RNA-interferentie in teken

Het algemene doel van deze procedure is om de techniek van RNA-interferentie bij teken door injectie te demonstreren. Dit wordt bereikt door eerst dubbelstrengs RNA te synthetiseren van het gen of de genen van belang. De RNA wordt vervolgens in teken geïnjecteerd, waarna ze gedurende 24 uur in een vochtigheidskamer worden gehouden.

Na deze wachttijd mogen de teken zich voeden met een dier zoals een schaap om uiteindelijk teken te worden. Voedingsparameters zoals gewicht, vervelling en eierpositie, en de expressie van het doelwitgen of de doelwitgenen door middel van real-time R-T-P-C-R worden bepaald. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die het effect van het uitzetten van doelwitgenen op de tekenbiologie aantonen door evaluatie van tekenbiologische parameters en genexpressie door real-time R-T-P-C-R.

Onze groep werkt met teken om moleculaire gebeurtenissen aan de tekenpathogeen-interface te karakteriseren om deze basisinformatie te gebruiken voor de ontwikkeling van methoden voor de bestrijding van tekeninfestatie en de overdracht van pathogeen naar mens en dier. RNA-interferentie is een essentieel hulpmiddel in dit onderzoek geworden omdat het de enige beschikbare methode is voor genetische manipulatie van teken. De functie van veel tekengenen is onbekend.

RNA-interferentie stelt ons in staat om de rol van tekengenen en genexpressie in vele aspecten van tekenbiologie te definiëren, inclusief paring, voortplanting, voeding, spijsvertering, speekselklierfunctie en de vectorcompetentie van de teek voor de overdracht van pathogenen. Het demonstreren van de procedure zal worden gedaan door het teek-RNA-interferentieteam van ons laboratorium, Dr. Ed Lewin, een afgestudeerde student en Busby en ikzelf. Om dubbelstrengs RNA te genereren, synthetiseer eerst oligonucleotide primers die T zeven promotorsequenties bevatten voor in vitro transcriptie van RNA.

Bijvoorbeeld, derma centrum vari lesin. Gebruik de oligonucleotide primers D acht A a T 75 en D acht DVT 73 die hier worden getoond. Versterk het doelwitgen door R-T-P-C-R met behulp van 10 picomol van elk oligonucleotide primer en een tot 10 nanogram totaal teek-RNA.

Zuiver vervolgens het PCR-product. Gebruik vervolgens acht microliter of ongeveer 100 nanogram om dubbelstrengs RNA te synthetiseren. Om de teken voor injectie voor te bereiden, was de teken eerst in de volgende reeks oplossingen, kraanwater 3% waterstofperoxide gedistilleerd water tweemaal, 70% ethanol en twee laatste wasbeurten met gedistilleerd water.

Voer elke wasbeurt uit in een wegwerpbare 50 milliliter centrifugeerbuis door te schudden. Decanteer vervolgens de oplossing door een fijnmazige gaasscherm. Laat de teken drogen op papieren handdoeken, verdeel de teken vervolgens in groepen van 20 tot 50, afhankelijk van het experiment.

Plaats elke groep in een 1.25 ounce plastic beker met een goed sluitende deksel en label elke beker met de experimentele groep. Nummer vervolgens, stel een RNAi-team samen bestaande uit drie personen die het injectieproces zullen uitvoeren. De eerste persoon positioneert elke teek op dubbel plakband bevestigd aan een rood velletje tandheelkundig was.

De tweede persoon injecteert de teken en de derde persoon monitort de teken na injectie, blaast kooldioxide op de teken om ze te activeren en telt en brengt de levende teken over naar bekers gelabeld met het experimentele groepsnummer. Alle teamleden moeten wegwerpbare handschoenen dragen. Om het teekinjectieproces te beginnen, vangt u een teek met behulp van dumont fijne pincetten en plaatst deze met de ventrale zijde naar boven op dubbel plakband bevestigd aan het velletje rood tandheelkundig was. Positioneer de teken dicht bij elkaar in groepen van vijf. Plaats een klein stukje plakband over de monddelen van alle vijf teken.

Om ze verder te beperken, laat u het grootste deel van het lichaam bloot zodat het injectieproces door de teek-injector kan worden waargenomen. Om de teek te injecteren, prikt u een gat in de onderste rechterkwadrant van de ventrale oppervlakte van het exoskelet met behulp van een mono-eject insulinesyringe voorzien van een 29 gauge halve inch naald. Injecteer vervolgens onmiddellijk de teken met 0,2 tot 0,5 microliter dubbelstrengs RNA-oplossing met behulp van een op maat gemaakte Hamilton-syringe en een 33 gauge een inch naald met een 45 graden geslepen punt, plaats de naald goed in de teekholte om de plaatsing en retentie van het dubbelstrengs RNA te waarborgen.

Hoewel er vloeistof vrijkomt na injectie, zal diepe plaatsing van de naald voor injectie ervoor zorgen dat voldoende dubbelstrengs RNA in de teekholte wordt afgezet om genuitsluiting te veroorzaken. Wees voorzichtig om niet te veel in te injecteren, wat het verlies van hemolymf en de dood van de teek zal veroorzaken. Direct na het injecteren van de teken, haalt u ze op van het dubbel plakband met de fijne pincetten en plaatst u ze in een plastic herstelcontainer.

De teken zullen kort inactief blijven na injectie, maar zullen snel beginnen rond te kruipen in de schotel. Activeer de teken door kooldioxide op ze te blazen. Zodra de teken kruipen en actief zijn, zal de injectiewond snel genezen en zullen ze waarschijnlijk overleven.

Tel de teken in elke experimentele groep en plaats elke groep in een gelabelde plastic beker met een goed sluitende deksel. Vervang eventuele teken die in de huidige groep sterven voordat u de volgende experimentele groep injecteert. Reinig de Hamilton-syringe voordat u de volgende experimentele groep injecteert door de spuit te vullen en vervolgens te legen met vers 3% waterstofperoxide.

Herhaal dit 15 keer gevolgd door 15 wasbeurten met steriel water. Zorg ervoor dat u de plunjer van de Hamilton-syringe niet buigt, anders zal de plunjer niet soepel bewegen en reageren op de zachte aanraking die vereist is voor teekinjectie. Na het injecteren, plaats de teken in een kamer met een bak gevuld met water en kaliumsulfaat, die een hoge vochtigheid handhaaft en houd ze een dag vast.

Plaats vervolgens individuele teken in tekenvoedingscellen die