Kwantificering van de effecten van antimicrobiële stoffen op in vitro biofilmarchitectuur met behulp van COMSTAT-software
14 december 2020
Door antimicrobiële stoffen geïnduceerde veranderingen in de biofilmarchitectuur van Pseudomonas aeruginosa verschillen tussen klinische isolaten die zijn gekweekt van patiënten met cystische fibrose en chronische longinfectie. Na confocale microscopie kan COMSTAT-software worden gebruikt om variaties in biofilmarchitectuur (bijv. oppervlakte, dikte, biomassa) voor individuele isolaten te kwantificeren om de werkzaamheid van anti-infectiemiddelen te beoordelen.
De betekenis van dit protocol is dat het een eenvoudige en reproduceerbare framework biedt voor het kwantificeren van in vitro biofilmstructuren onder verschillende antimicrobiële omstandigheden. Het grote voordeel van deze techniek is dat het subjectieve variaties elimineert die geassocieerd zijn met de handmatige bediening van COMSTAT, wat uiteindelijk de standaardisatie en transparantie van experimenten tussen onderzoekscentra vergemakkelijkt. Om de Pseudomonas aeruginosa-culturen te beeld, plaatst u de plaat op het stage van een confocale microscoop, uitgerust met de juiste laserexcitatielongen en filtersets.
En gebruik een 20 tot 25x waterimmersielens om ten minste zes gelaagde z-stack beelden te maken van het substraat tot de bovenkant van elk biofilmsegment in stappen van 0,3 micrometer. Sla de beelden vervolgens op als OME-TIFFs voor COMSTAT-analyse. Wanneer alle beelden zijn verworven, opent u het COMSTAT2-pakket in ImageJ en maakt u een bronmap op het bureaublad.
Voeg een enkele OME-TIFF toe aan de map en open OME-TIFF vanuit de bronmap. Verwijder eventuele lege lagen zonder biomassa. Selecteer Bestand, Importeren en Beeldsequentie om het bestand in ImageJ te importeren.
Loceer en markeer de bronmap zonder deze te openen en klik op Selecteren. Er verschijnt een venster met sequentie-opties, klik op OK. Selecteer Beeld, Transformeren en Z-as omdraaien om de oriëntatie van het biofilm om te draaien zodat het substraat zich bovenaan de stack bevindt. Om de beeldeigenschappen te definiëren, selecteert u Beeld en Eigenschappen, er verschijnt een bronvenster.
Geef de lengte-eenheid op als micrometer, definieer de voxeldiepte als 0,3 en klik op OK. Selecteer Beeld, Aanpassen en Drempel. Om de beelddrempel in het drempelvenster aan te passen, plaatst u de onderste schuifregelaar ver naar rechts om de maximale drempelwaarde handmatig in te stellen en gebruikt u de bovenste schuifregelaar om de minimale drempel in te stellen. Gebruik vervolgens de schuifregelaar in het beeldvenster om door elke laag te scrollen om ervoor te zorgen dat de achtergrondruis voldoende is verwijderd door de hele stack, en selecteer Instellen om de onderste drempelwaarde te bevestigen.
In het venster voor het instellen van drempelwaarden, selecteert u OK en stelt en bevestigt u op dezelfde manier de maximale drempelwaarde. Selecteer Toepassen, klik op OK in het venster dat verschijnt om de stack om te zetten naar binair en verlaat het drempelvenster. Selecteer Plugins, Bio-Formats en Bio-Formats Exporter om het bestand met een nieuwe bestandsnaam in de bronmap op te slaan.
Er verschijnt een venster met meerdere bestanden van Bio-Formats Exporter, selecteer OK. Er verschijnt een venster met opties voor Bio-Formats Exporter, selecteer opnieuw OK. Om COMSTAT te runnen, selecteert u plugins en COMSTAT2, er verschijnt een informatievenster, selecteer OK. In het venster Geobserveerde mappen, selecteert u Toevoegen, lokaliseert en markeert u de bronmap, markeert en klikt u op Kiezen. Er verschijnt een venster met Afbeeldingen in mappen dat de te analyseren OME-TIFFs vermeldt.
In het COMSTAT2.1-venster, deselecteert u Automatisch Drempelstelling Otsu's Methode en Geconnecteerde Volume Filteren om ervoor te zorgen dat de software vooraf ingestelde drempelwaarden gebruikt voor individuele OME-TIFFs. In het COMSTAT2.1-venster, selecteert u Biomassa, Diktedistributie en Oppervlakte en klikt u op Ga om het programma uit te voeren. De uitvoergegevens worden weergegeven in het logboekvenster.
De metingen worden automatisch opgeslagen als TXT-bestanden in de bronmap. In deze representatieve analyse werd een Pseudomonas aeruginosa-isolaat, gekweekt van een geïnfecteerde cystische fibrosepatiënt, gebruikt om de sterktes van deze benadering te demonstreren, waarbij onnauwkeurige kwantificering van antimicrobieel geïnduceerde veranderingen in in vitro biofilmarchitectuur werd bereikt. Levende celbeeldvorming kan ook veranderingen in Pseudomonas aeruginosa-biofilmstructuur visualiseren voor en na specifieke monoklonale en tobramycine-behandeling van biofilm.
COMSTAT-gegevensanalyse onthulde significante verschillen tussen behandelde biofilmstructuren vergeleken met controleculturen. In tobramycine-behandelde culturen werd een duidelijke vermindering in de gemiddelde dikte en biomassa waargenomen. Echter, in aanwezigheid van antilichamen, was de P. aeruginosa-biofilm resistent tegen deze tobramycine-geïnduceerde structurele veranderingen.
Bij het onderzoeken van de oppervlakte-tot-biovolume-verhouding, werd een significante vermindering waargenomen in aanwezigheid van antilichamen in zowel tobramycine-behandelde als niet-behandelde biofilms, wat duidt op de vorming van aggregaten in door antilichamen behandelde culturen. Deze procedure kan worden uitgevoerd om kwantitatief de effecten van verschillende antimicrobiële middelen die worden gebruikt om biofilmmatrices te verstoren te beoordelen of te vergelijken. Door deze techniek als een algemene framework te gebruiken, kunnen onderzoekers verschillende manieren verkennen om het protocol te verfijnen om nieuwe wiskundige modellen en algoritmische plugins in ImageJ op te nemen om biofilmheterogeniteit beter weer te geven.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een reproduceerbaar kader voor het kwantificeren van biofilmstructuren van Pseudomonas aeruginosa onder verschillende antimicrobiële omstandigheden. Het protocol beoogt de beoordeling van de biofilmarchitectuur te standaardiseren, waardoor de transparantie tussen onderzoeksinstellingen wordt vergroot.
Belangrijkste Onderdelen van de Studie
Wetenschappelijk gebied
- Microbiologie
- Biofilmonderzoek
- Antimicrobiële werkzaamheid
Achtergrond
- Pseudomonas aeruginosa is een veelvoorkomende pathogeen bij patiënten met cystische fibrose.
- De architectuur van de biofilm kan de behandelresultaten beïnvloeden.
- Het kwantificeren van biofilmkenmerken is essentieel voor het evalueren van anti-infectieuze middelen.
- COMSTAT-software biedt een methode voor de objectieve analyse van biofilms.
Doel van de studie
- Om variaties in de biofilmarchitectuur tussen klinische isolaten te kwantificeren.
- Om de effectiviteit van verschillende antimicrobiële middelen te beoordelen.
- Om subjectieve variaties in de biofilmanalyse te elimineren.
Gebruikte methoden
- Confocale microscopie voor het afbeelden van biofilmstructuren.
- COMSTAT-software voor het kwantificeren van biofilmkenmerken.
- Gebruik van een 20 tot 25x waterimmersie-objectief voor beeldvorming.
- Acquisitie van z-stackbeelden in incrementen van 0,3 µm.
Belangrijkste resultaten
- Variaties in de architectuur van de biofilm werden waargenomen tussen verschillende isolaten.
- Het protocol maakte gestandaardiseerde analyse over verschillende experimenten heen mogelijk.
- COMSTAT-analyse leverde objectieve metrieken op voor de beoordeling van de biofilm.
- De antimicrobiële effectiviteit werd geëvalueerd op basis van de biofilmkenmerken.
Conclusies
- Het protocol verhoogt de reproduceerbaarheid in biofilmonderzoek.
- Standaardisatie verbetert de betrouwbaarheid van experimentele resultaten.
- Toekomstige studies kunnen voortbouwen op dit kader voor verdere onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Gestandaardiseerde kwantificering van antimicrobiële effecten op de biofilmarchitectuur ondersteunt de doelwitvalidatie bij de ontwikkeling van anti-infectieve middelen. Objectieve biofilmmetrieken maken mechanistische risicoreductie van therapeutische kandidaten mogelijk door de blootstelling aan verbindingen te koppelen aan structurele uitkomsten. Deze aanpak verbetert het voorspellende vertrouwen bij preklinische screening door de variabiliteit in de beoordeling van het biofilmfenotype tussen laboratoria te verminderen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek naar antimicrobiële mechanismen mogelijk door veranderingen in biofilmdikte, biomassa en de verhouding tussen oppervlakte en biovolume te kwantificeren.
- Operationele waarde: Vermindert subjectieve variabiliteit bij beeldanalyse, wat reproduceerbare beoordelingen van target engagement over verschillende locaties ondersteunt.
- Voorspellende waarde: Faciliteert go/no-go-beslissingen door kwantitatieve drempels voor antibiofilm-effectiviteit te bieden.
Screening & assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert gestandaardiseerde, kwantitatieve resultaten (biomassa, dikteverdeling, oppervlakte) voor screeningscampagnes van verbindingen.
- Operationele waarde: Vestigt een herbruikbare imaging- en analyseworkflow die compatibel is met high-content confocale platforms.
- Assay-gereedheid: Bereidt gevalideerde biofilm-systemen voor op downstream evaluatie van antimicrobiële of antibiofilm-middelen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Verbindt in vitro biofilmfenotypen met klinisch relevante Pseudomonas aeruginosa isolaten van cystische fibrose-infecties.
- Mechanistische risicoreductie: Maakt onderscheid tussen antimicrobiële effecten op de biofilmstructuur versus de bacteriële levensvatbaarheid, waardoor de werkingswijze wordt verduidelijkt.
- Risicogestuurde progressie: Ondersteunt de prioritering van verbindingen die de biofilmarchitectuur verstoren zonder resistentiefenotypen te induceren.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie tot leadoptimalisatie en biedt kwantitatieve biofilmphenotypering om structuur-activiteitsrelaties te onderbouwen.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing door antimicrobiële behandeling te koppelen aan meetbare veranderingen in de biofilmarchitectuur.
- Screening: Maakt standaardisatie en reproduceerbaarheid van assays mogelijk door vaste drempelwaarden en het elimineren van gebruikersafhankelijke segmentatie.
- Analytics: Levert objectieve, kwantitatieve resultaten (biomassa, dikte, oppervlakte) die een directe vergelijking van antimicrobiële condities mogelijk maken.
- Translationeel onderzoek: Maakt gebruik van ziekte-relevante P. aeruginosa-isolaten om de preklinische continuïteit en biomarker-afstemming te verbeteren.
- Enterprise Reuse: Vestigt een gestandaardiseerd kader dat aanpasbaar is voor andere biofilm-vormende pathogenen of antimicrobiële klassen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in antibiofilm-activiteit door misinterpretatie van heterogene biofilmstructuren te minimaliseren.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie en de vergelijkbaarheid tussen laboratoria door subjectieve variaties in de bediening van COMSTAT te elimineren.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door het aantal mislukte preklinische transities als gevolg van slecht gekarakteriseerde biofilm-effecten te verminderen.
- Impact op portfolio: Maakt risicogecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling mogelijk op basis van kwantitatieve drempelwaarden voor biofilmdisruptie.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in confocale microscopie en beeldbewerking voor z-stack acquisitie en preprocessing.
- Afhankelijk van toegang tot confocale laserscannende microscopen met passende excitatiegolflengten en 20–25x waterimmersie-objectieven.
- Vereist gestandaardiseerde beeldformattering (OME-TIFF) en maporganisatie voor batch COMSTAT2-analyse.
- Houdt rekening met aanpassingen bij toepassing op verschillende biofilmmodellen of antimicrobiële mechanismen.
- Beperkt door de tijdsinvestering die nodig is voor handmatige preprocessing van beelden voorafgaand aan de geautomatiseerde COMSTAT-analyse.
