Concurrent Kwantificering van Cellulaire en extracellulaire componenten van biofilms

Het algemene doel van deze procedure is om gelijktijdige driedimensionale verdelingen van drie cellulaire en extracellulaire biofilmcomponenten te kwantificeren en vergelijken na behandeling met antibacteriële middelen. Dit wordt bereikt door eerst harscomposietspecimens te fabriceren en vervolgens te polijsten. In de tweede stap worden de interessante biofilms op de specimens gekweekt en vervolgens behandeld met antibacteriële middelen.

Vervolgens worden de biofilms gekleurd met fluorochromen voor extracellulaire polymere stoffen, nucleïnezuren en eiwitten, en vervolgens afgebeeld door confocale laserscanningmicroscopie. In de laatste stap worden driedimensionale beelden van de overelkaar liggende fluorochromen gereconstrueerd om de gelijktijdige visualisatie van de biofilmcomponenten te vergemakkelijken en structurele parameters worden berekend uit de biofilmbeelden. Uiteindelijk kan statistische analyse van de structurele parameters van de biofilm, zoals biovolume en gemiddelde biofilmdikte, worden uitgevoerd om verschillen tussen de behandelings- en controlegroepen te vergelijken.

Het belangrijkste voordeel van deze procedure ten opzichte van bestaande methoden is dat het duidelijke maar onderling verbonden technieken gebruikt om de verdeling van meerdere componenten binnen de structuur van biofilms te karakteriseren die onder specifieke omstandigheden zijn gekweekt, waardoor de procedure zal worden uitgevoerd door Dr.Fernando Flores, een postdoctoraal onderzoeker, en Ms.Kristen Smart, een onderzoeksassistent uit mijn laboratorium. Om de specimens te maken, begint u met het plaatsen van één increment van 0,4 of TPH drie tandheelkundige harscomposiet in op maat gemaakte roestvrijstalen mallen. Polymeriseer vervolgens het eerste increment met een LED-lichthardingseenheid gedurende 40 seconden. Na het herhalen van de procedure voor het tweede increment, gebruikt u een semi-automatische grinder-polijstmachine om de uitgeharde specimens tot een acceptabele uiteindelijke oppervlakteafwerking te polijsten.

Steriliseer ten slotte de specimens om de biofilm te laten groeien. Injecteer eerst een enkele kolonie van S mutans in vier milliliter overnachtcultuurmedium en incubeer vervolgens de cultuur bij 37 graden Celsius gedurende 16 tot 18 uur om een optische dichtheid van minimaal 0,9 te bereiken. Verdun vervolgens de cultuur in een verhouding van één tot 100 in 10 milliliter biofilmgroei.

Breng de steriele harscomposietspecimens aseptisch over naar steriele 12-well platen en voeg vervolgens 2,5 milliliter van de verdunde cultuur toe aan elk van de wells. Voeg voor mondwaterbehandelings- en controlegroepen 2,5 milliliter steriele niet-geïncubeerde biofilmgroeimedium toe aan de steriliteitscontrole-wells en laat vervolgens de biofilms groeien bij 37 graden Celsius onder microparafiele omstandigheden op een schudder bij 100 RPM. Na 24 uur aspireert u aseptisch het medium uit alle wells en spoelt u elk wel twee keer met 2,5 milliliter steriele PBS waarbij u na elke wasbeurt het zout water afzuigt, vervolgens elk wel aan te vullen met 2,5 milliliter vers biofilmgroeimedium en incubeert u de plaat gedurende nog eens 24 uur zoals zojuist gedemonstreerd voor een totale biofilmgroei Duur van 48 uur nadat de biofilmgroei voltooid is, aspireert u het groeimedium en verdeelt u vervolgens 2,5 milliliter mondwater in elk behandelingsgroepwel en 2,5 milliliter sterieel ultrapuur water in de controlegroep.

Schud de platen goed op een orbitale schudder bij 150 RPM en aspireer vervolgens na 60 seconden zowel het mondwater als het ultrapuur water uit de wells om het exopolysaccharidecomponent van de biofilms te kleuren. Incubeer elke biofilm met 50 microliter LOR-conjugaat gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur beschermd tegen licht. Was vervolgens de specimens twee keer met 2,5 milliliter TC-buffer waarbij u na elke wasbeurt afzuigt en kleurt de nucleïnezuren in elke biofilm met een druppel van 50 microliter cytonine gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur beschermd tegen licht.

Na het twee keer wassen van de specimens, kleurt u de eiwitcomponenten in elke biofilm met 50 microliter Cipro rood gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht. Was de specimens vervolgens drie keer en brengt u ze over naar individuele wells van een zes-well plaat met zes milliliter sterieel ultrapuur water per well om hun visualisatie door confocale microscopie te vergemakkelijken om beelden van elk van de componentkleuren binnen de biofilms van de behandelings- en controlegroepen te verkrijgen. Stel de lasers van een confocale laserscanningmicroscoop in op de volgende instellingen voor de detectie van exopolysacchariden door Exor-conjugaatkleuring, gebruik een 633 nanometer laser en een emissiebaand van 659 tot 749 nanometer voor de detectie van nucleïnezuren door cytoninekleuring.

Gebruik een 488 nanometer laser en een emissiebaand van 495 tot 500 nanometer en voor de detectie van eiwitten door Cipro roodkleuring, gebruik een 543 nanometer laser en een emissiebaand van 615 tot 651 nanometer. Gebruik vervolgens een 63 x dompellens met een numerieke opening van 0,9 en een werkafstand van 2,2 millimeter. Verzamel confocale laserscanningmicroscopiebeelden bij 400 hertz met sequentieel scannen in de tussenstacksmodus om de opname van beelden van meerdere kleuren binnen dezelfde biofilm te optimaliseren.

Na analyse van de confocale laserscanningmicroscopiebeelden, gebruikt u de menuoptie 3D-renderer in velocity-beeldanalysesoftware om een gereconstrueerd 3D-beeld van de overelkaar liggende componentkleuren binnen elke biofilm te maken. Draai vervolgens het 3D-beeld om een optimale weergave van de biofilm te verkrijgen. Neem vervolgens een momentopname van de biofilmreconstructie en exporteer de momentopname in een geschikt beeldbestandsformaat.

Voer ten slotte een visuele analyse uit van de gelijktijdige verdeling van de exopolysaccharide nucleïnezuur- en eiwitcomponenten binnen de biofilms. Bereken in de gereconstrueerde beelden biofilmstructurele parameters zoals biovolume en gemiddelde biofilmdikte met behulp van ISA 3D-software in deze tabel. De gemiddelde en standaarddeviatiewaarden van de biofilmstructurele parameters berekend met behulp van statistische analysesoftware worden weergegeven. De gemiddelde en standaarddeviatiewaarden voor de structurele parameters van de biofilms die met mondwater zijn behandeld en die significant verschillen van die van de biofilms in de controlegroep, worden gemark