigingskolfkleppen terwijl het sluiten van beide groeikolfkleppen om de stroom van cellen te starten. Wacht ongeveer vijf minuten om cellen de dia te laten bereiken. Gedurende deze tijd, focus de microscoop en aan te passen aan dezelfde beeldvorming parameters gebruikt in eerdere experimenten.

Begin met het verwerven van afbeeldingen voor de bevestigingsfase. Kom na ongeveer vijf en 10 minuten terug om ervoor te zorgen dat de focus behouden blijft. Zo niet, probeer dan de focus direct na de volgende afbeelding aan te passen.

Sla onmiddellijk nadat de bijlagefase is voltooid, het bestand op. Open vervolgens zowel groene als oranje zijgroeikolfkleppen terwijl beide bevestigingskolfkleppen worden gesloten. Zorg ervoor dat u het podium niet stoot als er kleppen in de incubatiekamer zitten.

Haal de thermometersonde los en vervang de bevestigingskolf door de groeikolf. Configureer nu de software om elke 15 minuten gedurende 22 uur een afbeelding te verkrijgen en begin met het verwerven van afbeeldingen voor de groeifase. Zodra de groeifase overname is voltooid en het bestand is opgeslagen, open de groene en oranje kant bevestigingskolf kleppen, die een geluid kan maken als de druk releases aan de oranje kant.

Trek op de groene zijbuizen die uit beide mediakolven komen, tot zij minstens verscheidene centimeters boven de media zijn. Dan, voer de pomp op een hoge snelheid om alle media te verwijderen uit de slang, waardoor het schoonmaken veel gemakkelijker. Tot slot, kwantificeren van de video's zoals beschreven in het tekstprotocol.

Deze time lapse dark field microscopie video toont de bevestiging van wilde type Candida albican cellen aan het substraat onderstroom tijdens de bevestigingsfase, gevolgd door de daaropvolgende groei en ontwikkeling tijdens de groeifase die leidt tot biofilmvorming. De gegevens van deze video's kunnen worden geanalyseerd voor de tarieven van celbevestiging en onthechting en biomassa in de tijd, hier getoond is de totale biomassa binnen de beeldvorming regio zoals bepaald door densitometrie analyse. De cumulatieve snelheid van celbevestiging en het percentage biomassa onthechting na verloop van tijd worden ook weergegeven.

Tijdens het proberen van deze procedure, is het belangrijk om te onthouden om dezelfde beeldvorming voorwaarden te gebruiken voor alle experimenten, omdat dit het mogelijk maakt voor kwantitatieve vergelijkingen worden gemaakt tussen hen.