Microfluïdische-based Electrotaxis voor On-demand Kwantitatieve analyse van Caenorhabditis elegans 'Locomotion
May 2nd, 2013
Een semi-automatische micro-electro-fluidisch methode om on-demand motoriek induceren in Caenorhabditis elegans Is beschreven. Deze methode is gebaseerd op het verschijnsel van neurofysiologische wormen reageren op milde elektrische velden ("electrotaxis") in microkanalen. Microfluïdische electrotaxis dient als een snelle, gevoelige, low-cost, en schaalbare techniek voor het screenen op factoren die van invloed neuronale gezondheid.
Het algemene doel van deze procedure is om afwijkingen in neuronale en neuromusculaire signalering in het modelorganisme van C Allergan te identificeren na chemische blootstelling of genetische manipulatie. Dit wordt bereikt door eerst een microkanaalpatroon te ontwerpen en te etsen in een siliconen wafer. Tijdens de tweede stap wordt de siliconen mal gebruikt om een of meer microkanalen uit PDMS te gieten.
Vervolgens worden accessoire componenten aan de PDMS mal bevestigd. Vervolgens wordt het gedrag van de wormen opgenomen terwijl ze worden gestimuleerd om door het microkanaal te zwemmen, met behulp van een op een microscoop gemonteerde camera. Uiteindelijk wordt elektromicrofluidica gebruikt om de veranderingen in de nematoden, neuronale en spijsverteringssystemen te bepalen als gevolg van chemische of genetische manipulatie met locomotieve als uitlezing.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven de bestaande technieken, vooral de op platen gebaseerde gedragstests, is dat met deze techniek de richting van de voortbeweging van de worm strak kan worden gecontroleerd, waardoor een nauwkeurige kwantificering van het locomotief gedrag mogelijk is, zoals de frequentie van lichaamsbuiging, rotatietijd en zwemsnelheid. De implicaties van deze techniek strekken zich uit naar de therapie van neurodegeneratieve aandoeningen zoals Parkinson en Alzheimer omdat het kan worden gebruikt om te screenen op chemische en genetische factoren met neurobeschermende eigenschappen. We hadden voor het eerst het idee voor deze techniek toen we ons realiseerden dat er een gebrek is aan methode voor het analyseren van het bewegingsgedrag van de methode op een kwantitatieve manier.
Beweging is vrijwillig en willekeurig, en het is moeilijk om te karakteriseren. Dus we wilden een eenvoudige methode vaststellen die iedereen kan leren. Om de master mal te maken, begint u door een drie inch siliconen wafer gedurende 30 seconden in aceton en vervolgens in methanol te baden. Spoel de wafer vervolgens gedurende vijf minuten met gedeïoniseerd water.
Gebruik vervolgens een stikstofblaaspijp om het oppervlak van de wafer te drogen en verwarm de wafer vervolgens op een hotplate op 120 graden Celsius gedurende twee minuten, oxideer het oppervlak van de siliconen wafer gedurende één minuut met plasma op 50 watt. Gebruik nu drie milliliter SU acht 100 fotoweerstand om het oppervlak van de wafer met 1.750 RPM gedurende 40 seconden te coaten en bak vervolgens de gecoate wafer op een hotplate op 65 graden Celsius. Verhoog na 10 minuten de temperatuur gedurende twee minuten tot 95 graden Celsius en bak de wafer gedurende nog een uur.
Nadat de wafer uit de hotplate is verwijderd, plaatst u een fotomasker met het gewenste ontwerp bovenop de wafer. Blootstel de fotoweerstand gedurende 95 seconden aan UV-licht. Bak vervolgens de wafer op een hotplate met dezelfde temperatuurgradiënt als gebruikt voor het voorbakken na het nabakken.
Dompel de wafer in SU acht. Ontwikkel een oplossing gedurende 10 tot 15 minuten. Spoel de wafer met isopropanol om de voltooiing van de ontwerpontwikkeling te bevestigen.
Spoel vervolgens met gedeïoniseerd water gedurende 30 seconden. Droog tenslotte de wafer met een stikstofpistool en bak kort op 120 graden Celsius. Plaats nu de vervaardigde master mal evenals een lege siliconen wafer in twee afzonderlijke petrischalen bekleed met aluminiumfolie.
Pour 20 milliliter PDMS pre polymeer in de master mal en schaal, en 15 milliliter in de lege wafer schaal. Druk vervolgens voorzichtig op de wafers met een wegwerp houten applicator om luchtzakken onder de wafers te elimineren en dek beide schalen af en laat ze een dag staan om uit te harden. Nadat de wafers zijn uitgehard, verwijdert u de folie en scheurt u de PDMS weg.
Gebruik vervolgens een 2,5 millimeter Harris eenhoorn om vloeistoftotaalpoorten te ponsen aan beide uiteinden van het kanaal in de PDMS van de master mal. Snijd beide PDMS schijven in strips van vergelijkbare grootte. Laad vervolgens in een cleanroom het kanaal, de lege PDMS strip en een glazen dia in een plasma oxidator.
Stel de materialen bloot aan zuurstofplasma bij 40 watt vermogen gedurende 40 seconden. Plak vervolgens het kanaalstuk en de glazen dia aan tegenoverliggende zijden van de lege strip en laat de materialen achter om de binding te voltooien. Gebruik na twee uur PDMS pre polymeer om ten minste zes inch lange stukken plastic buisje aan de geponste reservoirs op een hotplate op 120 graden Celsius te bevestigen.
Laat de PDMS uitharden voordat u verdergaat. Bevestig vervolgens een vloeibare kunststof connector aan een van de buizen om spuitbevestigingen mogelijk te maken. Plaats nu drie inch lengte van 22 gauge geïsoleerde koperdraad in elk reservoir tussen de inlaatbuis en het kanaal en zet de draden vast met meer PDMS pre polymeer.
Begin deze stap door de net geassembleerde microkanaal op een XY beweegbaar podium van een microscoop met een gemonteerde camera die op een monitor is aangesloten te plaatsen, sluit de voeding aan op de microkanaalelektroden. Nadat u hebt bevestigd dat de weerstand van het microkanaal ongeveer 0,6 mega ohm is, bevestigt u de uitlaatbuis van het microkanaal aan een wegwerpspuit. Dompel vervolgens de mond van de inlaatbuis onder in een oplossing van nematoden opgehangen in M negen fysiologische buffer.
Breng negatieve druk aan in de spuit om vloeistof in het kanaal te aspireren. Wanneer zowel de inlaat- als uitlaatbuizen gevuld zijn, ontkoppelt u de spuit en het hydrostatische systeem. Regel de stroom door de relatieve hoogte van de buizen aan te passen om een worm in het midden van het kanaal te plaatsen.
Leg vervolgens beide buizen plat op dezelfde hoogte om nul stroom in het microkanaal te handhaven. Bij het wisselen van wormenmonsters tijdens een elektrotaxi-experiment, na het nivelleren van beide inlaatbuizen tot dezelfde hoogte, als er nog steeds stroom is, maakt u kleine aanpassingen aan de hoogte van de buizen ten opzichte van elkaar. Als we ooit onzeker zijn of de stroom echt nul is, kunnen we een omkering in de beweging van de worm induceren door de polariteit van het elektrische veld te veranderen en vervolgens de lineaire snelheid van de worm te evalu
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel beschrijft een semi-automatische micro-elektro-vloeistofmethode om op verzoek voortbeweging bij Caenorhabditis elegans te induceren. De techniek maakt gebruik van het fenomeen elektrotaxis, waardoor snelle screening van factoren die de neuronale gezondheid beïnvloeden mogelijk is.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Microfluidica
- Gedragsanalyse
Achtergrond
- Caenorhabditis elegans is een modelorganisme voor het bestuderen van neuronale en neuromusculaire signalering.
- Elektrotaxis is een neurofysiologisch antwoord op elektrische velden.
- Microfluïdische kanalen maken gecontroleerde experimenten op kleine organismen mogelijk.
- Het begrijpen van voortbeweging kan inzichten geven in de neuronale gezondheid.
Doel van het onderzoek
- Om afwijkingen in neuronale en neuromusculaire signalering te identificeren.
- Om de effecten van chemische blootstelling of genetische manipulatie te beoordelen.
- Om voortbeweging te gebruiken als een uitlezing voor neuronale en spierveranderingen.
Gebruikte methoden
- Ontwerpen en etch microkanaalpatronen in siliciumwafels.
- Microkanalen gieten van PDMS met behulp van siliconenmalen.
- Accessoire componenten bevestigen aan de PDMS-mal.
- Gedrag van wormen opnemen met behulp van een microscoopgemonteerde camera.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle inductie van voortbeweging bij C. elegans met behulp van elektrotaxis.
- Identificatie van veranderingen in neuronale en musculaire systemen.
- Demonstratie van microfluïdische elektrotaxis als een schaalbare screeningsmethode.
- Inzichten in de effecten van genetische en chemische manipulaties.
Conclusies
- Microfluïdische elektrotaxis is een waardevol hulpmiddel voor neurowetenschappelijk onderzoek.
- Deze methode biedt een goedkope en gevoelige benadering voor het bestuderen van neuronale gezondheid.
- Verdere toepassingen kunnen de begrip van neuromusculaire stoornissen verbeteren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Quantitative locomotion analysis in C. elegans enables high-throughput screening for neuroprotective compounds and genetic modifiers in neurodegenerative disease models. By converting neuronal signaling defects into measurable electrotactic responses, this method supports early target validation and mechanistic de-risking in discovery pipelines. The microfluidic format provides scalable, reproducible phenotypic readouts that improve predictive confidence in lead identification campaigns.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by linking dopaminergic neuron function to quantifiable locomotion phenotypes.
- Operational Value: Enables rapid assessment of genetic and chemical manipulations affecting neuronal signaling with on-demand electrotaxis stimulation.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying compounds that rescue movement defects in PD models before costly mammalian studies.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, quantitative outputs such as swimming speed and body bend frequency for assay readiness.
- Operational Value: Facilitates automation potential with microfluidic control of worm positioning and field polarity reversal for reversal time measurements.
- Scalability: Permits screening of over 20 worms per hour, enabling efficient primary screens for neuroprotective factors.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Uses locomotion as a disease-relevant functional readout that correlates with dopaminergic neurodegeneration in C. elegans PD models.
- Mechanistic De-risking: Distinguishes neurotoxic effects from general toxicity by isolating neuronal signaling defects via electrotactic response alterations.
- Biomarker Alignment: Supports translational biomarker development by quantifying age-dependent electrotactic variability in young adults versus larvae.
Pipeline & Workflow Integration
The microfluidic electrotaxis assay integrates into discovery workflows as a phenotypic screening platform between target hit confirmation and lead optimization, providing mechanistic insights on neuronal viability.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of neuroprotective genes and compounds by quantifying locomotor recovery in disease models.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative locomotion metrics that enable Z'-factor assessment and assay robustness evaluation.
- Analytics: Provides time-resolved position and velocity outputs for kinetic analysis of electrotactic response dynamics.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling age-dependent response variations relevant to late-onset neurodegeneration.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for cross-project screening of neuronal modulators across diverse genetic backgrounds and strain backgrounds like C. briggsae.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in neuronal screening by isolating locomotion as a specific readout for neuromuscular function.
- Operational Value: Standardizes worm handling and stimulus delivery, minimizing variability from manual assays and enabling cross-site reproducibility.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by accelerating go/no-go decisions through early phenotypic profiling of neuroprotective candidates.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of hits based on dose-responsive electrotactic recovery in transgenic models expressing human disease proteins.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic device fabrication, including photolithography and PDMS bonding techniques.
- Depends on access to microscope-mounted camera systems and programmable power supplies for precise electric field control.
- Necessitates standardization of worm preparation protocols, including age synchronization and M9 buffer conditioning.
- Involves adaptation considerations when extending the assay to other nematode species or varying channel geometries.
- Limited to detecting phenotypes that affect locomotion or electro-sensation, as confirmed by source material noting that only such mutations or chemicals yield detectable responses.
