Name: Stabiliserende Hepatocellulaire Fenotype behulp Geoptimaliseerd Synthetic Surfaces (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Leer hoe je polymeren oppervlakken optimaliseert voor stabiele hepatocytenkweek met PU 1 3 4. Deze methode verbetert celhechting en metabole functie voor leveronderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

DCH, MB en FK werden ondersteund door een EPSRC Volg op het Fonds. BL-V en DS werden elk ondersteund door MRC PhD-training. KC werd ondersteund door financiering uit het Verenigd Koninkrijk Regenerative Medicine Platform.

1 Synthese van PHNGAD (Poly [1,6-hexanodiol / neopentylglycol / di (ethyleenglycol) -alt adipinezuur] diol) <img alt="Schema 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51723/51723scheme1.jpg" width="500" /> Schema 1: Synthese van PHNAGD Schematische voorstelling van de synthese van PHNAGD.. PHNAGD werd bereid door reactie van 1,6-Hexanodiol, diethyleenglycol, neoppentyl glycol en adipinezuur. PHNAGD, Poly [1,6-hexanodiol / neopentylglycol / di (ethyleenglycol) -alt adipinezuur] diol. <ol><li> Toepassen warmtebehandeling om de monomeren 1,6-hexaandiol, di (ethyleenglycol) en neopentylglycol bij 40 ° C gedurende 48 uur in een vacuümoven om het resterende water te verwijderen. Laat koude af tot kamertemperatuur onder vacuüm. </li><li> Voeg 22 mmol van elk monomeer en adipinezuur (55 mmol) om een ​​twee-hals rondbodemkolf uitgerust met een geroerde bar en verbonden met een Dean-Stark inrichting. </li><li> Plaats het geheel onder een vacuüm en verwarm het glassware bij 40 ° C gedurende 6 uur, om eventuele vochtopname tijdens de toevoeging van de chemische stof in de kolf voorkomen. </li><li> Voeg via een injectiespuit, druppel voor druppel, 0,0055 mol van de katalysator titanium (IV) butoxyde. </li><li> Roer het reactiemengsel bij 180 ° C, onder een N2 atmosfeer gedurende 24 uur, en restolie water in de Dean-Stark val. Laat het product afkoelen tot kamertemperatuur. </li></ol> 2 Synthese van PU134 <img alt="Schema 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51723/51723scheme2.jpg" width="500" /> Schema 2: Synthese van PU134 Schematische voorstelling van de synthese van polyurethaan 134 PU134 werd bereid door reactie van 1,0 equivalent van een PHNGAD met 2,0 equivalenten van een 4,4-methyleenbis (fenylisocyanaat), gevolgd door de toevoeging van 1,0. equivalent van een 1,4-butaandiol ketenverlenger. <ol><li> Meng een equivalent van de polyol PHNGAD (Mn ~ 1.800 Da, 3,2 mmol) met twee equivalenten van 4&#39;4-methyleenbis (fenylisocyanaat) (6.4 mmol) in watervrij N, N-dimethylformamide (12 ml). </li><li> Roer het reactiemengsel bij 70 ° C, onder een N2 atmosfeer. </li><li> Voeg via een injectiespuit druppelsgewijs de katalysator titanium (IV) butoxide (0,8% gew). </li><li> Na 1 uur, voeg een equivalent van de ketenverlenger 1,4-butaandiol (3,2 mmol). Verhoog de ​​temperatuur op 90 ° C en roer gedurende 24 uur onder een N2 atmosfeer. </li><li> Na de reactie, verzamel het polyurethaan door precipitatie door toevoeging van diethylether (hexaan of water kan worden gebruikt) druppelsgewijs aan de reactieoplossing tot het neerslaan plaatsvindt. </li><li> Centrifugeer de oplossing bij 5300 g gedurende 5 minuten. </li><li> Giet het supernatant en drogen bij 40 ° C in een vacuüm oven totdat het oplosmiddel verdampt. Opmerking: Om ervoor te zorgen dat het eindproduct van de reactie hebben de juiste parameters betreffende de molecuulgewichtsverdeling, de functionele groups van het polymeer en het smelten en glasovergangstemperaturen kunnen diverse analytische technieken en methoden gebruikt, zoals gelpermeatiechromatografie of FITR spectroscopie. </li></ol> 3 Voorbereiding van de PU134 Solutions <ol><li> Weeg 200 mg PU134 in een glazen fles. </li><li> Verdun PU134 een eindconcentratie van 2% in verschillende oplosmiddelen: chloroform, een combinatie van chloroform en tolueen in 1: 1 verhouding, tetrahydrofuran en combinatie van tetrahydrofuran en dichloormethaan in 1: 1 verhouding. Opmerking: De keuze van het juiste oplosmiddel varieert afhankelijk van het polymeer te gebruiken. Verschillende oplosmiddelen hebben verschillende kookpunten dat de oplosbaarheid van het polymeer beïnvloeden. </li><li> De oplossing wordt krachtig gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur met een schudder bij een snelheid van 200 mot / min, totdat de oplossing homogeen en geen neerslag waargenomen. </li></ol> 4 Coating van Glass Slides met PU134 <ol><li> Plaats een round 15 mm 2 dekglaasje op de spin coater. </li><li> Solliciteer 50 ul van de PU134 oplossing voor elk gebruik van een pipet. Het volume van de oplossing PU134 derhalve voor gewenste dekglaasje grootte waarbij de volume verhouding proportioneel oppervlak. </li><li> Draai elk dekglaasje voor 7 sec bij 23 x g. </li><li> Droging dekglaasje bij kamertemperatuur gedurende ten minste 24 uur voorafgaand aan de sterilisatie. </li></ol> 5 Bestraling van Coverslip <ol><li> Gamma-bestraald polymeer beklede dekglaasje door een dosis van 10 Grays met een klinisch bestraler voor 12 minuten. </li><li> UV-bestraling van polymeer coating dekglaasje met behulp van een 30 W, UV-lamp voor 16 minuten aan elke kant. </li><li> Plaats de polymeer beklede dekglaasje in een geschikt weefselkweekplaat volgens formaatschuif. </li></ol> 6 Scanning Electron Microscopy <ol><li> Gouden jas polymeer dekglaasje door sputteren voor 200 sec in een atmosfeer van 5 x 10 -1 millibar druk. </li><li> Leg de microgRAFIEKEN van het polymeer gecoate dekglaasje met behulp van een scanning elektronenmicroscoop in versneld spanning van 20 kV in secundaire elektronen imaging-modus. </li></ol> 7 Atomic Force Microscopy Waarnemingen <ol><li> Scan een gebied van 20 x 20 urn van het polymeer oppervlak. </li><li> Het opzetten van een scansnelheid van 1,32 Hz tot 1,60 Hz. </li><li> Het opzetten van een resolutie van 512 x 512 pixels in het gescande gebied. </li><li> Bereken het kwadratisch gemiddelde (RMS of Rq) van de bekleding met de gemiddelde hoogte afwijkingen uit de gemiddelde beeldgegevens vliegtuig, uitgedrukt als: <img fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/51723/51723eq1.jpg" width="123" /> Waarbij Zi is de huidige waarde Z en N is het aantal punten in het gegeven gebied. </li><li> 7.5 Bereken de afwijking of bedoel oppervlakteruwheid (Ra) van het beeld met behulp van, <img fo:content-width="1.5in" src="/files/ftp_upload/51723/51723eq2.jpg" width="154" /> Waarbij Z (x) is de functie waarmee t beschrijfthij de oppervlakte profiel in termen van hoogte (Z) en de positie (x) van de steekproef over de evaluatie lengte &quot;L&quot; geanalyseerd. Ra staat voor de gemiddelde waarde van het oppervlak ten opzichte van het middenvlak. </li></ol> 8 Cell Culture en differentiatie <ol><li> Cultuur en differentiëren van de menselijke embryonale stamcellen lijn (hESC) H9, zoals beschreven in het hooi 17. </li><li> Maak cellen met een dissociatie reagens en replate ze op PU134 gecoate glaasjes op dag 9 van het differentiatieproces, in aanwezigheid van een serumvrij medium zoals beschreven in Szkolnicka 18,19. Opmerking: Het gebruik van een enzymatische cel dissociatie voorkeur fysieke cel onthechting. </li></ol> 9 cytochroom P450 Functionele Assay <ol><li> Meet CYP3A activiteit volgens de instructies van de fabrikant. </li><li> Incubeer hESC afgeleide hepatocyten op dag 13 of dag 19, en de media, zonder cellen - als een negatieve controle, met de juiste substrat 5 uur bij 37 ° C. </li><li> Verzamel supernatanten van cellen en media, voert de test volgens instructies van de fabrikant. </li><li> Meet het niveau van CYP activiteit genormaliseerd ten opzichte van het oppervlak (cm2). </li></ol> 10. Immunokleuring <ol><li> Wash hESC afgeleide hepatocyten met PBS, gedurende 1 min, tweemaal herhalen. </li><li> Voeg ijskoude 100% methanol cellen vast, plaats in -20 ° C gedurende 10 minuten. </li><li> Was de cellen met PBS gedurende 5 minuten en herhaal twee keer. </li><li> Incubeer de cellen met PBS / T (0,1% tween) / 10% BSA gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. </li><li> Zuig het PBST oplossing en voeg het juiste primaire antilichaam verdund in PBS / T (0,1% tween) / 1% BSA, incuberen bij 4 ° C onder zacht roeren O / N. </li><li> Was de cellen met PBS / T (0,1% tween) / 1% BSA gedurende 5 minuten en drie keer herhalen. </li><li> Verdun het juiste antilichaam in PBS / T (0,1% tween) / 1% BSA, aan de cellen en incubeer in het donker bij kamertemperatuur gedurende 1 uur onder zacht schudden. </li><li> Was de cellen met PBS gedurende 5 minuten en drie keer herhalen. </li><li> Voeg Mowiol 488 (met DAPI 1: 1000) aan elk putje, voeg een dekglaasje zachtjes aantal luchtbellen verminderen. WINKEL gefixeerde cellen bij 4 ° C in het donker. Observeer kleuring met behulp van een microscoop met een geschikte filter en tl-lamp. De optimale primaire en secundaire antilichamen zijn vermeld in tabel 1. </li></ol>

<ol><li>Zhou, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMOylation+of+HNF4%CE%B1+regulates+protein+stability+and+hepatocyte+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">SUMOylation of HNF4α regulates protein stability and hepatocyte function.</a> J Cell Sci. 125 (15), 3630-3635 (2012).</li>
<li>Banerjee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+hydrogel+modulus+on+the+proliferation+and+differentiation+of+encapsulated+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The influence of hydrogel modulus on the proliferation and differentiation of encapsulated neural stem cells.</a> Biomaterials. 30 (27), 4695-4699 (2009).</li>
<li>Shanbhag, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+Progenitor+Cells+Grown+on+Hydrogel+Surfaces+Respond+to+the+Product+of+the+Transgene+of+Encapsulated+Genetically+Engineered+Fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Neural Progenitor Cells Grown on Hydrogel Surfaces Respond to the Product of the Transgene of Encapsulated Genetically Engineered Fibroblasts.</a> Biomacromolecules. 11 (11), 2936-2943 (2010).</li>
<li>Battista, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+matrix+composition+of+3D+constructs+on+embryonic+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The effect of matrix composition of 3D constructs on embryonic stem cell differentiation.</a> Biomaterials. 26 (31), 6194-6207 (2005).</li>
<li>Tian, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronic+acid+hydrogel+as+Nogo-66+receptor+antibody+delivery+system+for+the+repairing+of+injured+rat+brain%3A+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Hyaluronic acid hydrogel as Nogo-66 receptor antibody delivery system for the repairing of injured rat brain: in vitro.</a> Journal of Controlled Release. 102 (1), 13-22 (2005).</li>
<li>Keshaw, H., Forbes, A., Day, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Release+of+angiogenic+growth+factors+from+cells+encapsulated+in+alginate+beads+with+bioactive+glass%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Release of angiogenic growth factors from cells encapsulated in alginate beads with bioactive glass.</a> Biomaterials. 26 (19), 4171-4179 (2005).</li>
<li>Baharvand, H., Hashemi, S. M., Kazemi Ashtiani, S., Farrokhi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+hepatocytes+in+2D+and+3D+culture+systems+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human embryonic stem cells into hepatocytes in 2D and 3D culture systems in vitro.</a> The International Journal of Developmental Biology. 50 (7), 645-652 (2006).</li>
<li>Cameron, K., Travers, P., Chander, C., Buckland, T., Campion, C., Noble, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+osteogenic+differentiation+of+human+mesenchymal+stem%2Fprecursor+cells+on+silicate+substituted+calcium+phosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+A%22%5BJournal%5D)">Directed osteogenic differentiation of human mesenchymal stem/precursor cells on silicate substituted calcium phosphate.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 101 (1), 13-22 (2013).</li>
<li>Pernagallo, S., Unciti-Broceta, A., Diaz-Mochon, J. J., Bradley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+cellular+morphology+and+biocompatibility+using+polymer+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Materials%22%5BJournal%5D)">Deciphering cellular morphology and biocompatibility using polymer microarrays.</a> Biomedical Materials. 3 (3), 034112(2008).</li>
<li>Li, Z., Guo, X., Matsushita, S., Guan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+cardiosphere-derived+cells+into+a+mature+cardiac+lineage+using+biodegradable+poly%28N-isopropylacrylamide%29+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Differentiation of cardiosphere-derived cells into a mature cardiac lineage using biodegradable poly(N-isopropylacrylamide) hydrogels.</a> Biomaterials. 32 (12), 3220-3232 (2011).</li>
<li>Tare, R. S., Khan, F., Tourniaire, G., Morgan, S. M., Bradley, M., Oreffo, R. O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microarray+approach+to+the+identification+of+polyurethanes+for+the+isolation+of+human+skeletal+progenitor+cells+and+augmentation+of+skeletal+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A microarray approach to the identification of polyurethanes for the isolation of human skeletal progenitor cells and augmentation of skeletal cell growth.</a> Biomaterials. 30 (6), 1045-1055 (2009).</li>
<li>Khan, F., Tare, R. S., Kanczler, J. M., Oreffo, R. O. C., Bradley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+cell+manipulation+and+skeletal+tissue+engineering+using+high-throughput+polymer+blend+formulation+and+microarray+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Strategies for cell manipulation and skeletal tissue engineering using high-throughput polymer blend formulation and microarray techniques.</a> Biomaterials. 31 (8), 2216-2228 (2010).</li>
<li>Zhang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+thermoresponsive+and+chemically+defined+hydrogel+for+long-term+culture+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A thermoresponsive and chemically defined hydrogel for long-term culture of human embryonic stem cells.</a> Nature Communications. 4 (1335), (2013).</li>
<li>Medine, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+high-fidelity+hepatotoxicity+models+from+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Developing high-fidelity hepatotoxicity models from pluripotent stem cells.</a> Stem Cells Translational Medicine. 2 (7), 505-509 (2013).</li>
<li>Hay, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+screening+of+polymer+libraries+to+define+novel+substrates+for+functional+hepatocytes+with+inducible+drug+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Unbiased screening of polymer libraries to define novel substrates for functional hepatocytes with inducible drug metabolism.</a> Stem Cell Research. 6 (2), 92-102 (2011).</li>
<li>Lucendo-Villarin, B., Khan, F., Pernagallo, S., Bradley, M., Iredale, J. P., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintaining+hepatic+stem+cell+gene+expression+on+biological+and+synthetic+substrata%5BTitle%5D)+AND+%22BioResearch+Open+Access%22%5BJournal%5D)">Maintaining hepatic stem cell gene expression on biological and synthetic substrata.</a> BioResearch Open Access. 1 (1), 50-53 (2012).</li>
<li>Hay, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+differentiation+of+hESCs+to+functional+hepatic+endoderm+requires+ActivinA+and+Wnt3a+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Highly efficient differentiation of hESCs to functional hepatic endoderm requires ActivinA and Wnt3a signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (34), 12301-12306 (2008).</li>
<li>Szkolnicka, D., Zhou, W., Lucendo-Villarin, B., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+Stem+Cell%E2%80%93Derived+Hepatocytes%3A+Potential+and+Challenges+in+Pharmacology%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pharmecol+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Pluripotent Stem Cell–Derived Hepatocytes: Potential and Challenges in Pharmacology.</a> Annu Rev Pharmecol Toxicol. 53, 147-149 (2013).</li>
<li>Szkolnicka, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+prediction+of+drug-induced+liver+injury+using+stem+cell-derived+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Accurate prediction of drug-induced liver injury using stem cell-derived populations.</a> Stem Cells Translational Medicine. 3 (2), 141-148 (2014).</li>
<li>Medine, C. N., Lucendo-Villarin, B., Zhou, W., West, C. C., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+Generation+of+Hepatocyte-like+Cells+from+Human+Embryonic+Stem+Cell+Populations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations.</a> Journal of Visualized Experiments. (56), (2011).</li>
<li>Freed, L. E., Vunjak-Novakovic, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+organized+cell+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Culture of organized cell communities.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 33 (1-2), 15-30 (1998).</li>
<li>Braam, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+Vitronectin+Is+a+Functionally+Defined+Substrate+That+Supports+Human+Embryonic+Stem+Cell+Self-Renewal+via+%CE%B1V%CE%B25+Integrin%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Recombinant Vitronectin Is a Functionally Defined Substrate That Supports Human Embryonic Stem Cell Self-Renewal via αVβ5 Integrin.</a> Stem Cells. 26 (9), 2257-2265 (2008).</li>
<li>Rodin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+culturing+of+human+embryonic+stem+cells+on+laminin-521%2FE-cadherin+matrix+in+defined+and+xeno-free+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment.</a> Nature Communications. 5 (3195), (2014).</li>
<li>Thaburet, J. -F. O., Mizomoto, H., Bradley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput+Evaluation+of+the+Wettability+of+Polymer+Libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecular+Rapid+Communication%22%5BJournal%5D)">High-Throughput Evaluation of the Wettability of Polymer Libraries.</a> Macromolecular Rapid Communication. 25 (1), 336-370 (2003).</li>
<li>Lim, J. Y., Donahue, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Sensing+and+Response+to+Micro-+and+Nanostructured+Surfaces+Produced+by+Chemical+and+Topographic+Patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Cell Sensing and Response to Micro- and Nanostructured Surfaces Produced by Chemical and Topographic Patterning.</a> Tissue Engineering. 13 (8), 1879-1891 (2007).</li>
<li>Teixeira, A. I., Abrams, G. A., Bertics, P. J., Murphy, C. J., Nealey, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+contact+guidance+on+well-defined+micro-+and+nanostructured+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Epithelial contact guidance on well-defined micro- and nanostructured substrates.</a> Journal of Cell Science. 116 (10), 1881-1892 (2003).</li>
<li>Biggs, M. J. P., Richards, R. G., Wilkinson, C. D. W., Dalby, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+adhesion+interactions+with+topographical+structures%3A+a+novel+method+for+immuno-SEM+labelling+of+focal+adhesions+in+S-phase+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Focal adhesion interactions with topographical structures: a novel method for immuno-SEM labelling of focal adhesions in S-phase cells.</a> Journal of Microscopy. 231 (1), 28-37 (2008).</li>
<li>Karuri, N. W., Porri, T. J., Albrecht, R. M., Murphy, C. J., Nealey, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nano-+and+microscale+holes+modulate+cell-substrate+adhesion%2C+cytoskeletal+organization%2C+and+-beta1+integrin+localization+in+SV40+human+corneal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Nanobioscience%22%5BJournal%5D)">Nano- and microscale holes modulate cell-substrate adhesion, cytoskeletal organization, and -beta1 integrin localization in SV40 human corneal epithelial cells.</a> IEEE Transactions on Nanobioscience. 5 (4), 273-280 (2006).</li>
<li>Hamilton, D. W., Brunette, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+substratum+topography+on+osteoblast+adhesion+mediated+signal+transduction+and+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The effect of substratum topography on osteoblast adhesion mediated signal transduction and phosphorylation.</a> Biomaterials. 28 (1), 1806-1819 (2007).</li>
<li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+elasticity+directs+stem+cell+lineage+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.</a> Cell. 126 (4), 677-689 (2006).</li>
<li>Dang, J. M., Leong, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myogenic+Induction+of+Aligned+Mesenchymal+Stem+Cell+Sheets+by+Culture+on+Thermally+Responsive+Electrospun+Nanofibers%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Myogenic Induction of Aligned Mesenchymal Stem Cell Sheets by Culture on Thermally Responsive Electrospun Nanofibers.</a> Advanced Materials. 19 (19), 2775-2779 (2007).</li>
<li>Azevedo, E. C., Nascimento, E. M., Chierice, G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UV+and+gamma+irradiation+effects+on+surface+properties+of+polyurethane+derivate+from+castor+oil%5BTitle%5D)+AND+%22Pol%C3%ADmeros%22%5BJournal%5D)">UV and gamma irradiation effects on surface properties of polyurethane derivate from castor oil.</a> Polímeros. 23 (3), 305-311 (2013).</li>
<li>Rosu, L., Cascaval, C. N., Ciobanu, C., Rosu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+UV+radiation+on+the+semi-interpenetrating+polymer+networks+based+on+polyurethane+and+epoxy+maleate+of+bisphenol+A%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Photochemistry+and+Photobilogy+A%3A+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Effect of UV radiation on the semi-interpenetrating polymer networks based on polyurethane and epoxy maleate of bisphenol A.</a> Journal of Photochemistry and Photobilogy A: Chemistry. 169 (2), 177-185 (2005).</li>
<li>Yang, X. F., Tallman, D. E., Bierwagen, G. P., Croll, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blistering+and+degradation+of+polyurethane+coatings+under+different+accelerated+weathering+tests%5BTitle%5D)+AND+%22Polymer+Degradation+and+Stability%22%5BJournal%5D)">Blistering and degradation of polyurethane coatings under different accelerated weathering tests.</a> Polymer Degradation and Stability. 77 (1), 103-109 (2002).</li>
</ol>

DCH is CSO, directeur, oprichter en aandeelhouder van FibromEd Products Ltd MB en GPI zijn oprichter aandeelhouders in FibromEd Products Ltd

Vele huidige methoden voor hepatocyten uit stamcellen genereren afhankelijk zonder gedefinieerde matrices van dierlijke oorsprong. Deze substraten kan kostbaar en zeer variabel zijn, beïnvloeden de celfunctie en stabiliteit, wat neerkomt op een aanzienlijke belemmering voor de toepassing. Daarom voerden we een scherm voor synthetische materiaal dat de kweek van stamcellen afgeleide hepatocyten ondersteunen. We hebben ook behoefte aan een eenvoudige polyurethaan (PU134), gevormd door polymerisatie PHNGAD, MDI en een exte...

Biologische materialen zijn op grote schaal gebruikt in het onderhoud en differentiatie van pluripotente stamcellen 1. Terwijl waardoor deze biologische substraten bevatten vaak een groot aantal ongedefinieerde componenten. Matrigel is een veelgebruikte substraat voor stamcelkweek en differentiatie. Helaas, zijn variabele samenstelling beïnvloedt celfunctie en fenotype. Hoewel een verscheidenheid van alternatieve, meer gedefinieerde biologische matrices zijn gebruikt 2-7, hun dierlijke oorsprong of slechte schaalbaarheid maakt ze ongeschikt kandidaten voor industriële productie. Daarom is de identificatie van synthetische alternatieven, met gedefinieerde samenstelling en betrouwbare prestaties, zijn belangrijke doelen in het stamcelonderzoek. In een poging om de beperkingen van gedefinieerde celkweek substraten overwinnen, hebben interdisciplinaire samenwerking tussen chemie en biologie synthetische materialen die met de capaciteit om celfenotype ondersteunen. SyntheTIC substraten zijn schaalbaar, kosteneffectief, en kan worden vervaardigd tot complexe 3D-structuren, het nabootsen van de in vivo omgeving. Door deze eigenschappen synthetische substraten zijn op grote schaal gebruikt ter ondersteuning en differentiatie van veel celtypen 8-10 drijven. Geavanceerde en high throughput assays hebben vergemakkelijkt de snelle screening van synthetische materialen, van grote bibliotheken, en geleverd nieuwe materialen met flexibele eigenschappen met brede toepassingen in het biomedisch onderzoek en ontwikkeling 11-13. Met behulp hoge throughput, polymeer micro-array technologie screening, heel snel geïdentificeerd een eenvoudige polyurethaan (PU134), geschikt onderhoud van humane stamcellen afgeleide hepatocyten. Dit polymeer bleek superieur aan dierlijke substraten met betrekking tot hepatocyt differentiatie en functie 14-16. We hebben vervolgens geoptimaliseerd de coating voorwaarden, topografie en sterilisatieproces voor toegang tot effectenpolymeer prestaties in het stabiliseren hepatocytfunctie en levensduur. Dit heeft belangrijke implicaties met betrekking tot het begrijpen van de fundamentals van de levercel biologie voor cel-gebaseerde modellering en regeneratieve geneeskunde toepassingen. De techniek die hier beschreven is een voorbeeld van hoe het oppervlak van een synthetisch polymeer kan worden geoptimaliseerd fenotype behouden. Wij geloven dat de combinatie van deze technologie met een efficiënte serumvrij hepatocyte differentiatie protocol heeft de potentie om een schaalbare productie van hepatocyten voor gebruik in in vitro modellen en regeneratieve medicijnen bieden.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Synthesis, preparation, coating and characterization of polymer PU134 coated coverslips</td></tr><tr><td>Shaker</td><td>Edmun B&uuml;hler</td><td>KS-15</td><td></td></tr><tr><td>Irradiator</td><td>CIS Biointernational</td><td>IBL 637&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Spin coater</td><td>Specialty Coating System</td><td>P-6708</td><td></td></tr><tr><td>Scanning Electron Microscope&nbsp;</td><td>Philips</td><td>XL30CPSEM</td><td></td></tr><tr><td>Atomic Force Microscope</td><td>DimensionV Nanoscope, VEECO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>p4-GLO CYP3A4</td><td>Promega</td><td>V8902</td><td></td></tr><tr><td>UV bulb</td><td>ESCO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoScope analysis software</td><td>VEECO</td><td></td><td>version 1.20</td></tr><tr><td>Fluorescence microscope</td><td>Olympus</td><td>TH45200</td><td>Gebruik Volocity 4 Software</td></tr><tr><td>Tissue culture plates</td><td>Corning, UK&nbsp;</td><td>3527</td><td></td></tr><tr><td>glass slides</td><td>Scientific Laboratory Supplies</td><td>MIC3308</td><td></td></tr><tr><td>Diethylene glycol</td><td>Sigma&ndash;Aldrich</td><td>93171</td><td></td></tr><tr><td>1,6-hexanediol</td><td>Sigma&ndash;Aldrich</td><td>240117</td><td></td></tr><tr><td>Neopentyl glycol</td><td>Sigma&ndash;Aldrich</td><td>408255</td><td></td></tr><tr><td>Adipic acid</td><td>Sigma&ndash;Aldrich</td><td>9582</td><td></td></tr><tr><td>anhydrous N,N-Dimethylformamide</td><td>Sigma&ndash;Aldrich</td><td>227056</td><td></td></tr><tr><td>Diethyl ether</td><td>Sigma&ndash;Aldrich</td><td>676845</td><td></td></tr><tr><td>titanium (IV) butoxide&nbsp;</td><td>Sigma&ndash;Aldrich</td><td>244112</td><td></td></tr><tr><td>1,4-butanediol&nbsp;</td><td>Sigma&ndash;Aldrich</td><td>493732</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum oven</td><td>Thermoscientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4,4&rsquo;-Methylenebis(phenyl isocyanate)</td><td>Sigma&ndash;Aldrich</td><td>101688</td><td></td></tr><tr><td>Tetrahydrofurane</td><td>Sigma&ndash;Aldrich</td><td>401757</td><td></td></tr><tr><td>Sputter coater</td><td>Bal-Tec SCD 050</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Immunostainering</td></tr><tr><td>Phosphate buffer saline (-MgCl2, -CaCl2)</td><td>Gibco</td><td>10010031</td><td>Bewaar bij kamertemperatuur</td></tr><tr><td>PBST, PBS gemaakt met 0,1% TWEEN 20&nbsp;</td><td>&nbsp; Scientific Laboratory Supplies Ltd</td><td>EC607&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>&nbsp; Scientific Laboratory Supplies Ltd</td><td>CHE5010</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma-Aldrich, UK</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>MOWIOL 488 DAPI</td><td>Calbiochem</td><td>475904</td><td>Gemaakt in Tris HCl en glycerol volgens de instructies van de fabrikant</td></tr><tr><td colspan="4">Celcultuur en functionele test</td></tr><tr><td>CYP3A activiteit pGLO kit</td><td>Promega</td><td>V8902</td><td></td></tr><tr><td>Hepatozyme</td><td>Gibco</td><td>17705021</td><td></td></tr><tr><td>TryLE express</td><td>Life Technologies</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/12604013">12604013</a></td><td></td></tr></tbody></table>

stabiliserende hepatocellulaire fenotype behulp geoptimaliseerd synthetic surfaces

Stabilizing Hepatocellular Phenotype Using Optimized Synthetic Surfaces

Momenteel is een van de belangrijkste beperkingen in de celbiologie het handhaven van een gedifferentieerd celfenotype. Biologische matrixen worden vaak gebruikt voor het kweken en onderhouden van primaire en pluripotente stamcel-afgeleide hepatocyten. Hoewel biologische matrixen nuttig zijn, staan ze slechts kortdurende cultuur van hepatocyten toe, wat hun brede toepassing beperkt. We hebben geprobeerd de beperkingen te overwinnen door gebruik te maken van een synthetische polymeercoating. Polymeren vertegenwoordigen een van de breedste klassen van biomaterialen en bezitten een breed scala aan mechanische, fysische en chemische eigenschappen, die kunnen worden afgestemd op het doel. Belangrijk is dat dergelijke materialen kunnen worden opgeschaald naar kwaliteitsborgingsnormen en batch-tot-batch consistentie vertonen. Dit is essentieel als cellen moeten worden uitgebreid voor high-throughput screening in de farmaceutische testindustrie of voor cel-gebaseerde therapie. Polyurethaan (PU) is een groep materialen die veelbelovend zijn gebleken in celcultuur. Onze recente vooruitgang in het optimaliseren van een polyurethaan gecoat oppervlak, voor langdurige cultuur van humane hepatocyten die een stabiel fenotype vertonen, wordt gepresenteerd en besproken.

Polymer oplosmiddel beïnvloedt de topografie van het oppervlak polymeer beklede Polyurethaan 134 werd opgelost in chloroform, alleen of in combinatie met tolueen of tetrahydrofuran of dichloormethaan en de glasplaatjes roterend bedekken met de verschillende formuleringen. Scanning elektronenmicroscopie (SEM) en atomic force microscopie (AFM) werden gebruikt om kenmerken de fysische eigenschappen van het polymeer coatings (figuur 1). De verkregen middels tolu...

Dit artikel zal zich richten op het ontwikkelen van polymeer gecoate oppervlakken voor de lange termijn, stabiele cultuur van stamcellen verkregen menselijke levercellen.

Stabiliserende Hepatocellulaire Fenotype behulp Geoptimaliseerd Synthetic Surfaces

Currently, one of the major limitations in cell biology is maintaining differentiated cell phenotype. Biological matrices are commonly used for culturing ...

Het algemene doel van deze procedure is het optimaliseren van polymeergecoate oppervlakken om de langdurige stabiele kweek van uit stamcellen afgeleide humane hepatocyten te behouden. Dit wordt bereikt door eerst polyurethaan 1 3 4 of PU 1 3 4 te synthetiseren. De tweede stap is het kiezen van het juiste oplosmiddel om PU 1 34 op te lossen.Vervolgens wordt het spin-coatingproces met de PU 1 3 4 op het glazen dekglas geoptimaliseerd. De laatste stap is de optimalisatie van de sterilisatieprocedure van de met polymeer P 1 34 gecoate glazen dekglazen; tenslotte worden scanning-elektronenmicroscopie, atoomkrachtmicroscopie en assays voor het medicijnmetabolisme gebruikt om de invloed van de PU 1 34 polymeercoating op de functie van uit stamcellen afgeleide hepatocyten aan te tonen.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals het gebruik van matrices in culturen voor het behoud van URI-potente stamcellen die hepatocyten bevatten, is dat deze synthetische materialen nauwkeurig kunnen worden afgestemd op het doel en op schaal kunnen worden geproduceerd volgens kwaliteitsgegarandeerde normen. Bovendien vertonen ze een consistente batch-to-batch re

stabilizing-hepatocellular-phenotype-using-optimized-synthetic

Research

JoVE Journal

Chemistry

Scheikunde

Dit artikel zal zich richten op het genereren van humane lever endoderm van menselijke embryonale stamcellen populaties.

Robuuste Generatie van hepatocyt-achtige cellen uit menselijke embryonale stamcellen Populaties

Er wordt een techniek beschreven om menselijke hepatocyten en niet-parenchymale levercellen van dezelfde donor te isoleren. De verschillende leverceltypen vormen de basis voor functionele levermodellen en weefselengineering. Deze nieuwe methode streeft ernaar om levercellen met een hoge opbrengst en levensvatbaarheid te isoleren.

Protocol voor isolatie van primaire menselijke hepatocyten en Overeenkomstige Major Populaties van niet-parenchymale Liver Cells

De hier gepresenteerde methode beschrijft een schaalbaar en Good Manufacturing Practice (GMP) -ready differentiatie systeem om menselijke hepatocyt-achtige cellen uit pluripotente stamcellen te genereren. Het dient als een kosteneffectief en gestandaardiseerd systeem menselijke hepatocyt-achtige cellen voor fundamenteel en toegepast onderzoek humane lever genereren.

Gedefinieerd en Scalable Generatie van hepatocyt-achtige cellen uit menselijke pluripotente stamcellen

Het hier gepresenteerde protocol beschrijft een platform voor het identificeren van kleine moleculen voor de behandeling van de leverziekte. Een stapsgewijze beschrijving wordt gepresenteerd detailing how to onderscheiden iPSCs in cellen met hepatocyte kenmerken in 96-wells-platen, en gebruiken van de cellen om te screenen op kleine moleculen met potentiële therapeutische activiteit.

Met behulp van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide Hepatocyte-achtige cellen voor drugontdekking

Dit protocol beschrijft een semi-automatische aanpak voor de productie van de hepatocyte-achtige cellen van menselijke pluripotente stamcellen in de indeling van een 96 goed plaat. Dit proces is snelle en kostenefficiënte, waardoor dat de productie van kwaliteit verzekerd batches van hepatocyte-achtige cellen voor fundamenteel en toegepast menselijke onderzoek.

Semi-automatische productie van Hepatocyte als cellen uit pluripotente stamcellen

Dit protocol beschrijft een benadering voor de productie van hepatosferen van menselijke pluripotente stamcellen met behulp van een gedefinieerd cultuur systeem en cel zelf montage. Dit protocol is reproduceerbaar in een aantal cellijnen, kostenbesparend en maakt de productie mogelijk van stabiele menselijke hepatosferen voor biomedische toepassing.

Serum vrije productie van driedimensionale menselijke Hepatosferen uit pluripotente stamcellen

Het doel van dit artikel is om een gestandaardiseerde aanpak te bieden om menselijke hepatische voorloperdifferentiatie van pluripotente stamcellen te induceren. De ontwikkeling van deze procedure met kant-en-klare mediaformuleringen biedt de gebruiker een gemakkelijk systeem om menselijke levercellen te genereren voor biomedisch onderzoek en vertaling.

Hepatische voorloperspecificatie van pluripotente stamcellen met behulp van een gedefinieerd differentiatiesysteem

Een langdurig ex vitro 3D-organoïde kweeksysteem werd opgezet uit muizenhepatocyten. Deze organoïden kunnen worden gepasseerd en genetisch gemanipuleerd door lentivirusinfectie van shRNA / ectopische constructie, siRNA-transfectie en CRISPR-Cas9-engineering.

Vaststelling en genetische manipulatie van Murine Hepatocyte Organoïden

Hepatocyten afgeleid van pluripotente stamcellen kunnen worden gezuiverd door middel van celsortering, met behulp van een combinatie van mitochondriale en geactiveerde leukocytenceladhesiemolecuul (ALCAM, ook bekend als CD166) kleuring.

Toepassing van levende mitochondriënkleuring bij het sorteren van cellen om hepatocyten te zuiveren die zijn afgeleid van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen

Recente technische ontwikkelingen maakten de grootschalige productie mogelijk van een in vitro platform voor toepassingen op het gebied van geneesmiddelmetabolisme en toxiciteit. Een volledig menselijk 2D+ leversysteem (TV2D+) levert fysiologisch relevante resultaten met behulp van traditionele tweedimensionale kweekmethoden. Dit protocol ondersteunt eindgebruikers bij de installatie, het onderhoud en de toepassing van het systeem.

Een volledig menselijk leverkweeksysteem voor toepassingen bij de ontwikkeling van geneesmiddelen

Leer hoe je polymeren oppervlakken optimaliseert voor stabiele hepatocytenkweek met PU 1 3 4. Deze methode verbetert celhechting en metabole functie voor leveronderzoek.

Stabiliserende Hepatocellulaire Fenotype behulp Geoptimaliseerd Synthetic Surfaces

Meer video's verkennen