Geoptimaliseerd kleuring en proliferatie Modeling Methoden voor de celdeling Monitoring met behulp van Cell Tracking Kleurstoffen

Het algemene doel van deze methode is om cell-trackingkleurstoffen te gebruiken om de mate van celdeling voor verschillende immuuncel-subsets binnen complexe populaties direct te kwantificeren. Dit wordt bereikt door eerst de oudercelpopulatie te labelen met een fluorescente kleurstof die bekend staat om een stabiele binding met cellulaire eiwitten of die niet-covalent intercaleert in cellulaire membranen; door het volgen van kleurstofgelabelde cellen die reageren op stimulatie, kleuring met fluorescente antilichamen en analyse via multi-parameter flowcytometrie, kunnen differentiële responsen tussen de gestimuleerde immuunceltypen van belang worden gedetecteerd. Controlemonsters zonder trackingkleurstof worden gebruikt om de laagste fluorescentie-intensiteit van dochtercellen vast te stellen die van autofluorescentie kan worden onderscheiden, terwijl gelabelde maar ongestimuleerde controles vervolgens worden gebruikt om de fluorescentie-intensiteit vast te stellen waarbij niet-gedeelde cellen worden gedetecteerd. Stimulatie resulteert doorgaans in een breed scala aan intensiteiten, aangezien cellen die prolifereren als reactie daarop progressief minder fel worden, terwijl niet-responders dat niet zijn.

Uiteindelijk kan het gebruik van software voor piekmodellering om de relatieve frequentie van cellen in verschillende generaties te schatten, een kwantitatieve vergelijking mogelijk maken van de proliferatieve responsen over verschillende populaties of stimuli heen, met behulp van metrieken zoals de proliferatie-index of de precursorfrequentie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals tritiatied incorporates of KI 67-expressie, is dat de DI-verdunning een directe maat voor celdeling biedt die kan worden gecombineerd met andere flowcytometrische metingen, zoals immunofenotypering en cytokinproductie. Een visuele demonstratie van de methode voor membraankleuring is nuttig, aangezien de opname van kleurstof door cellen extreem snel verloopt.

Bijgevolg is een goede techniek essentieel voor het verkrijgen van een heldere, homogene kleuring. Nadat mononucleaire cellen uit menselijk perifeer bloed zijn geïsoleerd, wordt er vijf minuten gecentrifugeerd bij 300 ×g en kamertemperatuur om plaatjescontaminatie te minimaliseren. Resuspendeer vervolgens het pellet op een concentratie van 10⁷ cellen per milliliter in HBSS plus 1% BSA en plaats deze op ijs.

Verwijder en reserveer een aliquot van 500 µL, en breng vervolgens een andere aliquot van 500 µL cellen over in een conische polypropyleen buis van 12 bij 75 mm. Voeg 3,5 mL HBSS toe en centrifugeer de cellen gedurende vijf minuten bij 400 ×g en kamertemperatuur; voeg tijdens het wassen 0,5 mL Diluent C labeling vehicle uit de PKH 26 GL kit toe aan een andere conische polypropyleen buis van 12 bij 75 mm. Aspireer voorzichtig het supernatant, waarbij niet meer dan 15 tot 25 µL aan residu-vloeistof overblijft en zorgvuldig wordt voorkomen dat er cellen worden verwijderd. Voeg vervolgens 0,5 mL Diluent C labeling vehicle toe aan de celpellet en aspireer en dispenseer de oplossing meerdere keren om een enkelcellige suspensie te verkrijgen.

Bereid nu de 2X XD-voorraadoplossing door 2 µL PKH 26 toe te voegen aan de buis met verdunningsvloeistof C. Pipetteer direct daarna de celsuspensie in de vers bereide 2X PKH 26-kleurstofoplossing en aspireer en dispenseer het mengsel gelijktijdig meerdere keren om de cellen gelijkmatig door de kleurstof te verspreiden. Voeg na één minuut 1 mL hitte-geïnactiveerd serum toe om de opname van de kleurstof in de celmembranen te stoppen. Aspireer na het centrifugeren van de cellen voorzichtig het supernatant zonder de pellet te verwijderen.

Resuspendeer de pellet vervolgens in vier milliliter compleet medium met 10% hitte-inactiverd serum en breng de celsuspensie over naar een nieuwe polypropyleenbuis. Was de cellen tweemaal in HBSS plus 1% BSA; adequaat gekleurde cellen zullen een duidelijk roze tint in de pellet vertonen. Nadat de celpellet is geresuspendeerd in één milliliter HBSS plus 1% BSA, worden de cellen geteld en wordt het volume vervolgens aangepast om een uiteindelijke concentratie van 10⁷ cellen per milliliter te verkrijgen. Nadat de cellen zijn gekleurd volgens het flowcytometrische protocol in de tabel, worden de eerste vijf buizen gebruikt om de parameters voor forward scatter en side scatter en de signalen in alle vier de fluorescentiedetectoren in te stellen.

In het bijzonder voor de detector die wordt gebruikt om de PKH 26-fluorescentie in buis twee te monitoren. Verifieer dat alle met PKH 26 gekleurde cellen op de schaal verschijnen als één symmetrische piek in het derde tot vierde decennium, met weinig tot geen cellen in het laatste kanaal. Gebruik vervolgens de software voor kleurcompensatie en de in lijstmodus verzamelde bestanden voor buis één tot vijf om een kleuroverlapmatrix op te stellen voor elke fluorochroom in de detectoren die worden gebruikt om de drie andere fluorochromen te monitoren.

Pas deze matrix vervolgens toe op het list-mode bestand voor monster zes. Om te verifiëren dat de aanwezigheid van PKH 26-labeling het vermogen om zeven A a D-positieve cellen te detecteren niet beïnvloedt. Pas nu deze zojuist vastgestelde kleur-overlapmatrix toe op het list-mode bestand voor buis zeven.

Identificeer de CD3-positieve CD4-negatieve en CD3-positieve CD4-positieve populaties op een FE versus PC-plot. Bevestig dat de aanwezigheid van anti-CD3 FE en anti-CD4 PC het vermogen om 7-AD-positieve cellen te detecteren niet beïnvloedt. Pas ten slotte de kleuroverlapmatrix voor buis zeven toe op het list-mode-bestand voor buis acht.

Open nu een programma dat een module voor proliferatieanalyse bevat. Laad het gestimuleerde PKH 26-gekleurde bestand uit de dataset die geanalyseerd moet worden. Selecteer vervolgens de parameters voor de analyse; in dit geval PKH 26 gegated op levensvatbare seven a a d-negatieve cd, drie-positieve lymfocyten en forward scatter tegenover side scatter voor uitsluiting van klein debris en grote aggregaten.

Wees bij het definiëren van deze regio's voorzichtig om het gebied met een hoge forward scatter op te nemen, waar blasts doorgaans worden aangetroffen. Open vervolgens de proliferatie-wizard. Klik op het starttabblad om het datafile te openen en laad daarna de ongestimuleerde PKH 26 positieve controle.

Bepaal de locatie van de ouderpiek die overeenkomt met ongedelde cellen. Analyseer het bestand en noteer de waarden voor de positie en breedte van de ouderpiek. Indien een vaste piekbreedte gewenst is, vink dan 'lock SD' aan, laad de PKH 26-negatieve controle en pas het aantal generaties aan door het piekkanaal voor de dimere dochtergeneratie boven de PKH 26-negatieve cellen in te stellen.

Hiermee wordt het aantal dochtergeneraties ingesteld. Het model kan nauwkeurig worden gefit wanneer dit is voltooid. Laad het bestand met de gestimuleerde PKH 26-positieve cellen opnieuw.

Als er duidelijk onderscheidbare generationele pieken zichtbaar zijn, kies dan de instelling 'floating' onder de modeloptie. Als de log-decaden niet precies 4,0 zijn, pas dan de generationele spatiëring aan zoals besproken in het artikel. Analyseer nu het gestimuleerde monster en bevestig dat de regio voor de positie van de ouderlijke piek ongewijzigd blijft.

Selecteer ten slotte voor elk experimenteel bestand in de dataset 'analyze' om het zojuist aangemaakte model toe te passen en leg de gewenste proliferatiestatistieken vast die voortvloeien uit de beste passing voor elk experimenteel bestand in de dataset. Deze eerste reeks gegevens illustreert het effect van de mengtechniek op de fluorescentieverdelingen van PKH 26.

Wanneer U 9 37 myeloïde cellen werden gekweekt, werden deze gekleurd met de celvolgkleurstof volgens de zojuist beschreven methode; dit eerste histogram toont de gegevens van de ongekleurde controle. De instellingen van de cytometer werden zo aangepast dat de autofluorescentie van deze cellen in het eerste decennium viel, waarbij geen of zeer weinig cellen in het eerste kanaal accumuleerden. Dit tweede histogram illustreert een goede PKH 26 kleuring.

Snel mengen van twee x cellen met twee x kleurstof resulteerde in een fluorescentieverdeling die helder, homogeen en symmetrisch was, maar zonder cellen buiten de schaal bij de instrumentinstellingen die voor het vorige histogram waren gebruikt. Wanneer twee x cellen werden toegevoegd aan twee x kleurstof zonder direct te mengen, werd een meer heterogene fluorescentieverdeling verkregen. Deze kleine subpopulatie van zwak gelabelde cellen zou onterecht als dochtercellen worden geïnterpreteerd als ze op een later tijdstip aanwezig zouden zijn in het uiteindelijke histogram van dit experiment; slecht mengen trad ook op toen drie microliters geconcentreerde ethanol-kleurstofvoorraad per ongeluk direct werd toegevoegd aan 0,5 milliliters van de twee x celsuspensie, wat leidde tot een extreem zwakke en naar rechts scheve fluorescentie-intensiteitsverdeling.

Hier worden typische resultaten getoond van een proliferatie-experiment waarin met PKH 20 gekleurde mononucleaire cellen uit menselijk perifeer bloed werden gekweekt met of zonder stimulerende Anti-CD3 en IL-2 reagentia. Na 96 uur kweek werden de cellen geoogst en tegengekleurd met anti-CD3-FITC, anti-CD19-APC en 7-AAD.

Twee verschillende gating-strategieën werden vergeleken. In de eerste gating-strategie werd een dotplot van CD3 versus 7-AAD gebruikt om levende 7-AAD-negatieve CD3-positieve T-cellen te selecteren. Vervolgens werd een forward- en side-scatter-regio gebruikt om grote aggregaten weg te filteren, terwijl blastende lymfocyten wel werden geïncludeerd.

De R1+R2-gepoorte events voor de ongekleurde controle worden weergegeven door het grijze histogram en de PKH 26-gekleurde, maar ongestimuleerde cellen zijn blauw; let op de heldere, symmetrische en homogene kleuring voor levensvatbare maar ongedeelde T-cellen in de ongestimuleerde controle. Deze gegevens werden op dezelfde manier gepoort als in de vorige figuur, maar in dit geval werden de cellen gestimuleerd met anti-CD3 en IL-2. Het PKH 26-histogram voor de R1+R2-gepoorte events bevat nu voornamelijk gedeelde cellen met een verminderde intensiteit, weergegeven door gekleurde pieken voor elke dochtergeneratie.

Hoewel er nog enkele heldere, ongedeelde cellen in de blauwe ouderpiek aanwezig zijn. Let op dat de intensiteit van de sterk gedeelde cellen nog niet overlapt met de regio waar ongekleurde cellen worden gemeten, wat de schatting van metrieken gebaseerd op het aantal cellen in de dochtergeneraties met de laagste intensiteit hier zou bemoeilijken. Dezelfde gegevens werden geanalyseerd als de vorige twee sets figuren, maar er werd alleen gebruikgemaakt van lichtverstrooiing en CD3 om levensvatige T-cellen te selecteren.

Deze gating-strategie sluit veel, maar niet alle dode cellen uit, zoals blijkt uit de kleine resterende populatie 7-AAD-positieve dode cellen in de CD3 versus 7-AAD dot-plots. De keuze van fluorochromen voor immunofenotypering kan leiden tot uitdagende compensatieproblemen bij het gebruik van celtrackingskleurstoffen, aangezien de kleurintensiteit van ongedeelde cellen extreem hoog is. In dit experiment werden 24 uur oude perifere mononucleaire bloedcellen gelabeld met PKH26 en vervolgens tegengekleurd met antilichamen tegen CD3 en CD4, samen met een levensvatbaarheidskleurstof.

In deze reeks gegevens werden de cellen die gelabeld waren met twee micromolair PKH 26 tegengekleurd met anti-CD3 FITC en anti-CD4 APC, en vervolgens geanalyseerd met dezelfde R1 + R2-gatingstrategie als voorheen. Omdat er weinig overlap van PKH 26 in het APC-kanaal is, werden CD4-positieve en -negatieve gebeurtenissen duidelijk onderscheiden, ongeacht of er compensatie was toegepast. Deze gegevens illustreren hoe de levensvatbare CD3-positieve CD4-positieve T-cellen goed gescheiden bleven, zelfs toen de uiteindelijke PKH 26-concentratie werd verhoogd tot vier micromolair. Het gebruik van anti-CD4 PerCP in combinatie met anti-CD3 FITC, twee micromolair PKH 26 en de levensvatbaarheids kleurstof Draq7 gaf veel slechtere resultaten vanwege een aanzienlijke overlap van PKH 26 in het PerCP-kanaal.

CD four positieve en negatieve cellen konden in ongecompenseerde data niet van elkaar worden onderscheiden en waren slechts marginaal te scheiden wanneer compensatie werd toegepast. Het verhogen van de uiteindelijke PKH 26 concentratie naar vier micromolar leidde tot een volledig verlies van het vermogen om CD four positieve van CD four negatieve events te onderscheiden, zelfs nadat compensatie was toegepast. Let op dat de monsters met of zonder anti CD four per CP in essentie identiek waren.

Wanneer een kleurstofverdunningsprofiel wordt geanalyseerd met piekmodelleringsoftware om de frequentie van cellen in opeenvolgende dochtergeneraties te schatten, kunnen de posities en/of breedtes van opeenvolgende dochterpieken vaststaan of variabel zijn ten opzichte van de waarden voor de ouderpiek. Deze waarden worden geschat op basis van de ongestimuleerde controle.

Bijvoorbeeld, dit PKH 26-intensiteitsprofiel is afkomstig van een ongestimuleerde cultuur van 96 uur van een gemiddelde responder en werd gebruikt om de mod fit-proliferatiewizard te voorzien van de eerste schatting van de positie en breedte voor de piek die de ongedeelde oudercellen vertegenwoordigt. Het gebruik van een vaste instelling voor de piekpositie vereist dat het gemiddelde van elke generationele piek precies de helft is van de fluorescentie-intensiteit van de vorige piek. Een float-instelling voor de piekpositie maakt het mogelijk dat de uiteindelijke posities van de generationele pieken afwijken van de verwachte intensiteiten, indien nodig om de beste fit te verkrijgen.

Op dezelfde manier vereist een vaste instelling voor de piekbreedte dat de breedte van elke generationele piek gelijk is aan die van de ouderlijke of ongestimuleerde controlepiek. Een variabele instelling voor de piekbreedte maakt het mogelijk dat de uiteindelijke breedtes onafhankelijk van elkaar worden aangepast om de beste passing in deze tabel te verkrijgen. De resultaten van de analyses uit de vorige figuren voor twee verschillende donoren worden voor deze donoren getoond waarbij duidelijk onderscheidbare generationele pieken zichtbaar waren.

De beste gereduceerde chi-kwadraatwaarden werden verkregen wanneer zowel de piekpositie als de breedte vrij konden variëren; voor proliferatieprofielen waarin onderscheidbare generatiepieken niet duidelijk zichtbaar zijn, wordt een vaste instelling voor de piekpositie aanbevolen. Deze gegevens illustreren het gebruik van twee tracking-kleurstoffen om de proliferatiegeschiedenis van verschillende typen immuuncellen afzonderlijk te monitoren in een flowcytometrische immuunsuppressie-assay. T-effectorcellen, weergegeven in het groen, werden gelabeld met CFSE en T-regulatoire cellen, weergegeven in het blauw, werden gelabeld met cell view.

Claret-gelabelde celpopulaties werden in variërende verhoudingen gemengd en gedurende 96 uur gekweekt in aanwezigheid van anti-CD3, anti-CD28 en bestraalde accessoire cellen. Daarna werden de cellen geoogst en gekleurd met anti-CD4, PE-Cy7 en live/dead violet. Hier worden representatieve gegevens getoond voor een Treg-te T-effector-verhouding van 0,25 op 1, nadat live/dead violet-positieve cellen waren weggefilterd.

Er werd een light scatter gate toegepast die lymfocyten en blasten omvatte, maar aggregaten en debris uitsloot, gevolgd door een gate om CD4-positieve events te selecteren. Kleuring met CellView Claret maakte het mogelijk om levensvatbare Treg-cellen gemakkelijk te onderscheiden van levensvatbare T-effectorcellen die sterk waren geprolifereerd; daarom werden de CFSE-DIM proliferatieprofielen voor CFSE-positieve T-effectorcellen en CellView Claret-positieve Treg-cellen geanalyseerd met ModFit Peak modeling software. Er werden ongeveer 25.000 events geanalyseerd.

Van deze cellen waren 48% levensvatbare T-effectorcellen en 6% levensvatbare T-regs, terwijl de rest bestond uit dode cellen, accessoire cellen en debris. De berekende proliferatie-index, die de factor van de toename in het aantal cellen tijdens de assayperiode weerspiegelt, was 3,85 voor T-effectorcellen en 1,83 voor Tregs. Hier wordt het effect van de Treg-celconcentratie op de proliferatie-index van T-effectorcellen getoond, berekend op basis van het CFSE-kleurverdunningsprofiel.

De resultaten waren gelijk, ongeacht of de treg-cellen waren gelabeld met cell view claret of ongekleurd bleven, wat aantoont dat de treg-functie niet door kleuring was beïnvloed. Bij tracking nam, zoals verwacht, de mate van tector-proliferatie toe naarmate de concentratie van treg-cellen afnam. Proliferatie-indexen van treg-cellen werden eveneens berekend op basis van cell view claret-kleurstofverdunningsprofielen bij verschillende treg- naar T-effectorratio's.

Zoals verwacht vertoonden de Tregs een minimale proliferatie bij afwezigheid van T-effectorcellen naarmate de concentratie T-effectorcellen toenam. De mate van treg-celproliferatie nam echter ook toe. Na het bekijken van de video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u celtracking-kleurstoffen succesvol kunt gebruiken om celproliferatie te monitoren, hoe u geschikte fluorochromen en kleurcompensatiecontroles kiest en hoe u een geschikt model selecteert voor het kwantificeren van celdeling op basis van kleurstofverdunning.

Naast deze procedure kunnen andere methoden worden uitgevoerd om experimentele vragen te beantwoorden, zoals het kleuren van antigeenspecifieke T-cellen of flow-sortering voor het terugwinnen van stamcelachtige cellen die quiescent zijn of langzaam delen. Hartelijk dank voor het kijken.