Vergelijkende analyse van experimentele methoden om dierlijke activiteit in Caenorhabditis elegans-modellen van mitochondriale ziekte te kwantificeren

Dit protocol maakt gebruik van twee verschillende semi-geautomatiseerde assays om de locomotorische activiteit van C.elegans in vloeibaar medium snel te kwantificeren en heeft het potentieel om te worden toegepast voor geneesmiddelenscreening in C.elegans-ziektemodellen. De belangrijkste voordelen van deze twee technieken zijn hun gebruiksgemak en gemak van reproduceerbaarheid. Beide technieken hebben het potentieel om medicijneffecten op wormgedrag te evalueren met variabele doorvoer.

Deze motiliteitstests zijn nuttig voor het evalueren van de locomotorische activiteit van C.elegans mitochondriale ziektemodellen waarbij het neuromusculaire systeem van de dieren is aangetast. Om de locomotorische activiteit van C.elegans in vloeibaar medium op glazen dia's te analyseren na synchronisatie van de controle in gemuteerde wormenstammen op NGM-platen met en zonder medicamenteuze behandelingen die van belang zijn voor de L4-fase, gebruikt u een wormenplectrum en een stereomicroscoop om vijf wormen per stam en conditie te plukken in individuele 20 microliter druppels S.basale oplossing op een glazen dia. Voeg wormen uit dezelfde experimentele toestand van verschillende NGM-platen toe aan meerdere druppels op dezelfde dia om meerdere technische replicaties te verkrijgen.

Wanneer alle wormen zijn verzameld, laat u de dieren een minuut bij kamertemperatuur op de glijbaan acclimatiseren voordat u de zwemactiviteit van de wormen in elke druppel gedurende één minuut registreert met 15 frames per seconde per druppel. Om de opgenomen C.elegans locomotorische activiteit te analyseren met behulp van ZebraLab-software, gebruikt u de ZEBRALAB AVI-optie om video's naar de software te uploaden. Klik op de optie Kwantificering met AVI-bestanden.

Als u een nieuw protocol wilt maken, selecteert u Parameters, Protocolparameters en Tijd en stelt u de duur van het experiment in op één minuut. Selecteer Geen tijdsvak en schakel integratieperiode uit op basis van de gewenste gegevensuitvoer en selecteer Bestand en Een film openen om elk afzonderlijk eerder opgenomen videobestand te uploaden. Als u één detectiegebied wilt bouwen, gebruikt u het cirkelgereedschap om een gebied te maken rond de hele vloeistofdruppel waarin de wormen zich bevinden.

De activiteit van alle wormen binnen het geselecteerde gebied wordt gedetecteerd. Als u de te kalibreren afstand wilt aangeven, tekent u een horizontale lijn van links naar rechts van het videogebied en selecteert u Kalibratie, Tekenen en Toepassen op groep. Om detectie van alle verschillende C.elegans-wormstammen te kunnen analyseren, schakelt u het pictogram Gebied uit en past u de detectiegevoeligheid in de activiteitsdrempel aan.

Als u de sporen wilt visualiseren die door de dieren zijn gemaakt terwijl de activiteitsanalyse aan de gang is, stelt u de weergaveschaal in op 70 en selecteert u Toepassen op groep. Als u de video's wilt analyseren, klikt u op Afspelen en selecteert u Experimenteren en Uitvoeren om een bestandsnaam voor de video in te voeren. Na het opslaan verschijnt er een venster met de vraag of de video op de maximale computersnelheid moet worden geanalyseerd.

Klik op Ja. Het venster van het actieve experiment wordt geopend. Klik op Start.

Wanneer de opnameanalyse is voltooid, klikt u op Experimenteren en stoppen om de geanalyseerde activiteit in de druppel in een spreadsheet op te slaan. Om de locomotorische activiteit van C.elegans in vloeibaar medium in een 96-well plaatformaat te analyseren, wanneer de wormen het L4-stadium bereikten, voegt u 50 microliter van 2% gewicht per volume E.coli OP50 en S.basaal medium toe aan elke put van een heldere 96-well flat bottom microplaat. Gebruik de stereomicroscoop om handmatig 15 gesynchroniseerde wormen per put van de 96-putplaat te plukken en laat de wormen 20 minuten acclimatiseren.

Gebruik aan het einde van de acclimatisatieperiode een standaard flatbedscanner om elke microplaat twee keer te scannen met minder dan 10 seconden tussen scans Om de scans te analyseren, gebruikt u open-source software om de twee opeenvolgende scans uit te lijnen en de pixelveranderingsgegevens tussen de twee afbeeldingen en de relatieve wormscanscore te verkrijgen om de veranderingen in locomotorrespons te bepalen op basis van de lichtintensiteit die door de scanner wordt geproduceerd wanneer deze op een pixel is ingesteld drempel van vijf. In deze analyse van C.elegans locomotorische activiteit in een enkele druppel vloeibaar medium, toonden de mitochondriale complex I ziektewormen een significante afname van 38% in hun locomotorische activiteit in het L4-stadium in vergelijking met wild-type wormen. Evenzo toonde wormenscananalyse van dezelfde populaties een significante vermindering van de locomotorische activiteit voor de L4-stadiumziektemodelwormen in vergelijking met N2 Bristol wild-type wormen.

Dit locomotiefactiviteitsverlies werd ook waargenomen bij volwassen dag één stadium mitochondriaal complex I ziektewormen zoals beoordeeld door wormscananalyse. Het is essentieel om te onthouden om het juiste aantal wormen te gebruiken bij het instellen van elke test. Na deze procedure voert ons lab regelmatig een drugsscreening uit.

Deze twee technieken worden in ons laboratorium gebruikt voor het evalueren van de effecten van geneesmiddelen die van belang zijn op de wormactiviteit in preklinische diermodellen van mitochondriale ziekten.