Name: Geoptimaliseerd kleuring en proliferatie Modeling Methoden voor de celdeling Monitoring met behulp van Cell Tracking Kleurstoffen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 22 min 49 s
Description: Leer hoe je celdeling kwantificeert met fluorescerende celtrackingkleurstoffen en flowcytometrie. Deze methode maakt directe meting van proliferatie in immuuncelpopulaties mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs wil in het bijzonder de volgende personen voor hun technische en intellectuele bijdragen aan de ontwikkeling van deze methoden door de jaren heen bedanken: Bruce Bagwell (Verity Software House), Nadège Bercovici (IDM), Lizanne Breslin (Zynaxis Cell Wetenschap en PTI Onderzoek) , Brian Gray (PTI Research), Jan Fisher (Dartmouth Medical School), Alice Givan (Dartmouth Medical School), Betsy Ohlsson-Wilhelm (SciGro, Inc), en Mary Waugh (Dartmouth Medical School). Zij zouden ook graag de Bowdoin klasse van 2006 bedanken uit de jaarlijkse Cursussen in Onderzoeksmethoden en toepassingen van flowcytometrie, die de gegevens weergegeven in figuur 2 gegenereerd. Flow cytometrie werd uitgevoerd bij Flow Roswell Park Cancer Institute Cytometry Laboratory, dat deel uitmaakte opgericht door apparatuur subsidies van de NIH Gedeelde Instrument Program, en krijgt steun van de Core Grant (5 P30 CA016056-29) van het NationaalKanker Instituut aan het Roswell Park Cancer Institute, en aan het Abramson Cancer Center Flowcytometrie en celsortering Resource Laboratorium van de Universiteit van Pennsylvania, dat deel uitmaakte opgericht door apparatuur subsidies van de NIH Gedeelde Instrument Program, en wordt ondersteund door NIH # 2P30 CA016520 van het National Cancer Institute. Het werk getoond in de figuren 3 en 5 werd ook gedeeltelijk ondersteund door SBIR subsidie ​​EB00228 van de National Institutes of Biomedical Imaging and Bioengineering (NIBIB) toegekend aan PTI Research, Inc

1. Algemene Membraan Labeling met PKH26 Mobiele Tracking Dye (Ref. 25; figuur 1) <ol><li> Steriele techniek stappen 1,1 tot 1,9. Bereid ~ 10 7 menselijke perifere mononucleaire bloedcellen of lymfocyten (hPBMC, hPBL) met de laboratorium standaardmethode onder toevoeging van een definitieve 300 g centrifugeren van de bloedplaatjes besmetting te minimaliseren. Resuspendeer cellen bij 10 7 / ml in HBSS +1% BSA en plaats op ijs, reserveren van een 500 pi aliquot (5x10 6 cellen) voor gebruik in stap 2. </li><li> Place 5x10 6 cellen (500 ui) in een 12 x 75 mm conische polypropyleen buis. Was eenmaal met 3,5 ml HBSS. Zorgvuldig aspireren het supernatans, waardoor niet meer dan 15 tot 25 ul van de resterende vloeistof, maar zorg ervoor dat u cellen te verwijderen. Gebruik deze tube naar een 2x celsuspensie te bereiden in stap 1.4. </li><li> Tijdens de cel wassen in Stap 1.2, voeg 0,5 ml van Diluent C labeling voertuig (de PKH26GL kit) een 12 x 75 mm conische polypropyleen buis. Gebruik deze tube naar prepeen 2x PKH26 oplossing in stap 1.5. </li><li> Voeg 0,5 ml van Diluent C labeling voertuig aan de gewassen celpellet van Stap 1.2 en zuig en verdeel 3-4 keer aan een enkele celsuspensie (2x cellen) te verkrijgen. Vermijd schuimvorming en overmatige mengen, die levensvatbaarheid van de cellen en herstel kan verminderen. </li><li> Onmiddellijk na bereiding van de 2x celsuspensie in Stap 1.4, stelt een 2x (4 uM) kleurstofoplossing door toevoeging van 2,0 ul 1,0 mM PKH26 kleurstof stock in ethanol (uit het PKH26GL kit) aan het oplosmiddel C buis geproduceerd in stap 1.3 en vortex te verspreiden gelijkmatig. </li><li> Onmiddellijk na de voorbereiding van de 2x kleurstofoplossing in Stap 1.5, snel pipetteer de 2x celsuspensie van Stap 1.4 in de 2x kleurstof oplossing en tegelijkertijd aanzuigen en dispenseren 3-4 keer volledig cellen verspreiden in kleurstof Niet doen:. Direct toe te voegen 1,0 mM kleurstof cellen; pour 2x cellen in 2x kleurstof, of voeg 2x cellen kleurstof 2x terwijl vortexen. Omdat kleuring is bijna onmiddellijke, zoals methoden leveren minderuniform intensiteiten dan de aanbevolen methode (figuur 2). </li><li> Na 1 min, voeg 1,0 ml van warmte geïnactiveerd serum of HBSS +5% BSA om kleurstof opname te stoppen in celmembranen. Niet voldoende eiwitten gebruiken risico van de vorming van aggregaten kleurstof, die kan pellet met cellen tijdens de wasstappen en onbedoelde kenmerken van andere cellen aanwezig in een experiment. Als medium met 10% hitte-geïnactiveerd serum (CM) of HBSS +1% BSA wordt gebruikt als stopreagens, voert kleuren in een 15 ml conische polypropyleenbuis en voeg ten minste 5,0 ml stopreagens adsorptie van verzekeren zonder rechtspersoonlijkheid kleurstof. </li><li> Centrifugeer de gelabelde cellen gedurende 5 min @ ~ 400 x g. Zorgvuldig aspireren het supernatans zonder het verwijderen van cellen. Was tweemaal het pellet met 4 ml HBSS of CM +1% BSA, dispergeren de pellet ruim voor recentrifugation. Om overdracht van kleurstof geadsorbeerd op buiswanden minimaliseren en maximaliseren wasefficiëntie, breng de cellen een nieuwe polypropyleenbuis na fiRST resuspensie. Opmerking: voldoende gekleurde cellen zal een duidelijke roze tint in de pellet vertonen. </li><li> Resuspendeer de pellet gewassen cel in 1.0 ml HBSS +1% BSA. Tel de cellen bepalen celherstel, en het volume tot een eindconcentratie van 10 7 / ml. Met een zorgvuldige aspiratie moet cel herstel ≥ 85%. Als cel herstel is &lt;70%, de oorzaak voordat u verdergaat. Trek een 150 ul aliquot (1.5x10 6 cellen) en plaats op ijs voor gebruik in stap 2. </li></ol> 2. Voorbereiding van Instrument en Assay Setup Controls (tabel 1) <ol><li> 50 pi aliquot (5x10 5) van ongekleurde cellen van de celsuspensie opgeslagen in Stap 1.1 in vijf verschillende 1,8 ml Eppendorf buisjes: 1, 3, 4, 5 en 7. 50 pi aliquot (5x10 5) van PKH26 pos cellen uit stap 1.9 in elk van drie buizen: 2, 6 en 8. </li><li> Voeg 10 ul IgG blok (100 ug / buis van IgG, zie tabel van reagentia) tot 1-8 Tubesen incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (20-25 ° C). </li><li> Voeg een verzadigende hoeveelheid van het antilichaam (en) aangegeven in Tabel 1 tot Tubes 4, 5, 7 en 8 en incubeer alle monsters (Tubes 1-8) gedurende 30 min bij kamertemperatuur en beschermd tegen licht. </li><li> Voeg 1,5 ml HBSS +1% BSA voor alle monsters, pelleteren van de cellen door centrifugeren (5 min bij 400 xg) en was eenmaal met 1,5 ml HBSS +1% BSA, met zorgvuldige streven naar cel te voorkomen. </li><li> Resuspendeer elk monster in 500 pi HBSS +1% BSA. Eventueel voor monsters die worden geanalyseerd op cytometer, naar een 12 x 75 mm ronde bodem buis. Voeg 10 ul van 100 ug / ml 7-AAD dagelijkse werkvoorraad (zie tabel reagentia) voor buizen 3, 6, 7 en 8 zoals aangegeven in tabel 1. Incubeer op ijs gedurende 30 min voorafgaand aan gebruik in flowcytometer setup en kleuring verificatie (Stap 3). </li></ol> 3. Flowcytometer Setup en kleuring Verificatie <ol><li> Controleer of de stroom cytometer goed werkt, met behulp van het laboratorium procedures vastgesteld voor de dagelijkse kwaliteitscontrole. Controleer of signalen kunnen gemakkelijk worden gedetecteerd in elke spectrale window te gebruiken en detector respons lineair evenredig met de intensiteit in het venster worden gebruikt voor proliferatie controle 14 signaal. </li><li> Acquire FSC vs SSC-gegevens voor Tube 1 met behulp van lineaire weergave schalen. Stel elke detector amplificatie zodat de lymfocytenpopulatie valt in de linker kwadrant van het puntenplot, niet buiten de schaal in een van de parameters en wordt onderbroken door drempelwaardebepaling. Verzamel ungated FSC vs SSC gegevens voor alle monsters in de stappen 3,3 tot 3,7. </li><li> Acquire gegevens voor Tube 1, met behulp van geen kleur compensatie en logaritmische weergave schalen voor alle 4 fluorescentie detectoren. Stel elke detector hoogspanning (HV) de autofluorescentie van ongekleurde lymfocyten plaatsen op schaal met weinig / geen cellen accumuleren in het eerste kanaal. Stel een analyse voor elke grens histogramovereenkomt met de helderste 2% van ongekleurde cellen. </li><li> Met behulp van geen kleur compensatie en de HV instellingen gevestigd in de stappen 3.2 en 3.3, te verkrijgen gegevens voor Tube 2, het verzamelen van FSC, SSC en signalen in alle 4 fluorescentie detectoren. Voor de detector wordt gebruikt om PKH26 fluorescentie monitoren, controleren of alle PKH26 pos cellen verschijnen op schaal als een enkele symmetrische piek in de 3 e -4 e decennium, met weinig / geen cellen in het laatste kanaal. Als er meerdere pieken of vorm van de piek is scheef, herhaalt u stap 1 met aandacht voor minimalisering en mengtechniek (figuur 2) zout. Indien nodig, kleurstof concentratie. </li><li> Met behulp van de instellingen gevestigd in Stap 3.3, verwerven van gegevens voor Tube 3, het verzamelen van FSC, SSC en signalen in alle 4 fluorescentie detectoren. Voor de detector wordt gebruikt om 7-AAD fluorescentie controleren, verifiëren dat 7-AAD pos cellen vallen boven de 2% grens vastgesteld in stap 3.3 (dat wil zeggen, dat niet-levensvatbare cellen goed worden opgelostvan levensvatbare 7-AAD neg cellen). </li><li> Met behulp van de instellingen gevestigd in Stap 3.3, te verkrijgen gegevens voor Buis 4, het verzamelen van FSC, SSC en signalen in alle 4 fluorescentie detectoren. Controleer of CD8 pos cellen goed worden opgelost uit ongekleurde cellen (dat wil zeggen, vallen boven de 2% grens vastgesteld in stap 3.3 voor de FITC detector). Herhaal dit met Tube 5 en controleer of CD8 pos cellen goed worden opgelost uit ongekleurde cellen (dwz val boven de 2% grens vastgesteld in stap 3.3 voor de APC-detector). </li><li> Met instellingen vastgesteld in stap 3,3 verwerven gegevens voor buizen 6, 7 en 8, verzamelen FSC, SSC en signalen in alle vier fluorescentiedetectoren. </li><li> Gebruik de lijstmodus bestanden verzameld Tubes 1-5 en een kleurcompensatie software om een ​​kleur vast overlappen matrix voor elk fluorochroom in de detectoren worden toegepast om de drie andere fluorochromen controleren. Breng deze matrix om de lijst-modus bestand voor Sample 6 en controleer of de aanwezigheid van PKH26 labeling verandert niets aan de mogelijkheid om 7-AAD pos cellen te detecteren. </li><li> Breng de kleur overlappen matrix van stap 3,8 tot de lijst-modus bestand voor monster 7 en controleer of: a) 3 en opgelost subpopulaties (CD3 neg CD4 neg, CD3 pos CD4 neg en CD3 pos CD4 pos) kunnen worden geïdentificeerd op een FITC vs APC puntdiagram en b) de aanwezigheid van anti-CD3-FITC en anti-CD4-APC neemt niet weg mogelijkheid 7-AAD pos cellen te detecteren. Indien de aanwezigheid van anti-CD3-FITC verandert de bovenste 2% grens voor de gegevens op de detector PKH26, past de grens als vereist. </li><li> Breng de kleur overlap matrix van stap 3,8 tot de lijst-modus bestand voor Monster 8. Indien de aanwezigheid van PKH26 etikettering verandert de 2% grens voor de FITC, 7-AAD of APC detectoren van die welke met behulp van de autofluorescentie controle in Stap 3.3, stelt u de grens (&#39;s) zo nodig met behulp van Tube 7 van tabel 1 en controleer of deze blijft mogelijk om distinguish CD3 pos CD4 pos, CD3 pos CD4 neg, en CD3 neg CD4 neg cellen met behulp van de aangepaste grens (en). </li></ol> 4. Proliferatie Model Selectie voor de celdeling Toezicht door Dye Verdunning <ol><li> Bepaal de afstand tussen generaties, die afhankelijk is van het aantal kanalen en logaritmische decennia op cytometer. Voor digitale instrumenten, wordt deze waarde, typisch 4 of 5 jaar, bepaald door het aantal bins in de digitale signaalprocessor. Op analoge instrumenten, waarbij het aantal decennia zelden een geheel getal nauwkeurig modelleren vereist precieze aantal decennia experimenteel worden bepaald. Hiertoe worden de gegevens uit een mengsel van gekalibreerd met fluorescerende kralen fabrikant toegewezen relatieve intensiteiten verkregen op dezelfde detector hoogspanning hier gebruikt in het experiment. De positie van het bolletje pieken maakt de kalibratie van de logaritmische schaal in termen van intensity bereik per log decennium. Concreet gebeurt dit door het plotten van het kanaal nummer voor elke kraal soort tegen de stam van de fabrikant-toegewezen waarde. De helling van de best passende rechte lijn voor de kraal gegevenswaarden geeft het aantal relatieve intensiteit eenheden per kanaal. Vermenigvuldigd met het aantal kanalen zal deze waarde dan het aantal log decennia voor de volledige schaal waarvan het aantal kanalen correspondeert met een tweevoudige afname van de intensiteit (bijvoorbeeld dochter generatie afstand) berekend 14. </li><li> Beslis of u een vaste afstand tussen generaties te gebruiken of om de afstand te zweven. Standard (vaste) instelling zal de generatie afstand waarde bepaald in stap 4.5 de locatie van elke generatie te wijzen en wordt meestal gebruikt wanneer het histogram ontbreekt onderscheiden pieken. Een Vlotter instelling kunt elke generatie piekpositie te bepalen door het histogram vorm en wordt meestal gebruikt wanneer distinguishable generaties pieken zijn evident. </li><li> Beslis of u een vaste piekbreedte gebruiken voor alle generaties of een drijvend breedte. Een vaste breedte gebruikt de SD berekend voor de niet-gestimuleerde controle monster te modelleren alle generaties en wordt meestal gekozen wanneer het monster ontbreekt onderscheiden generaties pieken. Een drijvende breedte maakt het mogelijk het programma om zelfstandig de SD variëren voor elke generatie en wordt best gebruikt met onderscheiden generaties pieken. </li><li> Voer een programma met een wildgroei analyse module (hier ModFit LT versie 3.3). Laad de gestimuleerde PKH26 pos-bestand van de dataset te analyseren (bijvoorbeeld een gestimuleerd 96 uur oude kweek van PKH26 pos cellen tegengekleurd als voor Tube 8 in tabel 1). </li><li> Selecteer de parameters voor analyse in dit geval PKH26 (585/42) op levensvatbare gated (7-AAD neg) CD3 pos lymfocyten en FSC vs SSC aan kleine puin en grote aggregaten (figuur 3) sluiten. Bij het bepalen vandeze regio&#39;s voorzichtig zijn om de hoge voorwaartse verstrooiing gebied waar ontploffing doorgaans te vinden zijn en dat CD3 expressie kan down-gemoduleerd worden in gestimuleerde kweken noteren. </li><li> Maak een nieuwe proliferatie model met behulp van de verspreiding Wizard. Met behulp van de Open Data File (tabblad Start), laadt u de ongestimuleerde PKH26 pos controle bestand en definieer de locatie van de piek kanaal in de ouderlijke verdeling overeenkomt met onverdeelde cellen. </li><li> Analyseer het bestand voor de ongestimuleerde PKH26 pos controle, wijzend op de waarden voor ouders piekpositie en breedte (standaarddeviatie). Indien een vast piekbreedte (SD) gewenst is, controleer Lock SD. </li><li> Plaats de PKH26 neg control (bijvoorbeeld een 96 uur oude kweek van PKH26 neg cellen tegengekleurd als voor Tube 7 in Tabel 1). Pas het aantal generaties door de piek-kanaal voor de zwakste generatie boven de PKH26 neg controle. Dit bepaalt de number van dochter generaties het model nauwkeurig passen en is meestal zes tot negen generaties. </li><li> Open het gegevensbestand voor de gestimuleerde monster (bijvoorbeeld een gestimuleerde 96 uur oude kweek van PKH26 pos cellen tegengekleurd als voor Tube 8 in tabel 1) en bevestigen dat de regio&#39;s voor de ouderlijke piek positie en de SD, zoals gedefinieerd in stap 4,7 ongewijzigd blijven. Als vaste generaties afstand gewenst is, selecteert u Standaard model optie, anders selecteer de Floating optie. </li><li> Analyseer elke experimentele bestand in de dataset met dezelfde model gedefinieerd in stap 4.9. Kleine aanpassingen aan de ouderlijke piekpositie kunnen nodig zijn voor de beste pasvorm als zowel visueel als door de verminderde chi kwadraat (RCS) waarde gedefinieerd. </li><li> Noteer de gewenste proliferatie metrics gevolg van de best-fit voor elke experimentele bestand in de dataset. Voor een uitgebreide beschrijving van mogelijke metrics zie ref. 22. </li></ol>

<ol><li>Poon, R. Y., Ohlsson-Wilhelm, B. M., Bagwell, C. B., Muirhead, K. A. Use of PKH Membrane Intercalating Dyes to Monitor Cell Trafficking and Function. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPoon%2C+RY+%22Living+Color%3A+Flow+Cytometry+and+Cell+Sorting+Protocols%22">Living Color: Flow Cytometry and Cell Sorting Protocols</a>. Diamond, R. A., DeMaggio, S. , Springer-Verlag. New York, NY. 302-352 (2000).</li>
<li>Wallace, P. K., Muirhead, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Tracking+2007%3A+A+Proliferation+of+Probes+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Invest%22%5BJournal%5D)">Cell Tracking 2007: A Proliferation of Probes and Applications.</a> Immunol. Invest. 36, 527-562 (2007).</li>
<li>Hawkins, E. D., Hommel, M., Turner, M. L., Battye, F. L., Markham, J. F., Hodgkin, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+lymphocyte+proliferation%2C+survival+and+differentiation+using+CFSE+time-series+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Measuring lymphocyte proliferation, survival and differentiation using CFSE time-series data.</a> Nat. Protoc. 2, 2057-2067 (2007).</li>
<li>Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+lymphocyte+proliferation+in+vitro+and+in+vivo+with+the+intracellular+fluorescent+dye+carboxyfluorescein+diacetate+succinimidyl+ester%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester.</a> Nat. Protoc. 2, 2049-2056 (2007).</li>
<li>Bolton, D. L., Minang, J. T., Trivett, M. T., Song, K., Tuscher, J. J., Li, Y., Piatak, M., O'Connor, D., Lifson, J. D., Roederer, M., Ohlen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trafficking%2C+Persistence%2C+and+Activation+State+of+Adoptively+Transferred+Allogeneic+and+Autologous+Simian+Immunodeficiency+Virus-Specific+CD8%2B+T+Cell+Clones+during+Acute+and+Chronic+Infection+of+Rhesus+Macaques%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Trafficking, Persistence, and Activation State of Adoptively Transferred Allogeneic and Autologous Simian Immunodeficiency Virus-Specific CD8+ T Cell Clones during Acute and Chronic Infection of Rhesus Macaques.</a> J. Immunol. 184, 303-314 (2010).</li>
<li>Juopperi, T. A., Sharkis, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Quiescent+Murine+Hematopoietic+Stem+Cells+by+Homing+Properties%5BTitle%5D)+AND+%22Meth.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of Quiescent Murine Hematopoietic Stem Cells by Homing Properties.</a> Meth. Mol. Biol. 430, 21-30 (2008).</li>
<li>Kusumbe, A. P., Bapat, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+and+aneuploid+populations+within+developing+tumors+are+the+major+determinants+of+tumor+dormancy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells and aneuploid populations within developing tumors are the major determinants of tumor dormancy.</a> Cancer Res. 69, 9245-9253 (2009).</li>
<li>Pece, S., Tosonim, D., Confalonieri, S., Mazzarol, G., Vecchi, M., Ronzoni, S., Bernard, L., Viale, G., Pelicci, P. G., Fiore, P. P. D. i <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+and+Molecular+Heterogeneity+of+Breast+Cancers+Correlates+with+Their+Cancer+Stem+Cell+Content%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Biological and Molecular Heterogeneity of Breast Cancers Correlates with Their Cancer Stem Cell Content.</a> Cell. 140, 62-73 (2010).</li>
<li>Gertner-Dardenne, J., Poupot, M., Gray, B. D., Fournié, J. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipophilic+fluorochrome+trackers+of+membrane+transfers+between+immune+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Invest%22%5BJournal%5D)">Lipophilic fluorochrome trackers of membrane transfers between immune cells.</a> Immunol. Invest. 36, 665-685 (2007).</li>
<li>Bercovici, N., Givan, A. L., Waugh, M. G., Fisher, J. L., Vernel-Pauillac, F., Ernstoff, M. S., Abastado, J. P., Wallace, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparameter+precursor+analysis+of+T-cell+responses+to+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Multiparameter precursor analysis of T-cell responses to antigen.</a> J. Immunol. Methods. 276, 5-17 (2003).</li>
<li>Givan, A. L., Fisher, J. L., Waugh, M. G., Bercovici, N., Wallace, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+cell-tracking+dyes+to+determine+proliferation+precursor+frequencies+of+antigen-specific+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of cell-tracking dyes to determine proliferation precursor frequencies of antigen-specific T cells.</a> Methods Mol. Biol. 263, 109-124 (2004).</li>
<li>Schwaab, T., Tretter, C. P., Gibson, J. J., Cole, B. F., Schned, A. R., Harris, R., Fisher, J. L., Crosby, N., Stempkowski, L. M., Heaney, J. A., Ernstoff, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-related+immunity+in+prostate+cancer+patients+treated+with+human+recombinant+granulocyte+monocyte-colony+stimulating+factor+%28GM-CSF%29%5BTitle%5D)+AND+%22Prostate%22%5BJournal%5D)">Tumor-related immunity in prostate cancer patients treated with human recombinant granulocyte monocyte-colony stimulating factor (GM-CSF).</a> Prostate. 66 (6), 667-674 (2006).</li>
<li>Bantly, A. D., Gray, B. D., Breslin, E., Weinstein, E. G., Muirhead, K. A., Ohlsson-Wilhelm, B. M., Moore, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellVue+Claret%2C+a+New+Far-Red+Dye%2C+Facilitates+Polychromatic+Assessment+of+Immune+Cell+Proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Invest%22%5BJournal%5D)">CellVue Claret, a New Far-Red Dye, Facilitates Polychromatic Assessment of Immune Cell Proliferation.</a> Immunol. Invest. 36, 581-605 (2007).</li>
<li>Givan, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+flow+cytometric+assay+for+quantitation+of+rare+antigen-specific+T-cells%3A+using+cell-tracking+dyes+to+calculate+precursor+frequencies+for+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Invest%22%5BJournal%5D)">A flow cytometric assay for quantitation of rare antigen-specific T-cells: using cell-tracking dyes to calculate precursor frequencies for proliferation.</a> Immunol. Invest. 36, 563-580 (2007).</li>
<li>Tario, J. D., Gray, B. D., Wallace, S. S., Muirhead, K. A., Ohlsson-Wilhelm, B. M., Wallace, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+lipophilic+tracking+dyes+for+monitoring+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Invest%22%5BJournal%5D)">Novel lipophilic tracking dyes for monitoring cell proliferation.</a> Immunol Invest. 36, 861-885 (2007).</li>
<li>Wallace, P. K., Tario, J. D. Jr, Fisher, J. L., Wallace, S. S., Ernstoff, M. S., ,, Muirhead, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+Antigen-Driven+Responses+by+Flow+Cytometry%3A+Monitoring+Proliferation+by+Dye+Dilution%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Tracking Antigen-Driven Responses by Flow Cytometry: Monitoring Proliferation by Dye Dilution.</a> Cytometry. 73, 1019-1034 (2008).</li>
<li>Barth, R. J., Fisher, D. A., Wallace, P. K., Channon, J. Y., Noelle, R. L., Gui, J., Ernstoff, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Randomized+Trial+of+Ex+vivo+CD40L+Activation+of+a+Dendritic+Cell+Vaccine+in+Colorectal+Cancer+Patients%3A+Tumor-Specific+Immune+Responses+Are+Associated+with+Improved+Survival%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A Randomized Trial of Ex vivo CD40L Activation of a Dendritic Cell Vaccine in Colorectal Cancer Patients: Tumor-Specific Immune Responses Are Associated with Improved Survival.</a> Clin. Cancer Res. 16, 5548-5556 (2010).</li>
<li>Tario, J. D., Muirhead, K. A., Pan, D., Munson, M., Wallace, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+Immune+Cell+Proliferation+and+Cytotoxic+Potential+Using+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Meth.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Tracking Immune Cell Proliferation and Cytotoxic Potential Using Flow Cytometry.</a> Meth. Mol. Biol. 699, 119-164 (2011).</li>
<li>Fuse, S., Underwood, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+Analysis+of+In+Vivo+CD8%2B+T+Cell+Cytotoxicity+Against+Multiple+Epitopes+using+Multicolor+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Invest%22%5BJournal%5D)">Simultaneous Analysis of In Vivo CD8+ T Cell Cytotoxicity Against Multiple Epitopes using Multicolor Flow Cytometry.</a> Immunol. Invest. 36, 829-845 (2007).</li>
<li>Schütz, C., Fleck, M., Mackensen, A., Zoso, A., Halbritter, D., Schneck, J. P., Oelke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Killer+artificial+antigen-presenting+cells%3A+a+novel+strategy+to+delete+specific+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Killer artificial antigen-presenting cells: a novel strategy to delete specific T cells.</a> Blood. 111, 3546-3552 (2008).</li>
<li>Zaritskaya, L., Shurin, M. R., Sayers, T. J., Malyguine, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+flow+cytometric+assays+for+monitoring+cell-mediated+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev.+Vaccines%22%5BJournal%5D)">New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity.</a> Expert Rev. Vaccines. 9, 601-616 (2010).</li>
<li>Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpretation+of+cellular+proliferation+data%3A+Avoid+the+panglossian%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Interpretation of cellular proliferation data: Avoid the panglossian.</a> Cytometry. 79A, 95-101 (2011).</li>
<li>Quah, B. J. C., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Use+of+Carboxyfluorescein+Diacetate+Succinimidyl+Ester+%28CFSE%29+to+Monitor+Lymphocyte+Proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation.</a> J. Vis. Exp. (44), e2259(2010).</li>
<li>PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kits for General Cell Membrane Labeling [Internet]. , Sigma-Aldrich. Available from:
		
	 <a target="_blank" href="http://www.sigmaaldrich.com/etc/medialib/docs/Sigma/Bulletin/mini26bul.Par.0001.File.tmp/mini26bul.pdf">http://www.sigmaaldrich.com/etc/medialib/docs/Sigma/Bulletin/mini26bul.Par.0001.File.tmp/mini26bul.pdf</a> (2012).</li>
<li>Houlihan, D. D., Newsome, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+Review+of+Clinical+Trials+of+Bone+Marrow+Stem+Cells+in+Liver+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Critical Review of Clinical Trials of Bone Marrow Stem Cells in Liver Disease.</a> Gastroenterology. 135, 438-450 (2008).</li>
<li>Brusko, T. M., Hulme, M. A., Myhr, C. B., Haller, M. J., Atkinson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+the+In+Vitro+Suppressive+Capacity+of+Regulatory%5BTitle%5D)+AND+%22T+Cells.+Immunol.+Invest%22%5BJournal%5D)">Assessing the In Vitro Suppressive Capacity of Regulatory.</a> T Cells. Immunol. Invest. 36, 607-628 (2007).</li>
</ol>

K. Humphrey, JD Tario, Jr en PK Wallace hebben ontvangen pre-commerciële cel bijhouden van reagentia voor de evaluatie van Life Technologies, Inc en BD Biosciences. AD Bantly en JS Moore hebben ontvangen pre-commerciële cel bijhouden van reagentia voor de evaluatie van Life Technologies, Inc en financiering van PTI Research, Inc voor pre-commerciële karakterisering van verschillende CellVue cel bijhouden van kleurstoffen. K. Muirhead is in dienst van SciGro, Inc, die consultancy diensten levert aan Phanos Technologies, Inc (eigenaar van de PKH en CellVue kleurstoffen) en biedt back-up technische ondersteuning voor Sigma-Aldrich en Moleculaire Targeting Technologies, Inc (distributeurs van deze kleurstoffen). Productie en gratis toegang tot dit artikel wordt gesponsord door Sigma-Aldrich.

De hier beschreven methoden zijn die in onze gezamenlijke laboratoria om het meest betrouwbaar optimale resultaten te geven voor hPBMC etikettering gebruik van membraan kleurstoffen 13,16,18 en voor lymfocyten subgroep fenotypering en proliferatie volgen met behulp van membraan of eiwit kleurstoffen 2,11,13,16, 18. Zoals weergegeven in figuren 1 en 2 is helder uniforme etikettering het gemakkelijkst bereikt door beperking van de aanwezigheid van fysiologische zouten en met een mengtechniek die resulteert in snelle, homogene blootstelling van alle cellen met dezelfde concentratie van de kleurstof. Omdat kleuring met membraan kleurstoffen geschiedt door verdeling in de lipide dubbellaag, kunnen andere variabelen die vrije kleurstof concentratie niet verandert ook invloed labelingsefficiëntie. Bijvoorbeeld het labelen in ronde bodem polystyreenbuizen resulteert in minder efficiënte uitwassen van zouten voordat resuspensie in Diluent C en in gereduceerde vrije kleurstof door adsorptie concentratie kleurstof buiswanden namebij lagere kleurstofconcentraties. Beide factoren meestal breder kleuring dan wanneer distributies labeling gebeurt met conische bodem polypropyleenbuisjes (figuren 3, 4 en geeft ongepubliceerde resultaten). Sample leeftijd en het type kan ook van invloed piekbreedte zelfs wanneer geoptimaliseerde vlekken procedures worden gebruikt. Bijvoorbeeld, CV&#39;s voor PKH26 pos lymfocyten geïsoleerd uit vers getapt bloed variëren van 14-20% (figuur 3, ref. 13 en niet gepubliceerde resultaten), terwijl cv&#39;s voor lymfocyten geïsoleerd van 24 uur oude bloedmonsters of TRIMA pheresis filters bereik 25 tot 30 % (Figuur 4 en Ref. 18). Kleuring uniformiteit en de mate waarin niet-levensvatbare cellen kunnen worden uitgesloten van de analyse worden getroffen of onderscheiden dochter pieken zijn duidelijk in de kleurstof verdunning profiel, wat invloed keuze van proliferatie model past de waargenomen data (figuren 5 en 6 </strong&gt;). Hoewel ModFit (Verity Software House, Topsham, ME) wordt hier gebruikt als voorbeeld van software gebruikt om waarden zoals celproliferatie en precursorfrequentie (figuren 3, 5 en 6, tabel 3) te genereren, andere programma modules bevatten te analyseren proliferatie data. Deze omvatten FCSExpress (De Novo Software, Los Angeles, CA) en FlowJo (Boom Star, Inc, Ashland, OR). Al deze programma&#39;s een niet-lineaire kleinste kwadraten analyse iteratief de beste fit met de ruwe data door de positie, hoogte en SD (of breedte) van Gaussian pieken van opeenvolgende generaties dochter. Proliferatieve index (PI) en precursorfrequentie (PF) zijn de meest gebruikte maatregelen mate van proliferatie. PI, zoals gedefinieerd door ModFit, is een maat voor de toename van het aantal cellen in de loop van de test, analoog aan de &quot;stimulatie-index&quot; van een thymidine opname assay. PF geeft de fractie van cellen in de eerste population dat aan de prikkel reageerde door proliferatie. Voorzichtigheid is geboden, echter, bij het ​​lezen van de literatuur sinds terminologie varieert enigszins tussen softwarepakketten (bijvoorbeeld, FlowJo en ModFit gebruiken verschillende definities en berekeningen voor wat bedoeld wordt met &quot;Proliferatie Index&quot;) 22. De kritieke problemen hier besproken voor de etikettering en de proliferatie analyse met membraan kleurstoffen worden ook ondervonden bij het gebruik van eiwitten kleurstoffen. Zo moet aandacht voor mengtechniek worden opgemerkt, samen met uitsluiting van dode / stervende cellen, om de uniforme verdeling en onderscheiden pieken dochter verkrijgen met behulp CFSE (figuur 6) 2-4,13,18,24. Geschikte keuze van fluorochromen voor fenotypering en levensvatbaarheidsbeoordeling is ook belangrijk om buitensporige spectrale overlap en onvermogen om antilichaam positieve cellen herkennen, vooral zichtbare emitting eiwit kleurstoffen zoals CFSE 2-4,11,13,16,18 </sup&gt;. Vermindering van de concentratie kleurstof volgen verlaagt de compensatie problemen in aangrenzende spectrale kanalen, maar beperkt ook het aantal celdelingen die kunnen worden gecontroleerd voordat dochtercel intensiteiten beginnen te overlappen met autofluorescentie. U kunt ook van nieuwere cel bijhouden van kleurstoffen, zoals het verre rode emitterende CellVue Claret (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) of violet emitterende CellTrace Violet (Life Technologies, Grand Island, NY) kan de schadevergoeding problemen (figuur 6) te verminderen. Ten slotte, hoewel membraan kleurstoffen algemeen de neiging om minder toxiciteit 11,26 vertonen, is het mogelijk om over-label cellen met klasse kleurstof. Het is dus altijd moet worden nagegaan of de concentratie van de gebruikte kleurstof volgen niet de functionaliteit van de cellen worden gevolgd (figuur 6) 3,13,16,18 gewijzigd.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagens of uitrusting </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Commercieel Gekocht </td></tr><tr><td> 7-Aminoactinomycin D </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A9400 </td><td></td></tr><tr><td> Bovine serum albumine (BSA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A4503 </td><td></td></tr><tr><td> Foetaal runderserum (FBS) </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S11150 </td><td></td></tr><tr><td> Hanks gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) </td><td> Life Technologies </td><td> 14175-079 </td><td> Calcium en magnesium gratis, zonder fenol rood </td></tr><tr><td> Human IgG Cohn-fractie II en III globuline </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G-4386 </td><td></td></tr><tr><td> Muis anti-humaan CD3-FITC </td><td> BD Biosciences </td><td> 349201 </td><td> Verzadigende concentratie zoals bepaald door titratie laboratorium </td></tr><tr><td> Muis anti-humaan CD4-APC </td><td> BD Biosciences </td><td> 340672 </td><td> Verzadigende concentratie zoals bepaald door titratie laboratorium </td></tr><tr><td> Muis anti-humaan CD4-PECy7 </td><td> BD Biosciences </td><td> 348799 </td><td> Verzadigende concentratie zoals bepaald door titratie laboratorium </td></tr><tr><td> Muis anti-humaan CD8-FITC </td><td> BD Biosciences </td><td> 347313 </td><td> Verzadigende concentratie zoals bepaald door titratie laboratorium </td></tr><tr><td> Muis anti-humaan CD8-APC </td><td> Caltag (Life Technologies) </td><td> MHCD0805 </td><td> Verzadigende concentratie zoals bepaald door titratie laboratorium </td></tr><tr><td> Muis anti-humaan CD19-APC </td><td> Caltag (Life Technologies) </td><td> MHCD1905 </td><td&gt; verzadigende concentratie zoals bepaald door titratie laboratorium </td></tr><tr><td> Muis anti-humaan CD25-APC </td><td> BD Biosciences </td><td> 340938 </td><td> Verzadigende concentratie zoals bepaald door titratie laboratorium </td></tr><tr><td> Muis anti-humaan CD127-PE </td><td> BD Biosciences </td><td> 557938 </td><td> Verzadigende concentratie zoals bepaald door titratie laboratorium </td></tr><tr><td> Muis anti-humaan CD3 </td><td> eBiosciences </td><td> 16-0037-85 </td><td> 1,0 mg / ml; azide free </td></tr><tr><td> Muis anti-humaan CD28 </td><td> eBiosciences </td><td> 16-0289-85 </td><td> 1,0 mg / ml; azide free </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Gibco </td><td> 21300-058 </td><td></td></tr><tr><td> PKH26 rode fluorescerende cellen linker kit met 10-3M PKH26 in EtOH en Diluent C </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> PKH26GL-1KT of MINI26-1KT </td><td> Procedures in stap 1 zijn ook van toepassingtot kits bevatten PKH67 of andere CellVue kleurstoffen </td></tr><tr><td> CellVue Claret veel rode fluorescerende cel linker kit met 10-3M CellVue Claret in EtOH en Diluent C </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> MINCLARET-1KT of MIDCLARET-1KT </td><td></td></tr><tr><td> 5 - (en-6)-carboxyfluoresceïne diacetaat, succinimidylester (CFDA-SE) </td><td> Invitrogen (Life Technologies) </td><td> C34554 </td><td> Niet-fluorescerende, gesplitst door esterases membraan te vormen fluorescent amino-reactieve carboxyfluoresceïne succinimidylester (CFSE) </td></tr><tr><td> LIVE / DEAD Muur Violet </td><td> Invitrogen (Life Technologies) </td><td> L34955 </td><td></td></tr><tr><td> Steriele 12 x 75 mm conische polypropyleen buizen &amp; caps </td><td> VWR </td><td> 60818-102 </td><td> Geeft een beter membraan kleurstof vlekken efficiëntie (minder kleurstof adsorptie; minder celverlies tijdens supernatant aspiratie) </td></tr><tr><td> 12 x 75 mm round onderkant polystyreenbuizen </td><td> Becton Dickinson </td><td> 21008-936 </td><td></td></tr><tr><td> Flowcytometer </td><td> BD Bioscience </td><td> FACSCalibur LSRFortessa </td><td> Elke cytometer kunnen FITC, PKH26 en 7-AAD (bijv. 488 nm.; Em 520 nm, 567 nm en 655 nm respectievelijk) detecteren en APC ex. 633 tot 640 nm; em. 660 nm) </td></tr><tr><td> Flowcytometer </td><td> Beckman Coulter </td><td> LSRII CYAN </td><td> Elke cytometer kunnen FITC, PKH26 en 7-AAD (bijv. 488 nm.; Em 520 nm, 567 nm en 655 nm respectievelijk) detecteren en APC ex. 633 tot 640 nm; em. 660 nm) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Laboratorium Voorbereid </td></tr><tr><td> 7-Aminoactinomycin D, geconcentreerde voorraad </td><td> NA </td><td> NA </td><td> 1 mg / ml in PBS. Freeze in aliquots en bewaar bij -20 ° C. </td></tr><tr><td> 7-Aminoactinomycin D, workoning stock </td><td> NA </td><td> NA </td><td> 100 ug / ml in PBS, dagelijks bereiden van 1 mg / ml ingevroren voorraad. </td></tr><tr><td> IgG blok </td><td> NA </td><td> NA </td><td> HBSS + 10 mg / ml humaan IgG Cohn-fractie II en III globulinen + 10 mg / ml BSA. </td></tr></tbody></table>

geoptimaliseerd kleuring en proliferatie modeling methoden voor de celdeling monitoring met behulp van cell tracking kleurstoffen

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescente kleurstoffen cell tracking in combinatie met vloeien en beeldcytometrie, zijn krachtige instrumenten om de interacties en lot van verschillende celtypen in vitro en in vivo te bestuderen. 1-5 Hoewel er letterlijk duizenden publicaties met dergelijke kleurstoffen, sommige de meest voorkomende cell tracking toepassingen zijn onder meer de controle van: <ol><li> stam en progenitor cel rust, proliferatie en / of differentiatie 6 tot 8 </li><li> antigen-driven membraan overdracht 9 en / of precursor celproliferatie en 3,4,10-18 </li><li> immuun regulerende en effector cel functie 1,18-21. </li></ol> In de handel verkrijgbare cell tracking kleurstoffen variëren sterk in hun chemie en fluorescentie eigenschappen, maar de grote meerderheid vallen in een van twee klassen op basis van hun mechanisme van de cel etikettering. &quot;Membraan kleurstoffen&quot;, gekenmerkt door PKH26, zijn sterk lipofiele kleurstoffen thoed partitie stabiel, maar niet-covalent in celmembranen 1,2,11. &quot;Protein kleurstoffen&quot;, gekenmerkt door CFSE, zijn amino-reactieve kleurstoffen die stabiele covalente bindingen vormen met celeiwitten 4,16,18. Elke klasse heeft zijn eigen voordelen en beperkingen. De sleutel tot een succesvolle verwerking, met name in veelkleurige studies waar meerdere kleurstoffen worden gebruikt om verschillende soorten cellen te volgen, is dan ook te begrijpen van de cruciale problemen waarmee optimaal gebruik van elke klasse 2-4,16,18,24. De protocollen hier opgenomen wijzen op drie meest voorkomende oorzaken van een slechte of wisselende resultaten bij het gebruik van cel-tracking kleurstoffen. Deze zijn: <ol><li> Het niet heldere, uniforme, reproduceerbare etikettering te bereiken. Dit is een noodzakelijke startpunt voor een cell tracking studie, maar vereist aandacht voor verschillende variabelen bij het gebruik van membraan kleurstoffen dan bij het gebruik van eiwitten kleurstoffen of evenwicht bindende reagentia zoals antilichamen. </li><li> Suboptimale fluorochroom combinaties eennd / of het niet in kritieke schadevergoeding controles omvatten. Tracking kleurstof fluorescentie is typisch 10 februari-10 maart keer helderder dan antilichaam fluorescentie. Het is daarom essentieel om te verifiëren dat de aanwezigheid van tracking kleurstof niet de mogelijkheid om andere probes worden gebruikt detecteren nemen. </li><li> Het uitblijven van een goede fit met piek modeling software te verkrijgen. Dergelijke software maakt het mogelijk kwantitatieve vergelijking van proliferatieve reacties in verschillende populaties of stimuli op basis van precursorfrequentie of andere statistieken. Het verkrijgen van een goede pasvorm, vereist echter uitsluiting van dode / stervende cellen die kunnen vervormen kleurstof verdunning profielen en afstemming van de uitgangspunten van het model met de kenmerken van de waargenomen kleurstof verdunning profiel. </li></ol> Hier gegeven voorbeelden laten zien hoe deze variabelen kunnen beïnvloeden resultaten bij gebruik membraan en / of eiwit kleurstoffen celproliferatie controleren.

Succesvol gebruik van cell tracking kleurstoffen aan immuun cel functie en proliferatie monitoren omvat verschillende kritische stappen. We beschrijven werkwijzen voor: 1) het verkrijgen helder, uniform en reproduceerbaar label-ing met membraan kleurstoffen, 2) het selecteren fluorochromen en data acquisitie niet, en 3) het kiezen van een model gebaseerd op celproliferatie kleurstof verdunning kwantificeren.

Geoptimaliseerd kleuring en proliferatie Modeling Methoden voor de celdeling Monitoring met behulp van Cell Tracking Kleurstoffen

Fluorescerende celtrackingkleurstoffen zijn, in combinatie met flowcytometrie en beeldcytometrie, krachtige instrumenten om de interacties en het lot van ... te bestuderen.

Het algemene doel van deze methode is om cell-trackingkleurstoffen te gebruiken om de mate van celdeling voor verschillende immuuncel-subsets binnen complexe populaties direct te kwantificeren. Dit wordt bereikt door eerst de oudercelpopulatie te labelen met een fluorescente kleurstof die bekend staat om een stabiele binding met cellulaire eiwitten of die niet-covalent intercaleert in cellulaire membranen; door het volgen van kleurstofgelabelde cellen die reageren op stimulatie, kleuring met fluorescente antilichamen en analyse via multi-parameter flowcytometrie, kunnen differentiële responsen tussen de gestimuleerde immuunceltypen van belang worden gedetecteerd. Controlemonsters zonder trackingkleurstof worden gebruikt om de laagste fluorescentie-intensiteit van dochtercellen vast te stellen die van autofluorescentie kan worden onderscheiden, terwijl gelabelde maar ongestimuleerde controles vervolgens worden gebruikt om de fluorescentie-intensiteit vast te stellen waarbij niet-gedeelde cellen worden gedetecteerd. Stimulatie resulteert doorgaans in een breed scala aan intensiteiten, aangezien cellen die prolifereren als reactie daarop progressief minder fel worden, terwijl niet-responders dat niet zijn.Uiteindelijk kan het gebruik van software voor piekmodellering om de relatieve frequentie van cellen in verschillende generaties te schatten, een kwantitatieve vergelijking mogelijk maken van de proliferatieve responsen over verschillende populaties of stimuli heen, met behulp van metrieken zoals de proliferatie-index of de precursorfrequentie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals tritiatied incorporates of KI 67-expressie, is dat de DI-verdunning een directe maat voor celdeling biedt die kan worden gecombineerd met andere flowcytometrische metingen, zoals immunofenotypering en cytokinproductie. Een visuele demonstratie van de methode voor membraankleuring is nuttig, aangezien de opname van kleurstof door cellen extreem snel verloopt.Bijgevolg is een goede techniek essentieel voor het verkrijgen van een heldere, homogene kleuring. Nadat mononucleaire cellen uit menselijk perifeer bloed zijn geïsoleerd, wordt er vijf minuten gecentrifugeerd bij 300 ×g en kamertemperatuur om plaatjescontaminatie te minimaliseren. Resuspendeer vervolgens het pellet op een concentratie van 10⁷ cellen per milliliter in HBSS plus 1% BSA en plaats deze op ijs.Verwijder en reserveer een aliquot van 500 µL, en breng vervolgens een andere aliquot van 500 µL cellen over in een conische polypropyleen buis van 12 bij 75 mm. Voeg 3,5 mL HBSS toe en centrifugeer de cellen gedurende vijf minuten bij 400 ×g en kamertemperatuur; voeg tijdens het wassen 0,5 mL Diluent C labeling vehicle uit de PKH 26 GL kit toe aan een andere conische polypropyleen buis van 12 bij 75 mm. Aspireer voorzichtig het supernatant, waarbij niet meer dan 15 tot 25 µL aan residu-vloeistof overblijft en zorgvuldig wordt voorkomen dat er cellen worden verwijderd. Voeg vervolgens 0,5 mL Diluent C labeling vehicle toe aan de celpellet en aspireer en dispenseer de oplossing meerdere keren om een enkelcellige suspensie te verkrijgen.Bereid nu de 2X XD-voorraadoplossing door 2 µL PKH 26 toe te voegen aan de buis met verdunningsvloeistof C. Pipetteer direct daarna de celsuspensie in de vers bereide 2X PKH 26-kleurstofoplossing en aspireer en dispenseer het mengsel gelijktijdig meerdere keren om de cellen gelijkmatig door de kleurstof te verspreiden. Voeg na één minuut 1 mL hitte-geïnactiveerd serum toe om de opname van de kleurstof in de celmembranen te stoppen. Aspireer na het centrifugeren van de cellen voorzichtig het supernatant zonder de pellet te verwijderen.Resuspendeer de pellet vervolgens in vier milliliter compleet medium met 10% hitte-inactiverd serum en breng de celsuspensie over naar een nieuwe polypropyleenbuis. Was de cellen tweemaal in HBSS plus 1% BSA; adequaat gekleurde cellen zullen een duidelijk roze tint in de pellet vertonen. Nadat de celpellet is geresuspendeerd in één milliliter HBSS plus 1% BSA, worden de cellen geteld en wordt het volume vervolgens aangepast om een uiteindelijke concentratie van 10⁷ cellen per milliliter te verkrijgen. Nadat de cellen zijn gekleurd volgens het flowcytometrische protocol in de tabel, worden de eerste vijf buizen gebruikt om de parameters voor forward scatter en side scatter en de signalen in alle vier de fluorescentiedetectoren in te stellen.In het bijzonder voor de detector die wordt gebruikt om de PKH 26-fluorescentie in buis twee te monitoren. Verifieer dat alle met PKH 26 gekleurde cellen op de schaal verschijnen als één symmetrische piek in het derde tot vierde decennium, met weinig tot geen cellen in het laatste kanaal. Gebruik vervolgens de software voor kleurcompensatie en de in lijstmodus verzamelde bestanden voor buis één tot vijf om een kleuroverlapmatrix op te stellen voor elke fluorochroom in de detectoren die worden gebruikt om de drie andere fluorochromen te monitoren.Pas deze matrix vervolgens toe op het list-mode bestand voor monster zes. Om te verifiëren dat de aanwezigheid van PKH 26-labeling het vermogen om zeven A a D-positieve cellen te detecteren niet beïnvloedt. Pas nu deze zojuist vastgestelde kleur-overlapmatrix toe op het list-mode bestand voor buis zeven.Identificeer de CD3-positieve CD4-negatieve en CD3-positieve CD4-positieve populaties op een FE versus PC-plot. Bevestig dat de aanwezigheid van anti-CD3 FE en anti-CD4 PC het vermogen om 7-AD-positieve cellen te detecteren niet beïnvloedt. Pas ten slotte de kleuroverlapmatrix voor buis zeven toe op het list-mode-bestand voor buis acht.Open nu een programma dat een module voor proliferatieanalyse bevat. Laad het gestimuleerde PKH 26-gekleurde bestand uit de dataset die geanalyseerd moet worden. Selecteer vervolgens de parameters voor de analyse; in dit geval PKH 26 gegated op levensvatbare seven a a d-negatieve cd, drie-positieve lymfocyten en forward scatter tegenover side scatter voor uitsluiting van klein debris en grote aggregaten.Wees bij het definiëren van deze regio's voorzichtig om het gebied met een hoge forward scatter op te nemen, waar blasts doorgaans worden aangetroffen. Open vervolgens de proliferatie-wizard. Klik op het starttabblad om het datafile te openen en laad daarna de ongestimuleerde PKH 26 positieve controle.Bepaal de locatie van de ouderpiek die overeenkomt met ongedelde cellen. Analyseer het bestand en noteer de waarden voor de positie en breedte van de ouderpiek. Indien een vaste piekbreedte gewenst is, vink dan 'lock SD' aan, laad de PKH 26-negatieve controle en pas het aantal generaties aan door het piekkanaal voor de dimere dochtergeneratie boven de PKH 26-negatieve cellen in te stellen.Hiermee wordt het aantal dochtergeneraties ingesteld. Het model kan nauwkeurig worden gefit wanneer dit is voltooid. Laad het bestand met de gestimuleerde PKH 26-positieve cellen opnieuw.Als er duidelijk onderscheidbare generationele pieken zichtbaar zijn, kies dan de instelling 'floating' onder de modeloptie. Als de log-decaden niet precies 4,0 zijn, pas dan de generationele spatiëring aan zoals besproken in het artikel. Analyseer nu het gestimuleerde monster en bevestig dat de regio voor de positie van de ouderlijke piek ongewijzigd blijft.Selecteer ten slotte voor elk experimenteel bestand in de dataset 'analyze' om het zojuist aangemaakte model toe te passen en leg de gewenste proliferatiestatistieken vast die voortvloeien uit de beste passing voor elk experimenteel bestand in de dataset. Deze eerste reeks gegevens illustreert het effect van de mengtechniek op de fluorescentieverdelingen van PKH 26.Wanneer U 9 37 myeloïde cellen werden gekweekt, werden deze gekleurd met de celvolgkleurstof volgens de zojuist beschreven methode; dit eerste histogram toont de gegevens van de ongekleurde controle. De instellingen van de cytometer werden zo aangepast dat de autofluorescentie van deze cellen in het eerste decennium viel, waarbij geen of zeer weinig cellen in het eerste kanaal accumuleerden. Dit tweede histogram illustreert een goede PKH 26 kleuring.Snel mengen van twee x cellen met twee x kleurstof resulteerde in een fluorescentieverdeling die helder, homogeen en symmetrisch was, maar zonder cellen buiten de schaal bij de instrumentinstellingen die voor het vorige histogram waren gebruikt. Wanneer twee x cellen werden toegevoegd aan twee x kleurstof zonder direct te mengen, werd een meer heterogene fluorescentieverdeling verkregen. Deze kleine subpopulatie van zwak gelabelde cellen zou onterecht als dochtercellen worden geïnterpreteerd als ze op een later tijdstip aanwezig zouden zijn in het uiteindelijke histogram van dit experiment; slecht mengen trad ook op toen drie microliters geconcentreerde ethanol-kleurstofvoorraad per ongeluk direct werd toegevoegd aan 0,5 milliliters van de twee x celsuspensie, wat leidde tot een extreem zwakke en naar rechts scheve fluorescentie-intensiteitsverdeling.Hier worden typische resultaten getoond van een proliferatie-experiment waarin met PKH 20 gekleurde mononucleaire cellen uit menselijk perifeer bloed werden gekweekt met of zonder stimulerende Anti-CD3 en IL-2 reagentia. Na 96 uur kweek werden de cellen geoogst en tegengekleurd met anti-CD3-FITC, anti-CD19-APC en 7-AAD.Twee verschillende gating-strategieën werden vergeleken. In de eerste gating-strategie werd een dotplot van CD3 versus 7-AAD gebruikt om levende 7-AAD-negatieve CD3-positieve T-cellen te selecteren. Vervolgens werd een forward- en side-scatter-regio gebruikt om grote aggregaten weg te filteren, terwijl blastende lymfocyten wel werden geïncludeerd.De R1+R2-gepoorte events voor de ongekleurde controle worden weergegeven door het grijze histogram en de PKH 26-gekleurde, maar ongestimuleerde cellen zijn blauw; let op de heldere, symmetrische en homogene kleuring voor levensvatbare maar ongedeelde T-cellen in de ongestimuleerde controle. Deze gegevens werden op dezelfde manier gepoort als in de vorige figuur, maar in dit geval werden de cellen gestimuleerd met anti-CD3 en IL-2. Het PKH 26-histogram voor de R1+R2-gepoorte events bevat nu voornamelijk gedeelde cellen met een verminderde intensiteit, weergegeven door gekleurde pieken voor elke dochtergeneratie.Hoewel er nog enkele heldere, ongedeelde cellen in de blauwe ouderpiek aanwezig zijn. Let op dat de intensiteit van de sterk gedeelde cellen nog niet overlapt met de regio waar ongekleurde cellen worden gemeten, wat de schatting van metrieken gebaseerd op het aantal cellen in de dochtergeneraties met de laagste intensiteit hier zou bemoeilijken. Dezelfde gegevens werden geanalyseerd als de vorige twee sets figuren, maar er werd alleen gebruikgemaakt van lichtverstrooiing en CD3 om levensvatige T-cellen te selecteren.Deze gating-strategie sluit veel, maar niet alle dode cellen uit, zoals blijkt uit de kleine resterende populatie 7-AAD-positieve dode cellen in de CD3 versus 7-AAD dot-plots. De keuze van fluorochromen voor immunofenotypering kan leiden tot uitdagende compensatieproblemen bij het gebruik van celtrackingskleurstoffen, aangezien de kleurintensiteit van ongedeelde cellen extreem hoog is. In dit experiment werden 24 uur oude perifere mononucleaire bloedcellen gelabeld met PKH26 en vervolgens tegengekleurd met antilichamen tegen CD3 en CD4, samen met een levensvatbaarheidskleurstof.In deze reeks gegevens werden de cellen die gelabeld waren met twee micromolair PKH 26 tegengekleurd met anti-CD3 FITC en anti-CD4 APC, en vervolgens geanalyseerd met dezelfde R1 + R2-gatingstrategie als voorheen. Omdat er weinig overlap van PKH 26 in het APC-kanaal is, werden CD4-positieve en -negatieve gebeurtenissen duidelijk onderscheiden, ongeacht of er compensatie was toegepast. Deze gegevens illustreren hoe de levensvatbare CD3-positieve CD4-positieve T-cellen goed gescheiden bleven, zelfs toen de uiteindelijke PKH 26-concentratie werd verhoogd tot vier micromolair. Het gebruik van anti-CD4 PerCP in combinatie met anti-CD3 FITC, twee micromolair PKH 26 en de levensvatbaarheids kleurstof Draq7 gaf veel slechtere resultaten vanwege een aanzienlijke overlap van PKH 26 in het PerCP-kanaal.CD four positieve en negatieve cellen konden in ongecompenseerde data niet van elkaar worden onderscheiden en waren slechts marginaal te scheiden wanneer compensatie werd toegepast. Het verhogen van de uiteindelijke PKH 26 concentratie naar vier micromolar leidde tot een volledig verlies van het vermogen om CD four positieve van CD four negatieve events te onderscheiden, zelfs nadat compensatie was toegepast. Let op dat de monsters met of zonder anti CD four per CP in essentie identiek waren.Wanneer een kleurstofverdunningsprofiel wordt geanalyseerd met piekmodelleringsoftware om de frequentie van cellen in opeenvolgende dochtergeneraties te schatten, kunnen de posities en/of breedtes van opeenvolgende dochterpieken vaststaan of variabel zijn ten opzichte van de waarden voor de ouderpiek. Deze waarden worden geschat op basis van de ongestimuleerde controle.Bijvoorbeeld, dit PKH 26-intensiteitsprofiel is afkomstig van een ongestimuleerde cultuur van 96 uur van een gemiddelde responder en werd gebruikt om de mod fit-proliferatiewizard te voorzien van de eerste schatting van de positie en breedte voor de piek die de ongedeelde oudercellen vertegenwoordigt. Het gebruik van een vaste instelling voor de piekpositie vereist dat het gemiddelde van elke generationele piek precies de helft is van de fluorescentie-intensiteit van de vorige piek. Een float-instelling voor de piekpositie maakt het mogelijk dat de uiteindelijke posities van de generationele pieken afwijken van de verwachte intensiteiten, indien nodig om de beste fit te verkrijgen.Op dezelfde manier vereist een vaste instelling voor de piekbreedte dat de breedte van elke generationele piek gelijk is aan die van de ouderlijke of ongestimuleerde controlepiek. Een variabele instelling voor de piekbreedte maakt het mogelijk dat de uiteindelijke breedtes onafhankelijk van elkaar worden aangepast om de beste passing in deze tabel te verkrijgen. De resultaten van de analyses uit de vorige figuren voor twee verschillende donoren worden voor deze donoren getoond waarbij duidelijk onderscheidbare generationele pieken zichtbaar waren.De beste gereduceerde chi-kwadraatwaarden werden verkregen wanneer zowel de piekpositie als de breedte vrij konden variëren; voor proliferatieprofielen waarin onderscheidbare generatiepieken niet duidelijk zichtbaar zijn, wordt een vaste instelling voor de piekpositie aanbevolen. Deze gegevens illustreren het gebruik van twee tracking-kleurstoffen om de proliferatiegeschiedenis van verschillende typen immuuncellen afzonderlijk te monitoren in een flowcytometrische immuunsuppressie-assay. T-effectorcellen, weergegeven in het groen, werden gelabeld met CFSE en T-regulatoire cellen, weergegeven in het blauw, werden gelabeld met cell view.Claret-gelabelde celpopulaties werden in variërende verhoudingen gemengd en gedurende 96 uur gekweekt in aanwezigheid van anti-CD3, anti-CD28 en bestraalde accessoire cellen. Daarna werden de cellen geoogst en gekleurd met anti-CD4, PE-Cy7 en live/dead violet. Hier worden representatieve gegevens getoond voor een Treg-te T-effector-verhouding van 0,25 op 1, nadat live/dead violet-positieve cellen waren weggefilterd.Er werd een light scatter gate toegepast die lymfocyten en blasten omvatte, maar aggregaten en debris uitsloot, gevolgd door een gate om CD4-positieve events te selecteren. Kleuring met CellView Claret maakte het mogelijk om levensvatbare Treg-cellen gemakkelijk te onderscheiden van levensvatbare T-effectorcellen die sterk waren geprolifereerd; daarom werden de CFSE-DIM proliferatieprofielen voor CFSE-positieve T-effectorcellen en CellView Claret-positieve Treg-cellen geanalyseerd met ModFit Peak modeling software. Er werden ongeveer 25.000 events geanalyseerd.Van deze cellen waren 48% levensvatbare T-effectorcellen en 6% levensvatbare T-regs, terwijl de rest bestond uit dode cellen, accessoire cellen en debris. De berekende proliferatie-index, die de factor van de toename in het aantal cellen tijdens de assayperiode weerspiegelt, was 3,85 voor T-effectorcellen en 1,83 voor Tregs. Hier wordt het effect van de Treg-celconcentratie op de proliferatie-index van T-effectorcellen getoond, berekend op basis van het CFSE-kleurverdunningsprofiel.De resultaten waren gelijk, ongeacht of de treg-cellen waren gelabeld met cell view claret of ongekleurd bleven, wat aantoont dat de treg-functie niet door kleuring was beïnvloed. Bij tracking nam, zoals verwacht, de mate van tector-proliferatie toe naarmate de concentratie van treg-cellen afnam. Proliferatie-indexen van treg-cellen werden eveneens berekend op basis van cell view claret-kleurstofverdunningsprofielen bij verschillende treg- naar T-effectorratio's.Zoals verwacht vertoonden de Tregs een minimale proliferatie bij afwezigheid van T-effectorcellen naarmate de concentratie T-effectorcellen toenam. De mate van treg-celproliferatie nam echter ook toe. Na het bekijken van de video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u celtracking-kleurstoffen succesvol kunt gebruiken om celproliferatie te monitoren, hoe u geschikte fluorochromen en kleurcompensatiecontroles kiest en hoe u een geschikt model selecteert voor het kwantificeren van celdeling op basis van kleurstofverdunning.Naast deze procedure kunnen andere methoden worden uitgevoerd om experimentele vragen te beantwoorden, zoals het kleuren van antigeenspecifieke T-cellen of flow-sortering voor het terugwinnen van stamcelachtige cellen die quiescent zijn of langzaam delen. Hartelijk dank voor het kijken.

optimized-staining-proliferation-modeling-methods-for-cell-division

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

FRET-gebaseerde reporters steeds vaker gebruikt voor het kinase en fosfatase activiteiten in levende cellen te volgen. Hier beschrijven we een methode voor het FRET-gebaseerde verslaggevers gebruiken om celcyclus-afhankelijke veranderingen te beoordelen in doel fosforylering.

Monitoring Kinase en fosfatase activiteiten door middel van de celcyclus door Ratiometrische FRET

Het bepalen van de celcyclus positie van een populatie van cellen, of begrijpen hoe signalen proliferatie van invloed zijn, gemakkelijk kan worden gemeten door middel van flowcytometrie gebruik van dit protocol. We brengen verslag uit een eenvoudige experimentele benadering voor vlekken cellen en kwantificeren van hun positie in de cel cyclus.

Analyse van celcyclus Positie in zoogdiercellen

Dit protocol beschrijft het gebruik van broomdeoxyuridine (BrdU) om de tijdelijke opname volgen van cellen die op een bepaald tijdstip waren in de S-fase mogelijk. Toevoeging van DNA kleurstoffen en antilichamen etikettering bevordert gedetailleerde analyse van het lot van de S-fase cellen op latere tijdstippen.

Temporal Tracking van celcyclusprogressie behulp van flowcytometrie zonder de noodzaak voor synchronisatie

Macrofagen zijn plastic cellen van het hematopoietische systeem die een cruciale rol spelen in beschermende immuniteit en homeostase. In dit rapport beschrijven we geoptimaliseerde in vitro technieken voor het fenotypisch en functioneel karakteriseren van transplantatie-infiltrerende regulerende macrofagen die zich in het getransplanteerde orgaan verzamelen onder tolerogene omstandigheden.

Functionele karakterisering van regulerende macrofagen die de transplantaatreactieve immuniteit verhinderen

Dit protocol beschrijft het gebruik van drie verschillende methoden voor het analyseren van celproliferatie in borstkankercellijnen. Dit omvat het gebruik van conventionele celtelling, op luminescentie gebaseerde celviabiliteit en celtelling door het gebruik van een celimager. Elk biedt voordelen voor de reproduceerbare meting van celproliferatie.

Vergelijking van de drie verschillende methoden voor het bepalen van de cel proliferatie in borstkanker cellijnen

Dit protocol beschrijft hoe de huid keratinocyten van Muismodellen te isoleren, te vlekken met metaal-gelabelde antilichamen, en om bevlekte cellen te analyseren door massa cytometrie om het patroon van de expressie van eiwitten van belang in de verschillende celcyclus fasen profiel.

Isolatie en kleuring van de muis huid keratinocyten voor celcyclus specifieke analyse van cellulaire eiwit expressie door massa Cytometrie

Proliferatie is een essentieel onderdeel van cellulaire functie, en een gemeenschappelijke uitlezen gebruikt om te beoordelen van de potentiële toxiciteit van nieuwe geneesmiddelen. Het meten van de proliferatie is daarom een vaak gebruikte assay in celbiologie. Hier presenteren we een eenvoudige, veelzijdige methode voor het meten van de proliferatie die kan worden gebruikt in aanhandige en niet-aanhantende cellen.

Het meten van de proliferatie van vasculaire gladde spiercellen met behulp van klik chemie

Celsplitsingen kunnen in real-time worden gevisualiseerd met behulp van fluorescently gelabelde eiwitten en timelapse-microscopie. Met behulp van het protocol hier gepresenteerd, gebruikers kunnen analyseren celdeling timing dynamiek, mitotische spindel assemblage, en chromosoom congressen en segregatie. Defecten in deze gevallen na RNA-interferentie (RNAi)-gemedieerde Gene knockdown kunnen worden beoordeeld en bepaald.

Gebruik van Drosophila S2-cellen voor Live beeldvorming van celdeling

Tumororganoïden van patiënten zijn een geavanceerd modelsysteem voor fundamenteel en translationeel onderzoek. Dit methodeartikel beschrijft het gebruik van gemultiplexte fluorescerende beeldvorming van levende cellen voor gelijktijdige kinetische beoordeling van verschillende organoïde fenotypes.

Meervoudige beeldvorming met levende cellen voor geneesmiddelresponsen in van patiënten afgeleide organoïdemodellen van kanker

Een eenvoudige en specifieke methode werd aangetoond voor tl-etikettering en de verbeterde detectie van cel-oppervlakte-eiwitten zonder fractionering stap. Differentiële overvloed in cel oppervlakte-eiwitten werd geanalyseerd met behulp van twee-dimensionale (2-D) elektroforese en Ettan ™ DIGE technologie.

Selectieve Etikettering van Cell-oppervlakte-eiwitten met behulp van CyDye DIGE Fluor Minimal Kleurstoffen

Leer hoe je celdeling kwantificeert met fluorescerende celtrackingkleurstoffen en flowcytometrie. Deze methode maakt directe meting van proliferatie in immuuncelpopulaties mogelijk.

Geoptimaliseerd kleuring en proliferatie Modeling Methoden voor de celdeling Monitoring met behulp van Cell Tracking Kleurstoffen (Video) | JoVE Journal

Geoptimaliseerd kleuring en proliferatie Modeling Methoden voor de celdeling Monitoring met behulp van Cell Tracking Kleurstoffen

Meer video's verkennen