Name: RNA-interferentie in teken (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-20T19:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Leer RNA-interferentie in teken via injectie van dubbelstrengig RNA om genexpressie te onderdrukken. Deze methode helpt onderzoekers bij het bestuderen van tekenbiologie en het ontwikkelen van strategieën tegen tekenoverdraagbare ziekten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken de leden van onze laboratoria voor vruchtbare discussies en technische bijstand. Deze video presentatie werd ondersteund door de Associate Dean voor Onderzoek en het Ministerie van Veterinaire Pathobiologie, Centrum voor Veterinaire Gezondheidswetenschappen, Oklahoma State University. Het onderzoek werd gefinancierd door het Ministerio de Ciencia e Innovación, Spanje (project BFU2008-01244/BMC), het CSIC intramurale project PA1002451 aan JF, de Walter R. Sitlington leerstoel voor de menselijke voeding Animal Research voor KMK, CVHS 2009 RAC verlenen, OAEs Animal Health fondsen en USDA, National Research Initiative Competitive Grant, nr. 2,007 tot 04,613.

1. Generatie van dsRNA. <ol><li> Synthetiseren oligonucleotideprimers met T7 promoter sequenties voor in vitro transcriptie en synthese van dsRNA (bijvoorbeeld voor Dermacentor variabilis subolesin gebruik van oligonucleotide primers D8AAT75: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGTACTGACTGGGATCCCCTGCACAGT-3 'en D8DVT73: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGTACTCGAGCTTGGTGGAAAGGACG-3'). </li><li> Amplify target-gen door RT-PCR met behulp van 10 pmol van elke oligonucleotide primer en 1-10 ng van teken totaal RNA. </li><li> Zuiveren de PCR-product. </li><li> Synthetiseren dsRNA met 8 pi van het gezuiverde PCR-product. </li><li> Kwantificeren dsRNA door spectrometrie. </li></ol> 2. Injectie van Teken met dsRNA. 2.1. De voorbereiding van teken voor injectie. <ol><li> Was eerst de teken in een reeks van oplossingen door schudden ze in elke oplossing in een 50 mL wegwerp centrifugebuis, decanteren de oplossing door een fijne gaas-scherm over de buis van boven naar de teken te behouden. De volgorde van de oplossingen voor het wassen van teken is leidingwater, 3% waterstof peroxide, twee wasbeurten van gedestilleerd water, 70% ethanol en twee meer wassen met gedestilleerd water. </li><li> Dep droog de teken op keukenpapier. </li><li> Tel de teken in groepen van 20 tot 50, afhankelijk van het experiment, plaatst u de teken uit elke groep in een 1.25 oz plastic bekertje met een strak gemonteerd deksel en etiket met de experimentele groep nummer. </li></ol> 2.2. Tick ​​injectie team. Het RNAi-team bestaat uit drie personen: (1) een persoon die iedere tik posities op dubbele kleefband aangebracht op een vel rode tandartsen, (2) een persoon die injecteert het teken en (3) een persoon die de teken controleert na injectie, ademt CO 2 op het teken om ze te activeren en telt het levende teken in kopjes gelabeld met de experimentele groep nummer. Alle teamleden dienen wegwerphandschoenen te dragen. 2.3. Plaatsing van teken voor injectie. <ol><li> Leg een teek met behulp van Dumont fijn pincet en plaats het ventrale kant naar boven op de dubbele kleefband aangebracht op een 3 "x 6" vel rode tandartsen. De teken zijn nauw bij elkaar geplaatst in groepen van vijf teken. </li><li> Leg een smalle strook afplaktape over de monddelen van alle vijf teken om verder te weerhouden hen, maar terwijl het grootste deel van het lichaam, zodat blootgesteld, zodat de injectie proces kan worden waargenomen door de teek injector (figuur 1). </li></ol> 2.4. Injectie van teken. <ol><li> Het teken zal worden geïnjecteerd in de rechter kwadrant van het ventrale oppervlak van het exoskelet. </li><li> De eerste, Pierce een gat in het exoskelet met behulp van een Monoject insulinespuit uitgerust met een ½ ", 29 gauge naald (Figuur 2a). </li><li> Onmiddellijk in te spuiten teken met 0,2-0,5 pl van dsRNA-oplossing (5 x 10 10 - 5 x 10 11 moleculen per pi) met behulp van een custom-made Hamilton spuit met een 1 inch, 33 gauge naald met een 45 ° schuine punt (Figuur 2b) . De naald moet goed worden geplaatst in de teek holte om de plaatsing en het behoud van de dsRNA te verzekeren. Wat vocht is waarschijnlijk te ontsnappen uit de injectieplaats (figuur 2c). Zorg ervoor dat u niet meer dan injecteren van de teken, die het verlies van hemolymfe zou veroorzaken en kan de dood van de teek kan veroorzaken. </li><li> Reinig de Hamilton spuit na het voltooien van de injecties in elke experimentele groep. voordat u voor een andere experimentele groep. Vul eerst de spuit uit een bekerglas met 3% waterstofperoxide en vervolgens te verdrijven in een afvalcontainer, en herhaal 15 keer. Vul de spuit van een bekerglas met steriel water en vervolgens te verdrijven in een afvalcontainer, en herhaal 15 keer. Zorg ervoor dat de zuiger van de spuit Hamilton bocht omdat, als gebogen, de zuiger niet soepel bewegen en reageren op de zachte aanraking die nodig zijn voor de injectie van teken. </li></ol> 2.5. De behandeling van teken na de injectie. <ol><li> Pak de teek direct ingespoten van de dubbele kleefband met de fijne pincet en plaats deze in een plastic recovery container (ongeveer 6 "x 6" en geringd met tape om het ontsnappen van de teken te voorkomen). Het teken zal kort inactief worden na de injectie, maar moet al snel beginnen te kruipen rond het gerecht. </li><li> Breath CO 2 op de teken onmiddellijk na het plaatsen van hen in het herstel container om te helpen de teken te activeren. Zodra de teken zijn kruipen en actief zijn, zal de injectie wond snel genezen en zullen ze waarschijnlijk overleven. </li><li> Tel het teken op basis van het aantal in elke experimentele groep en plaats ze in een gemerkt plastic bekertje met een strak gemonteerd deksel. Vervanging teken moet geïnjecteerd worden aan een dat stierf voordat het injecteren van de volgende experimentele groep te vervangen. </li></ol> 2.6. Tick ​​bedrijf. <ol><li> Plaats de teken in een vochtige kamer (12 uur licht: 12 uur donker fotoperiode bij 22-25 ° C en 95% relatieve humidity) en houd deze voor 1 dag. </li><li> Plaats teken in teken geeft cellen, een per experimentele groep, verlijmd op een schaap en hen in staat stellen zich te voeden met een gelijk aantal uninjected mannelijk of vrouwelijk teken (wat seks was niet geïnjecteerd). Vrouwelijke teken dat de voeding naar repletie, hebben degenen die worden verwijderd uit de schapen na 10 dagen van het voeden, of wanneer de controle wijfjes afgezet de gastheer worden verzameld en gewogen. </li><li> Plaats de teken in dozen, en houden in de vochtkamer tot de voltooiing van ovipositie. Evalueer ovipositie door weging van de ei massa geproduceerd door alle teken in de groep. </li></ol> 2.7. Analyse van de teek fenotype na RNAi. <ol><li> Evalueer vinkje fenotype na de voeding door het bepalen van het aantal teken dat overleefde, teek gewicht, ovipositie en ei vruchtbaarheid. Kunnen echter ook andere analyses worden uitgevoerd, afhankelijk van de specifieke gen en de doelstellingen van de studie. </li></ol> 3. Analyse om gene silencing Bevestig door RT-PCR. <ol><li> Ontleden speekselklieren en lef van individuele teken van controle-geïnjecteerde en dsRNA-geïnjecteerde groepen na de voeding. </li><li> Extract totaal RNA van individuele weefselmonsters. </li><li> Analyseren van target-gen transcripten in individuele weefsels door real-time RT-PCR en normaliseren RNA-niveau tegen teken 16S rRNA met behulp van de genNorm methode (DDCT methode zoals uitgevoerd door Bio-Rad iQ5 Standard Edition, versie 2.0). </li><li> Run dissociatie curven aan het einde van de reactie om ervoor te zorgen dat er slechts een amplicon is gevormd en dat de amplicons denatureren consequent in hetzelfde temperatuurbereik voor ieder monster. </li><li> Vergelijk mRNA niveaus (genormaliseerd Ct-waarden) tussen controle-geïnjecteerd en dsRNA-teken geïnjecteerd met behulp van de Student `s t-test (p = 0,05). </li></ol> 4. Representatieve resultaten: Het protocol beschreven is gebruikt in ons laboratorium voor de RNAi in veel verschillende ixodid teek soorten (tabel 1). De hoeveelheid dsRNA geïnjecteerd in het teken varieert met de grootte van de teek, grotere tekensoorten zijn geschikt voor een groter volume. Negatieve controle teken moet worden geïnjecteerd met een niet-verbonden dsRNA. Verschillende dsRNA's zoals subolesin 14-19,22-25,27-32,34 en beta-actine 20,21 kan worden gebruikt als positieve controles. Merk op dat het belangrijk is te wassen de spuit tussen de behandelingen om het mengen van dsRNA-oplossingen te vermijden. Als het protocol is juist gebeurt, zal minder dan 5% sterfte worden verkregen van de injectie procedure na 24 uur. Een typische fenotype na-gen knock-down in teken is weergegeven in figuur 3 met een panel van teken geïnjecteerd met zwembaden van dsRNA om te screenen op aanvinken beschermende antigenen. <table border="1"><tbody><tr><td> Tekensoorten </td><td> dsRNA ingespoten </td><td> Referenties </td></tr><tr><td> Ixodes scapularis </td><td> cDNA bibliotheek, subolesin, actine, nucleotidase, NF-kB, akirin </td><td> 21, 22, 29, 30 </td></tr><tr><td> Dermacentor variabilis </td><td> subolesin, GST, ubiquitine, vATPase, selenoproteins M en W2a, hematopoietische stamcellen / voorlopercellen eiwit-achtige, actine proteasoom 26S-subunit, ferritin1, varisin, akirin </td><td> 15, 19, 22, 24, 26, 30-32 </td></tr><tr><td> Dermacentor marginatus </td><td> subolesin </td><td> 22 </td></tr><tr><td> Amblyomma americanum </td><td> cDNA bibliotheek, subolesin, akirin </td><td> 17, 22, 30 </td></tr><tr><td> Amblyomma hebraeum </td><td> subolesin, voraxin </td><td> 28 </td></tr><tr><td> Rhipicephalus sanguineus </td><td> Rs86, subolesin </td><td> 22, 23 </td></tr><tr><td> Rhipicephalus MicroPlus </td><td> GST, ubiquitine, selenoprotein, Bm86, Bm91, subolesin, GI, GIII, EF1a, flagelliform zijde proteïne, von Willebrand factor </td><td> 16, 18, 25, 27 </td></tr><tr><td> Rhipicephalus annulatus </td><td> ubiquitine, subolesin, EF1a, GIII </td><td> 16 </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Tick soorten waarvan het RNAi-protocol is gebruikt. <img src="/files/ftp_upload/2474/2474fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Plaatsing van teken, ventrale kant naar boven, op dubbele kleefband gehandeld op grond van een blad van de rode tandartsen. De teken zijn geplaatst in groepen van vijf, waarna een kleine strook tape wordt geplaatst over de monddelen om verder te beveiligen de teken terwijl de injector om het lichaam van de teek te observeren tijdens de injectie. <img src="/files/ftp_upload/2474/2474fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. De injectie procedure omvat (a) piercing rechtsonder kwadrant van de teek exoskelet met een insuline syRinge uitgerust met een 29 gauge naald in om een ​​injectie te creëren, (b) directe injectie van de dsRNA op deze site met behulp van een Hamilton injectiespuit met een 33 gauge naald (c) het meest waarschijnlijk zal resulteren in een aantal lekken van teken hemolymfe / vloeistoffen. <img src="/files/ftp_upload/2474/2474fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Een panel van teek zes groepen waarin RNAi werd gebruikt om te screenen op aankruisen beschermende antigenen in Amblyomma americanum. De fenotypische veranderingen in het teken kan worden gezien in vergelijking met de positieve subolesin RNAi-controle en de negatieve niets dsRNA controle. In dit experiment het effect van de RNAi op de pof sterfte, gewichten en ovipositie van elke groep was statistisch geanalyseerd.

<ol><li>de la Fuente, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview%3A+Ticks+as+vectors+of+pathogens+that+cause+disease+in+humans+and+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Biosci%22%5BJournal%5D)">Overview: Ticks as vectors of pathogens that cause disease in humans and animals.</a> Front. Biosci. 13, 6938-6946 (2008).</li>
<li>Peter, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mosquito+control-Lessons+from+the+past%2C+solutions+for+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">mosquito control-Lessons from the past, solutions for the future.</a> Vet. Parasitol. 132, 205-215 (2005).</li>
<li>Barker, S. C., Murrell, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematics+and+evolution+of+ticks+with+a+list+of+valid+genus+and+species+names%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol%22%5BJournal%5D)">Systematics and evolution of ticks with a list of valid genus and species names.</a> Parasitol. 129, S15-S36 (2004).</li>
<li>Willadsen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tick+control%3A+Thoughts+on+a+research+agenda%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Tick control: Thoughts on a research agenda.</a> Vet. Parasitol. 138, 161-168 (2006).</li>
<li>de la Fuente, J., Kocan, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+development+of+vaccines+for+control+of+ixodid+tick+species%5BTitle%5D)+AND+%22Parasite+Immunol%22%5BJournal%5D)">Strategies for development of vaccines for control of ixodid tick species.</a> Parasite Immunol. 28, 275-283 (2006).</li>
<li>Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391, 806-811 (1998).</li>
<li>Cerutti, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference%3A+traveling+in+the+cell+and+gaining+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">RNA interference: traveling in the cell and gaining functions.</a> Trends Genet. 19, 39-46 (2003).</li>
<li>Kavi, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+silencing+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">RNA silencing in Drosophila.</a> FEBS Lett. 579, 5940-5949 (2005).</li>
<li>Mello, C. C., Conte, D. J. r <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revealing+the+world+of+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Revealing the world of RNA interference.</a> Nature. 431, 338-342 (2004).</li>
<li>Zhou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+and+potential+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Top.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">RNA interference and potential applications.</a> Curr. Top. Med. Chem. 6, 901-911 (2006).</li>
<li>Ramakrishnan, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+RNA+interference+in+tick+salivary+gland+research%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Tech%22%5BJournal%5D)">Application of RNA interference in tick salivary gland research.</a> J. Biomol. Tech. 16, 297-305 (2005).</li>
<li>Aljamali, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference%3A+applicability+in+tick+research%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Appl.+Acarol%22%5BJournal%5D)">RNA interference: applicability in tick research.</a> Exp. Appl. Acarol. 28, 89-96 (2002).</li>
<li>Aljamali, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+in+ticks%3A+a+study+using+histamine+binding+protein+dsRNA+in+the+female+tick+Amblyomma+americanum%5BTitle%5D)+AND+%22Insect.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">RNA interference in ticks: a study using histamine binding protein dsRNA in the female tick Amblyomma americanum.</a> Insect. Mol. Biol. 12, 299-305 (2003).</li>
<li>de la Fuente, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+for+the+study+and+genetic+manipulation+of+ticks%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Parasitol%22%5BJournal%5D)">RNA interference for the study and genetic manipulation of ticks.</a> Trends Parasitol. 23, 427-433 (2007).</li>
<li>de la Fuente, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomic+studies+of+tick+cells+in+response+to+infection+with+the+cattle+pathogen%2C+Anaplasma+marginale%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">Functional genomic studies of tick cells in response to infection with the cattle pathogen, Anaplasma marginale.</a> Genomics. 90, 712-722 (2007).</li>
<li>AlmazäN, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+Rhipicephalus+%28Boophilus%29+microplus+candidate+protective+antigens+for+the+control+of+cattle+tick+infestations%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol.+Res%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of Rhipicephalus (Boophilus) microplus candidate protective antigens for the control of cattle tick infestations.</a> Parasitol. Res. 106, 471-479 (2010).</li>
<li>de la Fuente, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+protective+antigens+by+RNA+interference+for+control+of+the+lone+star+tick%2C+Amblyomma+americanum%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Identification of protective antigens by RNA interference for control of the lone star tick, Amblyomma americanum.</a> Vaccine. 28, 1786-1795 (2010).</li>
<li>Zivkovic, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+genes+in+salivary+glands+of+male+Rhipicephalus+%28Boophilus%29+microplus+in+response+to+infection+with+Anaplasma+marginale%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Differential expression of genes in salivary glands of male Rhipicephalus (Boophilus) microplus in response to infection with Anaplasma marginale.</a> BMC Genomics. 11, 186-186 (2010).</li>
<li>de la Fuente, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+tick+infections+with+Anaplasma+marginale+and+A.+phagocytophilum+by+targeting+the+tick+protective+antigen+subolesin%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol.+Res%22%5BJournal%5D)">Reduction of tick infections with Anaplasma marginale and A. phagocytophilum by targeting the tick protective antigen subolesin.</a> Parasitol. Res. 100, 85-91 (2006).</li>
<li>Narasimhan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+Ixodes+scapularis+anticoagulation+by+using+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Disruption of Ixodes scapularis anticoagulation by using RNA interference.</a> Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 101, 1141-1146 (2004).</li>
<li>de la Fuente, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+screening+in+ticks+for+identification+of+protective+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol.+Res%22%5BJournal%5D)">RNA interference screening in ticks for identification of protective antigens.</a> Parasitol. Res. 96, 137-141 (2005).</li>
<li>de la Fuente, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tick+protective+antigen%2C+4D8%2C+is+a+conserved+protein+involved+in+modulation+of+tick+blood+ingestion+and+reproduction%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">The tick protective antigen, 4D8, is a conserved protein involved in modulation of tick blood ingestion and reproduction.</a> Vaccine. 24, 4082-4095 (2006).</li>
<li>de la Fuente, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+effect+of+silencing+the+expression+of+tick+protective+antigens+4D8+and+Rs86+in+Rhipicephalus+sanguineus+by+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol.+Res%22%5BJournal%5D)">Synergistic effect of silencing the expression of tick protective antigens 4D8 and Rs86 in Rhipicephalus sanguineus by RNA interference.</a> Parasitol. Res. 99, 108-113 (2006).</li>
<li>de la Fuente, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autocidal+control+of+ticks+by+silencing+of+a+single+gene+by+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Autocidal control of ticks by silencing of a single gene by RNA interference.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 344, 332-338 (2006).</li>
<li>Nijhof, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bm86%2C+Bm91+and+subolesin%2C+in+the+silencing+of+the+tick+protective+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Bm86, Bm91 and subolesin, in the silencing of the tick protective antigens.</a> Int. J. Parasitol. 37, 653-662 (2007).</li>
<li>Kocan, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+of+the+defensin%2C+varisin%2C+in+male+Dermacentor+variabilis+by+RNA+interference+results+in+reduced+Anaplasma+marginale+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Appl.+Acarol%22%5BJournal%5D)">Silencing of the defensin, varisin, in male Dermacentor variabilis by RNA interference results in reduced Anaplasma marginale infections.</a> Exp. Appl. Acarol. 46, 17-28 (2008).</li>
<li>de la Fuente, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+the+role+of+tick+subolesin+in+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Evidence of the role of tick subolesin in gene expression.</a> BMC Genomics. 9, 372-372 (2008).</li>
<li>Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+RNA+interference+of+the+subolesin+and+voraxin+genes+in+male+Amblyomma+hebraeum+%28Acari%3A+Ixodidae%29+on+female+engorgement+and+oviposition%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Appl.+Acarol%22%5BJournal%5D)">The impact of RNA interference of the subolesin and voraxin genes in male Amblyomma hebraeum (Acari: Ixodidae) on female engorgement and oviposition.</a> Exp. Appl. Acarol. 47, 71-86 (2009).</li>
<li>Galindo, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tick+subolesin+is+an+ortholog+of+the+akirins+described+in+insects+and+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Comp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tick subolesin is an ortholog of the akirins described in insects and vertebrates.</a> Dev. Comp. Immunol. 33, 612-617 (2009).</li>
<li>Canales, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+and+immunogenicity+of+the+mosquito+ortholog+of+the+tick+protective+antigen%2C+subolesin%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol.+Res%22%5BJournal%5D)">Conservation and immunogenicity of the mosquito ortholog of the tick protective antigen, subolesin.</a> Parasitol. Res. 105, 97-111 (2009).</li>
<li>Kocan, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+of+genes+involved+in+Anaplasma+marginale-tick+interactions+affects+the+pathogen+developmental+cycle+in+Dermacentor+variabilis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Silencing of genes involved in Anaplasma marginale-tick interactions affects the pathogen developmental cycle in Dermacentor variabilis.</a> BMC Dev. Biol. 9, 42-42 (2009).</li>
<li>Zivkovic, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subolesin+expression+in+response+to+pathogen+infection+in+ticks%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Immunol%22%5BJournal%5D)">Subolesin expression in response to pathogen infection in ticks.</a> BMC Immunol. 11, 7-7 (2010).</li>
<li>Karim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomics+tool%3A+gene+silencing+in+Ixodes+scapularis+eggs+and+nymphs+by+electroporated+dsRNA%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Functional genomics tool: gene silencing in Ixodes scapularis eggs and nymphs by electroporated dsRNA.</a> BMC Biotechnol. 10, 1-1 (2010).</li>
<li>Kocan, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transovarial+silencing+of+the+subolesin+gene+in+three-host+ixodid+tick+species+after+injection+of+replete+females+with+subolesin+dsRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol.+Res%22%5BJournal%5D)">Transovarial silencing of the subolesin gene in three-host ixodid tick species after injection of replete females with subolesin dsRNA.</a> Parasitol. Res. 100, 1411-1415 (2007).</li>
<li>de la Fuente, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+tick-pathogen+interface+for+novel+control+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Biosci%22%5BJournal%5D)">Targeting the tick-pathogen interface for novel control strategies.</a> Front. Biosci. 13, 6947-6956 (2008).</li>
<li>Kurscheid, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+a+tick+RNAi+pathway+by+comparative+genomics+and+reverse+genetics+screen+of+targets+with+known+loss-of-function+phenotypes+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Evidence of a tick RNAi pathway by comparative genomics and reverse genetics screen of targets with known loss-of-function phenotypes in Drosophila.</a> BMC Mol. Biol. 10, 26-26 (2009).</li>
</ol>

Hoewel andere methoden zijn beschreven voor RNAi in teken 14, 33, de injectie van dsRNA hier beschreven is de meest gebruikte zowel in unfed (tabel 1) en gevoed teken 16,25,34. RNAi is aangetoond dat het een waardevol instrument voor de studie van de teek gen functie, de karakterisering van de teek-pathogeen-interface en de screening en de karakterisering van vink beschermende antigenen 14,35 worden. In het bijzonder, RNAi uitgegroeid tot de meest waardevol instrument voor de functionele analyses in teken 35. Methodologisch zal RNAi waarschijnlijk evolueren naar efficiëntere methoden dat gen knock-down kan toestaan ​​in een groot aantal individuen. Het mechanisme van dsRNA-geïnduceerde RNAi in teken moeten worden verfijnd om bij te dragen tot een beter begrip en het gebruik van deze genetische aanpak in deze soort 35,36. De omvang van off-target effecten van RNAi in teken is ook een belangrijke vraag die moet volledig worden aangepakt 14,27. Tot slot zal RNAi waarschijnlijk bieden uitgebreide bijdragen aan de studie van de teek genregulatie en systeembiologie en de teek-pathogeen-interface en kan een invloed hebben op de ontwikkeling van vaccins aan te vinken plagen en de overdracht van door teken overgedragen pathogenen controle hebben.

<table><tbody><tr><td>Access RT-PCR-systeem</td><td>Promega</td><td>A1250</td><td></td></tr><tr><td>Purelink PCR-zuiveringskit</td><td>Invitrogen</td><td>K3100-02</td><td></td></tr><tr><td>Megascript RNAi-kit</td><td>Ambion</td><td>AM1626M</td><td></td></tr><tr><td>Rode dentale was</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72674</td><td></td></tr><tr><td>Plastic bekertjes, 1,25 oz en deksels</td><td>Solo Cup Company, Urbana Ill.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fijne pincet</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>Diverse</td><td></td></tr><tr><td>Insulinespuit</td><td>Monoject</td><td></td><td>Voorzien van een &amp;#189;&quot;, 29 gauge naald</td></tr><tr><td>Hamilton-spuit</td><td>Hamilton</td><td>701SN,33/.375&amp;#8221;/45DGR</td><td>Op maat gemaakt</td></tr><tr><td>TriReagent</td><td>Sigma</td><td>93289</td><td></td></tr><tr><td>iScript One-Step RT-PCR-kit met SYBR Green</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8892</td><td></td></tr><tr><td>Real-time PCR-detectiesysteem</td><td>Bio-Rad</td><td>Diverse</td><td>Raadpleeg &lt;a href=&quot;http://www.bio-rad.com/">http://www.bio-rad.com/&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

rna-interferentie in teken

RNA Interference in Ticks

Teken zijn obligate hematophagous ectoparasieten van wilde en gedomesticeerde dieren en mensen, en worden beschouwd als tweede wereldwijd aan muggen als dragers van ziekten bij de mens 1 en de belangrijkste dragers van invloed zijn vee-industrie wereldwijd 2. Teken zijn ingedeeld in de subklasse Acari, orde Parasitiformes, onderorde Ixodida en worden wereldwijd gedistribueerd van Arctic naar tropische gebieden 3. Ondanks inspanningen om teek controle, deze ectoparasieten blijven een ernstig probleem voor de menselijke en dierlijke gezondheid 4,5. RNA-interferentie (RNAi) 6 is een nucleïnezuur gebaseerde reverse genetische benadering dat de verstoring van de genexpressie gaat om gen-functie of het effect te bepalen op een metabole route. Kleine interfererende RNA&#39;s (siRNA&#39;s) zijn de effector moleculen van de RNAi pathway die door double-stranded RNA (dsRNA) en resultaten geïnitieerd in een krachtige sequentie-specifieke afbraak van cytoplasmatische mRNA&#39;s met dezelfde volgorde als de dsRNA trekker 7-9. Post-transcriptionele gene silencing mechanismen op initiatief van dsRNA zijn ontdekt in alle eukaryoten studeerde tot nu toe, en RNAi is snel ontwikkeld in een verscheidenheid van organismen als hulpmiddel voor functionele genomica studies en andere toepassingen 10. RNAi is uitgegroeid tot de meest gebruikte gen-silencing techniek in teken en andere organismen, waar alternatieve benaderingen voor genetische manipulatie zijn niet beschikbaar of onbetrouwbaar 5,11. De genetische karakterisering van teken is beperkt tot de recente toepassing van de RNAi 12,13. In de korte tijd dat RNAi beschikbaar is geweest, is gebleken een waardevol instrument voor het bestuderen van tik-gen functie, de karakterisering van de teek-pathogeen-interface en de screening en de karakterisering van vink beschermende antigenen 14 worden. Hierin is een methode om door middel van RNAi injectie van dsRNA in unfed teken beschreven. Het is waarschijnlijk dat de kennis die is opgedaan met deze experimentele aanpak sterk zal bijdragen aan het begrip van de fundamentele biologische systemen en de ontwikkeling van vaccins om teek beheersen en te voorkomen overdracht van door teken overgedragen pathogenen 15-19.

Een methode voor RNA-interferentie (RNAi) door injectie van dsRNA in unfed teken wordt beschreven. RNAi is de meest gebruikte gen-silencing-techniek in teken waar het gebruik van andere methoden van genetische manipulatie is beperkt.

RNA-interferentie in teken

Teken zijn obligate hematofage ectoparasieten van wilde en gedomesticeerde dieren en mensen, en worden wereldwijd na muggen als de belangrijkste vectoren beschouwd ...

Het algemene doel van deze procedure is het demonstreren van de techniek van RNA-interferentie in tekenen via injectie. Dit wordt bereikt door eerst dubbelstrengs RNA van het betreffende gen of de betreffende genen te synthetiseren. Vervolgens wordt het RNA in de tekenen geïnjecteerd, waarna ze gedurende 24 uur in een bevochtigingskamer worden gehouden.Na deze rustperiode krijgen de teken de gelegenheid om te voeden op een dier, zoals een schaap. Voedingsparameters zoals gewicht, vervelling en eipositie, evenals de expressie van het doelgen of de doelgenen van belang via real-time R-T-P-C-R, worden bepaald. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die het effect van het uitschakelen van doelgenen op de biologie van de teek aantonen door evaluatie van biologische parameters van de teek en genexpressie via real-time R-T-P-C-R.Onze groep werkt met teken om moleculaire gebeurtenissen op het grensvlak tussen de teek en de pathogeen te karakteriseren, om deze basisinformatie vervolgens te gebruiken voor de ontwikkeling van methoden om tekenplagen en de overdracht van pathogenen naar mensen en dieren te beheersen. RNA-interferentie is een essentieel instrument in dit onderzoek geworden, omdat dit de enige beschikbare methode is voor genetische manipulatie van teken. De functie van veel tekengenen is nog onbekend.RNA-interferentie stelt ons in staat om de rol van teken-genen en genexpressie te definiëren in vele aspecten van de biologie van de teek, waaronder paring, reproductie, voeding, spijsvertering, de functie van de speekselklieren en de vectorcompetentie van de teek voor de transmissie van pathogenen. De procedure zal worden gedemonstreerd door het team RNA-interferentie bij teken uit ons laboratorium: Dr. Ed Lewin, een promovendus, Busby en ikzelf. Om dubbelstrengs RNA te genereren, moeten eerst oligonucleotide-primers worden gesynthetiseerd die T7-promotersequenties bevatten voor in vitro transcriptie van RNA.Bijvoorbeeld, derma center vari lesin. Gebruik de oligonucleotides primers D eight A a T 75 en D eight DVT 73 die hier worden getoond. Amplificeer het doelgen via RT-PCR met gebruik van 10 picomoles van elke oligonucleotide primer en 1 tot 10 nanogram totaal RNA van de teek.Zuiver vervolgens het PCR-product. Gebruik daarna acht µL of ongeveer 100 ng om dubbelstrengs RNA te synthetiseren. Om de tekenen voor injectie voor te bereiden, worden deze eerst gewassen in de volgende reeks oplossingen: kraanwater, 3% waterstofperoxide, tweemaal gedestilleerd water, 70% ethanol en twee laatste wasbeurten met gedestilleerd water.Voer elke wasbeurt uit in een wegwerpcentrifugebuis van 50 milliliter door te schudden. Decanteer vervolgens de oplossing door een fijnmazig draadgaasscherm. Dep de teken droog op papieren handdoeken en verdeel de teken vervolgens in groepen van 20 tot 50, afhankelijk van het experiment.Plaats elke groep in een plastic bekertje van 1,25 ounce met een goed sluitend deksel en label elk bekertje met de experimentele groep. Stel vervolgens een RNAi-team samen bestaande uit drie personen die het injectieproces zullen uitvoeren. De eerste persoon positioneert elke teek op dubbelzijdige plakband dat is bevestigd op een vel rode tandheelkundige was van drie bij zes inch.De tweede persoon injecteert de teken en de derde persoon monitort de teken na injectie, blaast koolstofdioxide op de teken om ze te activeren en telt en overbrengt de levende teken naar bekers die zijn gelabeld met het nummer van de experimentele groep. Alle teamleden moeten wegwerphandschoenen dragen. Om het injectieproces van de teken te starten, vangt u een teek met Dumont fijne pincetten en plaatst u deze met de ventrale zijde naar boven op dubbelzijdige plakband dat is bevestigd aan een vel rode dentale was. Positioneer de teken dicht bij elkaar in groepen van vijf. Plaats een klein stripje maskeringstape over de monddelen van alle vijf de teken.Om ze verder te fixeren, laat u het grootste deel van het lichaam blootgesteld, zodat het injectieproces door de persoon die de teken injecteert kan worden geobserveerd. Om de teek te injecteren, prikt u een gaatje in het kwadrant rechtsonder van het ventrale oppervlak van het exoskelet met behulp van een mono-insulinespuit voorzien van een naald van 29 gauge en een halve inch. Injecteer vervolgens onmiddellijk 0,2 tot 0,5 µL dubbelstrengs RNA-oplossing in de teken met een op maat gemaakte Hamilton-spuit en een naald van 33 gauge en één inch met een schuin geslepen punt van 45 graden; plaats de naald diep in de holte van de teek om de plaatsing en retentie van het dubbelstrengs RNA te waarborgen.Hoewel er na de injectie vloeistof vrijkomt, zorgt een diepe plaatsing van de injectienaald ervoor dat er voldoende dubbelstrengs RNA in de holte van de teek wordt afgezet om gen-silencing te veroorzaken; er moet erop worden gelet dat er niet te veel wordt geïnjecteerd. Het overinjecteren van de teken zal leiden tot verlies van hemolymfe en de dood van de teek. Pak de teken direct na het injecteren met de fijne pincet op van de dubbelzijdige plakband en plaats ze in een plastic herstelcontainer.De teken zullen na de injectie kortstondig inactief blijven, maar zouden spoedig over het schaaltje moeten beginnen te kruipen. Activeer de teken door koolstofdioxide op hen uit te ademen. Zodra de teken kruipen en actief zijn, zal de injectiewond snel genezen en zullen ze waarschijnlijk overleven.Tel de teken in elke experimentele groep en plaats elke groep in een gelabelde plastic beker met een nauwsluitend deksel. Vervang eventuele teken die in de huidige groep sterven voordat de volgende experimentele groep wordt geïnjecteerd. Reinig de Hamilton-spuit vóór het injecteren van de volgende experimentele groep door de spuit te vullen en vervolgens leeg te maken met verse 3% waterstofperoxide.15 keer, gevolgd door 15 spoelingen met steriel water. Let erop dat u de zuiger van de Hamilton-spuit niet buigt, anders zal de zuiger niet soepel bewegen en niet reageren op de lichte aanraking die nodig is voor de injectie in de teek. Plaats de teken na de injectie in een kamer met een bak gevuld met water en kaliumsulfaat, wat gedurende één dag voor een hoge luchtvochtigheid zorgt en hen in stand houdt.Plaats vervolgens individuele teken in tekenvoedingscellen die op een schaap zijn geplakt en laat ze voeden samen met een gelijk aantal niet-geïnjecteerde mannelijke of vrouwelijke teken, afhankelijk van welk geslacht niet is geïnjecteerd. Verzamel en weeg de vrouwelijke teken uit de voedingscel nadat ze ongeveer 10 dagen hebben gevoed of wanneer de controlevrouwtjes van de gastheer zijn afgevallen. Incubeer elke groep teken in de bevochtigingskamer tot de eiafzetting is voltooid. Evalueer de eiafzetting per groep door de eimassa te wegen die is geproduceerd door alle teken in een groep om het fenotype van de teken na het voeden te evalueren.Bepaal het aantal teken dat is overleefd en bereken het gewicht van de tekenen, evenals de positie van de ova en de fertiliteit van de eieren. Afhankelijk van het doelewitgen en de doelstellingen van de studie kunnen andere analyses worden uitgevoerd om gene silencing via R-T-P-C-R te bevestigen. Dissekeer na het voeden de speekselklieren en darmen van individuele tekenen uit de controle-geïnjecteerde groep en de groep die is geïnjecteerd met dubbelstrengs RNA, en extraheer vervolgens het totale RNA uit de individuele weefselmonsters.Analyseer de transcripten van het doelgen in individuele weefsels via real-time R-T-P-C-R en normaliseer de RNA-niveaus ten opzichte van teken 16 s ribosomaal RNA. Gebruik de gene norm-methode, voer aan het einde van de reactie dissociatiecurves uit om te bevestigen dat er slechts één amplicon wordt gevormd en dat de amplicons consistent denatureren in hetzelfde temperatuurbereik voor elk monster, en vergelijk de genormaliseerde CT-waarden voor mRNA-niveaus tussen tekenen die met een controle zijn geïnjecteerd en tekenen die met dubbelstrengs RNA zijn geïnjecteerd met behulp van de student t-toets.Het hier beschreven protocol is in ons laboratorium gebruikt voor RNAi bij veel verschillende exotische teeksoorten. De hoeveelheid dubbelstrengs RNA die in de teken wordt geïnjecteerd, varieert afhankelijk van de grootte van de teek. Grotere teeksoorten kunnen een groter volume accommoderen.De referenties kunnen worden gevonden in het bijbehorende geschreven gedeelte van het protocol. Als het protocol correct wordt uitgevoerd, zou de mortaliteit als gevolg van de injectieprocedure na 24 uur minder dan 5% moeten zijn. Een typisch fenotype na gene knockdown in teken wordt hier getoond, waarbij een groep teken werd geïnjecteerd met pools van dubbelstrengs RNA die werden gebruikt om te screenen op beschermende tekenantigenen.Bij teken die met lichtmicroscopie worden onderzocht, kan cellulaire degeneratie in het tekenweefsel worden waargenomen. Fenotypische veranderingen kunnen gepaard gaan met functieverlies. Zo resulteert RNAI van SUBIN in steriele mannetjes die niet succesvol kunnen paren met de vrouwtjes na RNA-interferentie en teken.Andere methoden kunnen worden gebruikt om de impact van gene silencing op gen- en eiwitexpressie en op de biologie van de teek te bepalen, waaronder real-time R-T-P-C-R, licht-, elektronen- of confocale microscopie, genomics of proteomics. RNA-interferentie kan ook worden uitgevoerd in teekcelculturen en biedt een in vitro methode voor het bestuderen van interacties tussen teekcellen en pathogenen.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

De ziekte van Lyme studies vereisen vaak generatie van de teken besmet met de ziekteverwekker Borrelia burgdorferi, een proces dat normaal gesproken duurt enkele weken. Hier laten we zien een micro-injectie-based tick infectie procedure die kan worden bereikt binnen enkele uren. We tonen ook aan een immunofluorescentie methode voor het in situ lokalisatie van B. burgdorferi in teken.

Methoden voor snelle overdracht en localisatie van Lyme pathogenen in de Tick Gut

De ziekte van Lyme is de meest gerapporteerde vector overgedragen ziekte in Noord-Amerika. De verwekker, Borrelia burgdorferi is een spirocheet bacterie overgedragen door Ixodes teken. Transmissie en detectie van infectie bij diermodellen wordt geoptimaliseerd door het gebruik van teek voeding, die hier beschreven.

Voederen van Ticks on Animals voor Transmissie en Xenodiagnosis in Lyme Disease Research

Het produceren van gezonde laboratoriumopgevoerde tegels is essentieel voor het bestuderen van bosluisbiologie en kruis-pathogeen-interacties. Hier tonen wij een simpel protocol voor onvolgroeide tikvoeding die kosteneffectief en minder stressvol is voor muizen.

Opfok<em&gt; Ixodes scapularis,</em&gt; De Black-legged Tick: Het voeden van onvolwassen stadia op muizen

Genestelde PCR is een eenvoudig, gevoelige en specifieke techniek die kan worden toegepast op de teek die DNA geëxtraheerd om sonde voor Borrelia burgdorferi, de verwekker van de ziekte van Lyme. De eerste PCR experiment maakt gebruik van gen-specifieke primers voor het genereren van lange waarbij, die vervolgens worden sjablonen voor een latere reactie met behulp van interne inleidingen.

Opsporen van de ziekte van Lyme-spirocheet, Borrelia Burgdorferi, in teken met behulp van genestelde PCR

Hier presenteren we een volgende-generatie sequencing-protocol voor het 16S rRNA rangschikken waarmee identificatie en karakterisering van microbiële gemeenschappen binnen de vectoren. Deze methode houdt het DNA-extractie, versterking en barcoding van monsters door middel van PCR, rangschikking op een stroom-cel, en bio-informatica aan sequencedata tot fylogenetische informatie.

Karakterisering van het Microbiome van de teek door Next-Generation 16S rRNA Amplicon sequentiebepaling

In deze studie werd een voedingssysteem ontwikkeld voor nimfen- en larvestadia van harde teek met behulp van een capsule die aan de laboratoriummuis is bevestigd. De voercapsule is gemaakt van flexibele materialen en blijft minstens een week stevig aan de muis vast zitten en maakt een comfortabele monitoring van het voeden van teek mogelijk.

Een capsule-gebaseerd model voor onrijpe Harde Tik Stadia Besmetting op Laboratoriummuizen

Het huidige protocol beschrijft de isolatie van microRNA's uit teken speekselklieren en gezuiverde extracellulaire blaasjes. Dit is een universele procedure die veelgebruikte reagentia en benodigdheden combineert. De methode maakt ook het gebruik van een klein aantal teken mogelijk, wat resulteert in hoogwaardige microRNA's die gemakkelijk kunnen worden gesequenced.

Isolatie van microRNA's van Tick Ex Vivo Speekselklierculturen en Extracellulaire Blaasjes

Het huidige protocol beschrijft een methode voor het injecteren van tekenembryo's. Embryo-injectie is de voorkeurstechniek voor genetische manipulatie om transgene lijnen te genereren.

Embryo-injectietechniek voor genbewerking in de zwartpootteek, Ixodes scapularis

Hier wordt een methode gepresenteerd om teken in vitro te voeden via een kunstmatig membraansysteem om gedeeltelijke of volledige stuwing van een verscheidenheid aan tekenlevensfasen mogelijk te maken.

Teken kunstmatige membraanvoeding voor Ixodes scapularis

Dit artikel presenteert de methodologie voor het blootstellen van mensen aan larvale Ixodes scapularis voor klinisch onderzoek. De techniek is relatief eenvoudig, acceptabel voor de onderzoeksvrijwilligers en kan worden aangepast aan de experimentele behoeften. Dergelijk onderzoek met menselijke proefpersonen moet worden uitgevoerd volgens protocollen voor klinisch onderzoek die zijn goedgekeurd door de bevoegde regelgevende instanties.

Een model voor experimentele blootstelling van mensen aan larvale Ixodes scapularis-teken

Hier presenteren we een protocol om speeksel, hemolymfe, speekselklieren en middendarm te verzamelen, na de dissectie van een individueel gevoede teek, om weefselspecifieke lokalisatie van door teken overgedragen pathogenen te bestuderen om het begrip van vectorcompetentie en pathogeen-microbioominteracties te vergroten.

Extractie van speeksel, hemolymfe, speekselklieren en middendarm van individuele teken (Acari: Ixodidae)

Leer RNA-interferentie in teken via injectie van dubbelstrengig RNA om genexpressie te onderdrukken. Deze methode helpt onderzoekers bij het bestuderen van tekenbiologie en het ontwikkelen van strategieën tegen tekenoverdraagbare ziekten.

RNA-interferentie in teken

Meer video's verkennen