Geoptimaliseerd kleuring en proliferatie Modeling Methoden voor de celdeling Monitoring met behulp van Cell Tracking Kleurstoffen
December 13th, 2012
Succesvol gebruik van cell tracking kleurstoffen aan immuun cel functie en proliferatie monitoren omvat verschillende kritische stappen. We beschrijven werkwijzen voor: 1) het verkrijgen helder, uniform en reproduceerbaar label-ing met membraan kleurstoffen, 2) het selecteren fluorochromen en data acquisitie niet, en 3) het kiezen van een model gebaseerd op celproliferatie kleurstof verdunning kwantificeren.
Het algemene doel van deze methode is om celtraceerkleurstofveren te gebruiken om de mate van celdeling direct te kwantificeren voor verschillende immuuncelsubpopulaties binnen complexe populaties. Dit wordt bereikt door eerst de oudercelpopulatie te labelen met een fluorescerende kleurstof die bekend staat om stabiele binding aan cellulaire eiwitten of om niet-covalent in cellulaire membranen te intercaleren voor het volgen van kleurstof gelabelde cellen die reageren op stimulatie tellers, kleuring met fluorescerende antilichamen en analyse met behulp van multi-parameter flowcytometrie maakt detectie mogelijk van differentiële reacties tussen de geïnteresseerde immuuncelsoorten die worden gestimuleerd, maar kleurstof traceerkleuringsongekleurde controles worden gebruikt om de laagste dochtercelfluorescentie-intensiteit vast te stellen die kan worden onderscheiden van autofluorescentie. Kleurstof gelabelde, maar niet-gereageerde controles worden vervolgens gebruikt om de fluorescentie-intensiteit vast te stellen waarbij de onverdeelde cellen worden gedetecteerd. Stimulatie resulteert doorgaans in een breed scala aan intensiteiten, omdat cellen die reageren op proliferatie progressief zwakker worden, maar niet-responders niet doen.
Uiteindelijk kan het gebruik van peak-modelleringssoftware om de relatieve frequentie van de cellen in verschillende generaties te schatten, een kwantitatieve vergelijking mogelijk maken van de proliferatieve reacties tussen verschillende populaties of stimuli met behulp van metrische zoals proliferatie-index of precursor frequentie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals gelabeld tritium, thy-incorporatie of KI 67 expressie, is dat de DI-verdunning een directe maat voor celdeling biedt die kan worden gecombineerd met andere ME-flowcytometrische metingen zoals immunofenotypering en cytokineproductie. Visuele demonstratie van de methode van membraankleurstofkleuring is nuttig omdat de opname van kleurstof door cellen extreem snel is.
Consequentie, goede techniek is de sleutel tot het verkrijgen van heldere homogene kleuring. Nadat humane perifere mononucleaire bloedcellen zijn geïsoleerd, centrifugeren gedurende vijf minuten bij 300 keer G en kamertemperatuur om besmetting met bloedplaatjes tot een minimum te beperken. Hersuspendeer vervolgens het pellet bij 10 tot de zevende cellen per milliliter in HBSS plus 1%BSA en plaats ze op ijs.
Verwijder en reserveer een 500 microliter Eloqua, vervolgens breng een andere 500 microliter aliquot van cellen over in een 12 bij 75 millimeter conische polypropyleen buis. Voeg 3,5 milliliter HBSS toe en centrifugeer de cellen vijf minuten bij 400 keer G en kamertemperatuur tijdens het wassen. Voeg 0,5 milliliter van diluent C labelvoertuig van de PKH 26 GL kit toe aan een andere 12 bij 75 milliliter conische polypropyleen buis. Zorg ervoor dat het supernatant voorzichtig wordt geaspireerd, waarbij niet meer dan 15 tot 25 microliter restvloeistof achterblijft en zorg ervoor dat er geen cellen worden verwijderd. Voeg vervolgens 0,5 milliliter diluent C labelvoertuig toe aan het cellenpellet en aspibeer en doseer de oplossing meerdere keren om een enkele celsuspensie te verkrijgen.
Bereid nu de twee XD-voorraad voor door twee microliter PKH 26 toe te voegen aan de buis met diluent C. Pipetteer nu onmiddellijk de celsuspensie in vers bereide twee XPKH 26 kleurstofoplossing en aspibeer en doseer gelijktijdig het mengsel meerdere keren om de cellen gelijkmatig over de kleurstof te verspreiden. Voeg na een minuut een milliliter hitte-geïnactiveerd serum toe om de opname van de kleurstof in de celmembranen te stoppen. Na centrifugatie aspireer voorzichtig het supernatant zonder het pellet te verwijderen.
Verspreid vervolgens het pellet in vier milliliter compleet medium met 10%hitte-geïnactiveerd serum en breng de celsuspensie over in een verse polypropyleenbuis. Was de cellen twee keer in HBSS plus 1%BSA, adequaat gekleurde cellen zullen een duidelijke roze tint in het pellet vertonen. Na het opnieuw suspenderen van het cellenpellet in één milliliter HBSS plus 1%BSA, tel de cellen en pas vervolgens het volume aan om een eindconcentratie van 10 tot de zevende cellen per milliliter te verkrijgen. Na het kleuren van de cellen volgens het flowcytometrieprotocol dat in de tabel is geschetst, gebruik de eerste vijf buizen om de voorwaartse en zijwaartse verstrooiingsparameters en de signalen in alle vier de fluorescentiedetectoren in te stellen.
In het bijzonder voor de detector die wordt gebruikt om de PKH 26 fluorescentie in buis twee te bewaken. Controleer of alle PKH 26 gekleurde cellen op de schaal verschijnen als een enkele symmetrische piek in het derde tot vierde decennium met weinig tot geen cellen in het laatste kanaal. Gebruik vervolgens de kleurencompensatiesoftware en de list-mode bestanden die zijn verzameld voor buizen één tot vijf om een kleurenoverlapmatrix voor elk fluro in de detectoren die worden gebruikt om de drie andere fluorochromen te bewaken, vast te stellen.
Pas vervolgens deze matrix toe op het list-mode bestand voor monster zes. Om te verifiëren dat de aanwezigheid van PKH 26 labelen de mogelijkheid om zeven A a D positieve cellen te detecteren niet verandert. Pas nu de net vastgestelde kleurenoverlapmatrix toe op het list-mode bestand voor buis zeven.
Identificeer de CD drie positieve CD vier negatieve en CD drie positieve CD vier positieve populaties op een FE versus een PC plot. Bevestig dat de aanwezigheid van anti CD drie, FE en anti CD vier A PC de mogelijkheid om zeven A a D positieve cellen te detecteren niet verandert. Pas ten slotte de kleurenoverlapmatrix voor buis zeven toe op het list-mode bestand voor buis acht.
Open nu een programma met een proliferatieanalysemodule. Laad het gestimuleerde PKH 26 gekleurde bestand van de te analyseren dataset. Selecteer vervolgens de parameters voor analyse in dit geval, PKH 26 gefilterd op levensvatbare zeven a a d negatieve cd, drie positieve lymfocyten en voorwaartse verstrooiing versus zijwaartse verstrooiing voor uitsluiting van kleine deeltjes en grote aggregaten.
Bij het definiëren van deze gebieden, wees voorzichtig om het hoge voorwaartse verstrooiingsgebied in te sluiten waar blasten zich typisch bevinden. Open vervolgens de proliferatiewizard. Klik op het starttabblad om het gegevensbestand te openen
Overzicht
Dit artikel beschrijft een methode voor het gebruik van celtraceringskleurstoffen om immuunceldeling te kwantificeren. Het proces omvat het labelen van cellen met fluorescerende kleurstoffen, het analyseren ervan met flowcytometrie en het gebruik van piekmodelleringssoftware voor data-interpretatie.
Belangrijke studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Immunologie
- Celbiologie
- Flow Cytometrie
Achtergrond
- Celtraceringskleurstoffen bieden een methode om immuuncelfunctie te monitoren.
- Fluorescente labeling maakt differentiatie van celpopulaties mogelijk.
- Flow cytometrie maakt multi-parameter analyse van celreacties mogelijk.
- Traditionele methoden geven mogelijk geen directe maatstaven voor celdeling.
Doel van de studie
- Om celdeling in immuuncelsubsets te kwantificeren.
- Om een betrouwbaar protocol voor kleurstoflabeling en analyse vast te stellen.
- Om proliferatieve reacties tussen verschillende stimuli te vergelijken.
Gebruikte methoden
- Labeling van immuuncellen met fluorescerende kleurstoffen.
- Flowcytometrische analyse om celproliferatie te beoordelen.
- Gebruik van niet-gestimulatede controles om fluorescentie-drempelwaarden te bepalen.
- Toepassing van piekmodelleringssoftware voor data-analyse.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle labeling resulteert in duidelijke fluorescentiepieken voor verdeelde cellen.
- Stimulering leidt tot een afname van fluorescentie-intensiteit naarmate cellen zich delen.
- Kwantitatieve metrische zoals proliferatie-index kunnen worden afgeleid.
- De methode maakt integratie mogelijk met andere flowcytometrische metingen.
Conclusies
- Celtraceringskleurstoffen bieden een directe maatstaf voor immuunceldeling.
- Het protocol verbetert de mogelijkheid om complexe celpopulaties te analyseren.
- Deze methode biedt voordelen ten opzichte van traditionele proliferatie-assays.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Cell tracking dyes enable direct quantification of immune cell proliferation, providing a critical de-risking step in target validation by linking phenotypic responses to functional outcomes. This method supports predictive confidence in early discovery by generating quantitative proliferation metrics that can be correlated with immunophenotyping and cytokine data. Integration with flow cytometry allows multiplexed analysis, improving assay efficiency and reducing biological ambiguity in lead identification workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by measuring division kinetics in immune cell subsets.
- Operational Value: Supports functional target validation through direct correlation of dye dilution with cellular responses.
- Predictive Value: Generates proliferation index and precursor frequency data to inform portfolio triage and mechanistic de-risking.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces bright, homogeneous staining essential for reproducible quantitative readouts in proliferation assays.
- Operational Value: Requires optimization of dye concentration and mixing protocol to minimize variability and ensure assay robustness.
- Scalability: Compatible with multi-parameter flow cytometry panels, enabling high-content screening of immune modulators.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates comparison of proliferative responses across stimuli or cell types using peak modeling software.
- Operational Value: Requires proper gating strategies and compensation controls to maintain data integrity in complex panels.
- Translational Continuity: Supports biomarker-aligned analysis by enabling concurrent measurement of division and effector function.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, providing direct readouts of cell division that inform go/no-go decisions.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing by quantifying division in response to immunomodulatory stimuli.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible staining when protocols are optimized for dye uptake and quenching.
- Analytics: Provides quantitative outputs such as proliferation index and generation frequency via peak modeling.
- Translational Research: Supports preclinical continuity by allowing correlation of proliferation with phenotypic markers.
- Enterprise Reuse: Represents a standardized, reusable capability for immune profiling across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing reliance on indirect proliferation markers.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized staining, washing, and quenching steps.
- Strategic Value: Improves decision-making by enabling direct comparison of proliferative capacity across conditions.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by quantifying immune cell expansion potential.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry, compensation controls, and proliferation modeling software.
- Depends on consistent dye preparation, mixing technique, and quenching to avoid heterogeneous labeling.
- Necessitates standardization across users and sites to ensure comparable dye dilution profiles.
- Must account for spectral overlap when combining with bright fluorochromes in multi-color panels.
- Limited by dye toxicity and quenching efficiency, which can affect viability and signal stability over time.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
2:19
General Membrane Labeling with PKH26 Cell Tracking Dye
5:43
Flow Cytometer Setup and Staining Verification
7:34
Proliferation Model Selection for Cell Division Monitoring by Dye Dilution
10:16
Results: Optimization of Cell Tracking Dye Staining for Monitoring Cell Division
22:03
Conclusion
