Microfluïdische-based Electrotaxis voor On-demand Kwantitatieve analyse van
2 mei 2013
Een semi-automatische micro-electro-fluidisch methode om on-demand motoriek induceren in Caenorhabditis elegans Is beschreven. Deze methode is gebaseerd op het verschijnsel van neurofysiologische wormen reageren op milde elektrische velden ("electrotaxis") in microkanalen. Microfluïdische electrotaxis dient als een snelle, gevoelige, low-cost, en schaalbare techniek voor het screenen op factoren die van invloed neuronale gezondheid.
Het algemene doel van deze procedure is het identificeren van abnormaliteiten in de neuronale en neuromusculaire signalering in het modelorganisme van C Allergan na chemische blootstelling of genetische manipulatie. Dit wordt bereikt door eerst een microkanaalpatroon te ontwerpen en in een siliciumwafer te etsen. Tijdens de tweede stap wordt de siliciumvorm gebruikt om één of meerdere microkanalen van PDMS te gieten.
Vervolgens worden de hulpcomponenten aan de PDMS-mal bevestigd. Daarna wordt het gedrag van de wormen, terwijl ze worden gestimuleerd om door het microkanaal te zwemmen, geregistreerd met een camera op een microscoop. Uiteindelijk wordt elektro-microfluidica gebruikt om de veranderingen in de neuronale en musculaire systemen van de nematoden te bepalen als gevolg van chemische of genetische manipulatie, waarbij locomotie als uitkomstmaat dient.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande technieken, in het bijzonder de gedragsassays op platen, is dat met deze methode de voortbewegingsrichting van de worm nauwkeurig kan worden gecontroleerd, waardoor een precieze kwantificering van het locomotiegedrag mogelijk is, zoals de buigingsfrequentie van het lichaam, de rotatietijd en de zwemsnelheid. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de therapie van neurodegeneratieve aandoeningen zoals Parkinson en Alzheimer, omdat het kan worden gebruikt om te screenen op chemische en genetische factoren met neuroprotectieve eigenschappen. We kregen voor het eerst het idee voor deze techniek toen we beseften dat er een gebrek was aan methoden om het bewegingsgedrag op een kwantitatieve manier te analyseren.
Beweging is vrijwillig en willekeurig, waardoor het lastig te karakteriseren is. Daarom wilden we een eenvoudige methode vaststellen die iedereen kan aanleren. Om de mastermal te maken, begint u met het baden van een silicon wafer van drie inch in aceton en vervolgens in methanol gedurende elk 30 seconden. Spoel de wafer daarna vijf minuten lang af met gedeïoniseerd water.
Gebruik vervolgens een stikstofpistool om het oppervlak van de wafers te drogen en verhit de wafer daarna twee minuten lang op een warmteplaat bij 120 °C, waarna het oppervlak van de siliciumwafer gedurende één minuut wordt geplasma-geoxideerd bij 50 W. Breng nu 3 mL SU-8 100 fotoresist aan op het oppervlak van de wafer via spin-coating bij 1.750 RPM gedurende 40 seconden, en voer vervolgens een pre-bake uit van de gecoate wafer op een warmteplaat bij 65 °C. Verhoog na 10 minuten de temperatuur gedurende twee minuten naar 95 °C en bak de wafer nog een uur extra.
Nadat de wafer van de warmteplaat is verwijderd, wordt een fotomasker met het gewenste ontwerp over de wafer geplaatst. Belicht de fotoresist gedurende 95 seconden met UV-licht. Bak de wafer vervolgens na op een warmteplaat met hetzelfde temperatuurverloop als gebruikt voor het voorbakken.
Dompel de wafer onder in SU-8. Ontwikkel de oplossing gedurende 10 tot 15 minuten. Spoel de wafer af met isopropanol om te bevestigen dat de ontwikkeling van het ontwerp is voltooid.
Spoel vervolgens gedurende 30 seconden met gedeïoniseerd water. Droog de wafer ten slotte met een stikstofpistool en bak deze kort bij 120 °C. Plaats nu de vervaardigde mastermatrijs en een blanco siliciumwafer in twee afzonderlijke petrischalen die zijn bekleed met aluminiumfolie.
Giet 20 milliliters PDMS-prepolymeer in de mastermal en schaal, en 15 milliliters in de schaal met de blanco wafer. Druk vervolgens voorzichtig op de wafers met een houten wegwerpaapplicator om eventuele luchtbellen onder de wafers te verwijderen, dek daarna beide schalen af en laat deze een dag uitharden. Nadat de wafers zijn uitgehard, verwijdert u de folie en pelt u het PDMS eraf.
Gebruik vervolgens een Harris unicorn van 2,5 millimeter om vloeistoftoegangspoorten aan beide uiteinden van het kanaal in de PDMS van de mastermold te ponsen. Snijd beide PDMS-schijven in stroken van vergelijkbare grootte. Plaats vervolgens in een cleanroom het kanaal, de blanco PDMS-strook en een glazen objectglas in een plasma-oxidator.
Stel de materialen bloot aan zuurstofplasma bij een vermogen van 40 watt gedurende 40 seconden. Plak vervolgens het kanaalstuk en het glazen objectglas aan tegenovergestelde zijden van de blanco strip en leg de materialen opzij om de hechting te voltooien. Gebruik na twee uur PDMS-prepolymeer om twee stukken plastic slang, elk minimaal zes inches lang, op een warmteplaat bij 120 °C te bevestigen aan de geperforeerde reservoirs.
Laat het PDMS uitharden voordat u verdergaat. Bevestig vervolgens een vloeistofconnector van kunststof aan een van de buisjes om de aansluiting van spuiten mogelijk te maken. Voeg nu stukken geïsoleerde koperdraad van 22 gauge en drie inch lengte toe aan elk reservoir tussen de inlaatbuis en het kanaal, en zet de draden vast met extra PDMS-prepolymeer.
Begin deze stap door het zojuist geassembleerde microkanaal op een XY-verplaatsbare tafel van een microscoop te plaatsen met een gemonteerde camera die is aangesloten op een monitor; sluit vervolgens de stroomvoorziening aan op de elektroden van de microkanalen. Nadat is bevestigd dat de weerstand van het microkanaal ongeveer 0,6 mega ohm is, bevestigt u de uitlaatbuis van het microkanaal aan een wegwerpspuit. Dompel vervolgens de opening van de inlaatbuis onder in een oplossing van nematoden gesuspendeerd in M nine fysiologische buffer.
Oefen negatieve druk uit in de spuit om vloeistof in het kanaal aan te zuigen. Wanneer zowel de inlaat- als uitlaatslangen gevuld zijn, worden de spuit en de hydrostatische kolom losgekoppeld. Stuur de stroming door de relatieve hoogte van de slangen aan te passen om een worm in het midden van het kanaal te plaatsen.
Leg vervolgens beide buizen plat op dezelfde hoogte om een nulstroom in het microkanaal te handhaven. Bij het wisselen van wormmonsters tijdens een electrotaxis-experiment, indien er na het gelijkstellen van de beide inlaatbuizen nog steeds stroming is, kunnen er kleine aanpassingen worden gemaakt aan de hoogte van de buizen ten opzichte van elkaar. Als er onzekerheid is over het feit of de stroming werkelijk nul is, kan een omkering van de beweging van de worm worden opgewekt door de polariteit van het elektrisch veld te wijzigen en vervolgens de lineaire snelheid van de worm te evalueren terwijl deze zich omdraait.
Stel nu de voeding in op het juiste voltage. Activeer het elektrische signaal en laat er één minuut pre-expositie plaatsvinden zodat de worm kan acclimatiseren aan het veld; na deze minuut zou de worm richting de kathode moeten beginnen te bewegen. Start de opname.
Wanneer het experiment is voltooid, verwijdert u alle vloeistof en wormen uit het kanaal. Spoel de kamer met gedeïoniseerd water en laat het apparaat drogen op een warmteplaat bij 125 °C. In deze representatieve video worden een wild-type jonge volwassen nematode electro axis en de positie- en snelheidsuitvoer van de worm-tracking software getoond.
De video begint met de kathode aan de rechterkant. De verschijning van de glazen pipet geeft de naderende omkering aan; de daaropvolgende verwijdering van de pipet geeft het signaal. Op het moment van de omkering worden hier de gegevens voor positie versus tijd en de momentane snelheid versus tijd weergegeven, afkomstig van het aangepaste worm-trackingprogramma voor de worm in de video; het programma heeft de snelheidscurve berekend op basis van de positie-tijdcurve.
Deze boxplot toont gegevens over de elektrosnelheid van een reeks wild-type en transgene dieren. De transgene dieren brengen het menselijke alpha-synucleïne-gen tot expressie in de spieren van de lichaamswand onder controle van de UNC 54 myosin heavy chain genpromotor, wat leidt tot eiwitaggregatie en zich manifesteert als een tragere elektrotactische respons dan die van wild-type dieren. Eenmaal beheerst, kunnen er meer dan 20 wormen per uur worden geanalyseerd als het elektrotaxis-experiment correct wordt uitgevoerd.
Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat alleen mutaties en chemicaliën die de voortbeweging of de electrosensatie beïnvloeden, fenotypes zullen produceren die detecteerbaar zijn via de elektrotaxis-assay. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u silicone moet patroneren, hoe u een microfluidische kanaal assembleert en hoe u de voortbeweging van N. method analyseert met behulp van een axxis-assay.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft een semi-geautomatiseerde micro-elektro-fluidische methode om op aanvraag locomotie te induceren bij Caenorhabditis elegans. De techniek maakt gebruik van het fenomeen electrotaxis, waardoor een snelle screening van factoren die de neuronale gezondheid beïnvloeden mogelijk is.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Microfluïdica
- Gedragsanalyse
Achtergrond
- Caenorhabditis elegans is een modelorganisme voor het bestuderen van neuronale en neuromusculaire signalering.
- Electrotaxis is een neurofysiologische respons op elektrische velden.
- Microfluïdische kanalen maken gecontroleerde experimenten met kleine organismen mogelijk.
- Inzicht in voortbeweging kan onthullingen bieden over de neuronale gezondheid.
Doel van de studie
- Om abnormaliteiten in de neuronale en neuromusculaire signalering te identificeren.
- Om de effecten van chemische blootstelling of genetische manipulatie te beoordelen.
- Om locomotie te gebruiken als maatstaf voor neuronale en musculaire veranderingen.
Gebruikte methoden
- Het ontwerpen en etsen van microkanaalpatronen in siliciumwafers.
- Het gieten van microkanalen uit PDMS met behulp van siliciummallen.
- Het bevestigen van hulpcomponenten aan de PDMS-mal.
- Het vastleggen van het gedrag van wormen met een op een microscoop gemonteerde camera.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle inductie van locomotie in C. elegans middels electrotaxis.
- Identificatie van veranderingen in neuronale en musculaire systemen.
- Demonstratie van microfluïdische electrotaxis als een schaalbare screeningsmethode.
- Inzichten in de effecten van genetische en chemische manipulaties.
Conclusies
- Microfluïdische electrotaxis is een waardevolle tool voor neurowetenschappelijk onderzoek.
- Deze methode biedt een kostenefficiënte en gevoelige aanpak om de neuronale gezondheid te bestuderen.
- Verdere toepassingen zouden het begrip van neuromusculaire aandoeningen kunnen verbeteren.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Kwantitatieve locomotieanalyse in C. elegans maakt high-throughput screening mogelijk van neuroprotectieve verbindingen en genetische modifiers in modellen voor neurodegeneratieve ziekten. Door neuronale signaleringsdefecten om te zetten in meetbare electrotactische reacties, ondersteunt deze methode vroege targetvalidatie en mechanistische risicoreductie in discovery-pipelines. Het microfluïdische formaat biedt schaalbare, reproduceerbare fenotypische read-outs die het voorspellend vertrouwen in lead-identificatiecampagnes verbeteren.
Strategische Toepassingen in Biopharma R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door de functie van dopaminerge neuronen te koppelen aan kwantificeerbare locomotie-fenotypes.
- Operationele waarde: Maakt snelle beoordeling mogelijk van genetische en chemische manipulaties die de neuronale signalering beïnvloeden middels on-demand electrotaxis-stimulatie.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt de triage van portfolio's door verbindingen te identificeren die bewegingsdefecten in PD-modellen herstellen voordat kostbare studies met zoogdieren worden uitgevoerd.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert gestandaardiseerde, kwantitatieve output zoals zwemsnelheid en buigingsfrequentie van het lichaam voor analysebereidheid.
- Operationele waarde: Faciliteert automatiseringspotentieel via microfluïdische controle van de positionering van de wormen en omkering van de veldpolariteit voor metingen van de omkeertijd.
- Schaalbaarheid: Maakt screening van meer dan 20 wormen per uur mogelijk, wat efficiënte primaire screenings voor neuroprotectieve factoren mogelijk maakt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Maakt gebruik van locomotie als een ziektgerelevante functionele uitlezing die correleert met dopaminerge neurodegeneratie in C. elegans PD-modellen.
- Mechanistische risicoreductie: Onderscheidt neurotoxische effecten van algemene toxiciteit door neuronale signaleringsdefecten te isoleren via veranderingen in de electrotactische respons.
- Afstemming van biomarkers: Ondersteunt de ontwikkeling van translationele biomarkers door leeftijdsafhankelijke electrotactische variabiliteit te kwantificeren in jonge volwassenen versus larven.
Integratie van Pipeline & Workflow
De microfluidische elektrotaxis-assay kan worden geïntegreerd in discovery-workflows als een fenotypisch screeningsplatform tussen de bevestiging van target hits en lead-optimalisatie, waardoor mechanistische inzichten in de neuronale levensvatbaarheid worden verkregen.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypotheseonderzoek naar neuroprotectieve genen en verbindingen door het kwantificeren van het herstel van de motoriek in ziektemodellen.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve locomotorische metrieken die beoordeling van de Z'-factor en evaluatie van de robuustheid van de assay mogelijk maken.
- Analytics: Biedt tijdopgeloste posities en snelheidsgegevens voor kinetische analyse van de dynamiek van de electrotactische respons.
- Translationeel Onderzoek: Sluit aan op preklinische continuïteit door het modelleren van leeftijdsafhankelijke responsvariaties die relevant zijn voor laat ontstane neurodegeneratie.
- Enterprise Hergebruik: Vestigt een herbruikbaar platform voor cross-project screening van neuronale modulatoren over diverse genetische achtergronden en stamachtergronden zoals C. briggsae.
Operationele impact en impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit bij neuronale screening door locomotie te isoleren als een specifieke readout voor neuromusculaire functie.
- Operationele waarde: Standaardiseert de hantering van wormen en de toediening van stimuli, waardoor variabiliteit uit handmatige assays wordt geminimaliseerd en reproduceerbaarheid tussen verschillende locaties mogelijk wordt.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door go/no-go-beslissingen te versnellen via vroege fenotypische profilering van neuroprotectieve kandidaten.
- Impact op portfolio: Maakt risicogewogen prioritering van hits mogelijk op basis van dosisresponsieve elektrotactisch herstel in transgene modellen die menselijke ziekteproteïnen tot expressie brengen.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in de fabricage van microfluïdische apparaten, inclusief fotolithografie en PDMS-bondingtechnieken.
- Afhankelijk van toegang tot op een microscoop gemonteerde camerasystemen en programmeerbare voedingen voor een nauwkeurige controle van het elektrische veld.
- Necessiteert standaardisatie van protocollen voor de preparatie van wormen, inclusief leeftijdsynchronisatie en conditionering met M9-buffer.
- Omvat overwegingen voor aanpassingen bij het uitbreiden van de assay naar andere nematode-soorten of variërende kanaalgeometrieën.
- Beperkt tot het detecteren van fenotypes die de locomotie of elektrosensatie beïnvloeden, aangezien uit bronmateriaal blijkt dat alleen dergelijke mutaties of chemicaliën detecteerbare responsen opleveren.
