Stabiliserende Hepatocellulaire Fenotype behulp Geoptimaliseerd Synthetic Surfaces

Het algemene doel van deze procedure is om de met polymeren gecoate oppervlakken te optimaliseren om de langdurige stabiele kweek van stamcel-afgeleide humane hepatocyten te behouden. Dit wordt bereikt door eerst polyurethaan 1 3 4 of PU 1 3 4 te synthetiseren. De tweede stap is om het juiste oplosmiddel te kiezen om PU 1 34 te solubiliseren.

Vervolgens wordt het spin-coating proces met de PU 1 3 4 op de glazen deksel geoptimaliseerd. De laatste stap is de optimalisatie van de sterilisatieprocedure van de met polymeer P 1 34 gecoate glazen deksels, uiteindelijk gescande elektronenmicroscopie, atoomkrachtmicroscopie en drugsmetabolisme. Assays worden gebruikt om de invloed van de PU 1 34 polymeercoating op de functie van stamcel-afgeleide hepatocyten te tonen.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals het gebruik van al Metrices in cultuur bij het behoud van URI krachtige stamcellen die hepatocyten hebben, is dat deze synthetische materialen kunnen worden afgestemd op het doel en op schaal om aan kwaliteitsborgingsnormen te voldoen. Bovendien vertonen ze batch-toe-batch consistentie. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de therapie van leverziekten omdat het een voorbeeld vertegenwoordigt van hoe het oppervlak van een synthetisch polymeer kan worden geoptimaliseerd om het celfenotype te behouden.

De procedure zal worden gedemonstreerd door Dr. Jeffrey Walton, een postdoc uit mijn laboratorium. Voordat u met deze procedure begint, dient u de mono's een zes hexane dial di ethyleenglycol en neo PenTile glycol gedurende 48 uur bij 40 graden Celsius in een vacuümoven te behandelen. Om eventueel resterend water te verwijderen, voegt u 22 millimol van elk monomeer en 55 millimol dpic-zuur toe aan een tweehalsige ronde bodemkolf verbonden met een dean stark-apparaat en uitgerust met een magnetische roerbar.

Plaats vervolgens de hele assemblage onder vacuüm en verwarm het glaswerk voorzichtig gedurende zes uur op 40 graden Celsius om vochtabsorptie tijdens de toevoeging van het chemisch product aan de kolf te voorkomen. Nadat u de assemblage uit de oven hebt verwijderd en het systeem onder stikstof hebt geplaatst, voegt u 0,0055 mol van de katalysator titanium vier, maar oxide druppelsgewijs toe aan de kolf. Roer het reactiemengsel gedurende 24 uur bij 180 graden Celsius en verzamel het resterende water in de dean stark-val.

Laat het product afkoelen tot kamertemperatuur. Meng vervolgens 3,2 millimol, of één equivalent van het polyol P-H-N-G-A-G met 6,4 millimol of twee equivalenten van vier vier methyl en een bisfenol isocyanat. In 12 milliliter anhydreus DML in een tweehalsige ronde bodemkolf verbonden met een dean stark-apparaat en uitgerust met een magnetische sterbar.

Roer het reactiemengsel bij 70 graden Celsius onder een stikstofsfeer. Voeg vervolgens de katalysator titanium vier oxide druppelsgewijs toe via een spuit tot een eindconcentratie van 0,8%. Voeg na een uur één equivalent van de kettingverlenger een vier butaan dial toe om copolymeerproduct te geven. Verhoog de temperatuur tot 90 graden Celsius en honger gedurende 24 uur onder een stikstofsfeer.

Zodra het reactiemengsel tot kamertemperatuur is afgekoeld, voegt u een dal ether druppelsgewijs toe aan het reactiemengsel totdat precipitatie van het polyurethaanproduct wordt waargenomen. Na overbrenging van het reactiemengsel naar een centrifugeerbuis, centrifugeert u de oplossing gedurende vijf minuten bij 5.300 keer G. Na decanteren droogt u het supernataat af op kamertemperatuur totdat het oplosmiddel is verdampt.

Weeg vervolgens 200 milligram PU 1 34 in een glazen fles. Verdun het monster tot een eindconcentratie van 2%in chloroform of chloroform en tolueen in een een-op-een verhouding of tetra roran of een combinatie van tetra roran en chloromethaan. In een een-op-een verhouding schudt u de oplossing gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur krachtig met een schudder op een snelheid van 200 bewegingen per minuut totdat de oplossing homogeen is en er geen neerslag wordt waargenomen.

Plaats vervolgens een glazen deksel van ongeveer 15 millimeter vierkant op de spincoter. Breng 50 microliters van de PU één door vier oplossing aan op het deksel met behulp van een pipet en draai elk deksel gedurende zeven seconden bij 23 keer G. Laat het deksel vervolgens ten minste 24 uur bij kamertemperatuur drogen. Op dit punt gammstraal elk polymeer gecoat deksel door een dosis van 10 grays toe te passen met behulp van een laboratoriumradiator gedurende 12 minuten.

Alternatief kan elk polymeer gecoat deksel worden UV-geïrradieerd met behulp van een 30 watt UV-lamp gedurende 16 minuten aan elke kant. Plaats vervolgens het polymeer gecoate deksel in een geschikte weefselkweekplaat volgens de grootte van het deksel. Na het kweken en differentiëren van de humane embryonale stamcellijn, worden decellen losgemaakt met behulp van een disassociatiereagens en opnieuw geplaatst op de PU 1 34 gecoate deksels op dag negen van het differentiatieproces in aanwezigheid van serumvrij medium gescande elektronenmicroscopie.

Beelden van de verschillende gecoate glazen deksels laten zien dat de coating met tolueen of chloroform niet homogeen was, wat een ongelijkmatige coating met PE 1 34 precipitatie aantoont. In tegenstelling daarmee, tetrahedran maakte het spin-coaten van een veel uniformere oppervlakte mogelijk. Bovendien toont atoomkrachtmicroscopie-analyse van de verschillende polymeercoatings een 40%reductie in de ruwheid van P 1 34 gesolubiliseerd in tetra hydro furine in vergelijking met andere oplosmiddelen, wat een meer uniforme PU 1 34 coating aantoont. In een biologische toepassing werd hepatische endodermdifferentiatie geïnduceerd en op dag negen waren hepatoblastachtige cellen zichtbaar met de meeste cellen die cytokeratine 19 alfa feta-eiwit en hepatocyte nucleair factor alfa en lage niveaus van albumine tot expressie brachten als