Name: Het optimaliseren van Bevestiging van menselijke mesenchymale stamcellen op Poly (ε-caprolacton) elektrogesponnen Yarns (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: Leer hoe je de hechting van menselijke mesenchymale stamcellen op elektrogesponnen PCL-garens optimaliseert met DNA-assays en SEM. Deze methode verbetert de initiële celhechting in weefselengineeringonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs willen graag bedanken en erkennen de Medical Research Council voor de financiering van dit onderzoek - MRC-FAP subsidie ​​code G1000788-98812.

1.Scaffold Fabrication en Sterilisatie <ol><li> Los PCL in 1,1,1,3,3,3-hexafluorisopropanol tot 10% w / v concentratie geven. Zoals beschreven Bosworth et al, 9 electrospin de polymeeroplossing (parameters: 20 kV, 1 ml / uur, 20 cm). En verzamelen uitgelijnd vezels aan de rand van een roterende doorn (600 rpm). Met een scalpel verwijder het lint van de verzamelde vezels en snijd in kortere lengtes - 3 cm (voor troggen en roterende vaten) en 4 cm (voor celkweek inserts) lengtes. </li><li> Met behulp van fijne tang onderdompelen individuele strips in gedestilleerd water en verwijder. </li><li> Houd beide uiteinden tussen duim en wijsvinger; handmatig draai de strip totdat het lijkt op draad. </li><li> Kort onderdompelen deze thread-achtige steiger in gedestilleerd water en leg op een schone, niet-vezelige kaart te drogen. </li><li> Eenmaal droog, plaats individueel in schone microcentrifugebuisjes en voeg 1 ml 50% v / v ethanol in gedestilleerd water. Sluit het deksel en laat gedurende 24 uur. Opmerking: Voer de volgende stappen onder laminaire stroming: </li><li> Plaats microcentrifuge buizen in een laminaire stroming kast en zuig 50% v / v oplossing. Te vervangen door 1 ml 70% v / v ethanol in gedestilleerd water, dicht deksels en laat gedurende 24 uur. </li><li> Herhaal 90% en 100% v / v ethanol in gedestilleerd water (1 ml volumes). </li><li> Wassen steigers tweemaal met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), 24 uur per wasbeurt (2 x 1 ml). </li><li> Verwijder PBS en te vervangen door 1 ml celkweek media. Opmerking: Steigers zijn klaar voor gebruik na 24 uur. </li></ol> 2. Het bepalen van Steiger Oppervlakte en Aantal Cellen <ol><li> Met behulp van een lichtmicroscoop en imaging software meet de diameter van de electrospun draad langs zijn lengte om een ​​gemiddelde waarde te bepalen. </li><li> Stel dat de garen een cilindrische staaf en benaderen de oppervlakte met: </li><li> Waarbij A = Oppervlakte, r = radius en h = lengte Opmerking: Het oppervlak werd berekend op 18.902800 pm2. Voorts zij opgemerkt dat het werkelijke oppervlak groter zal zijn dan deze berekening als het garen bestaat uit honderden fijne vezels, die het oppervlak toenemen. Dientengevolge een groter aantal cellen moet kunnen hechten aan het schavot. Echter, dit heeft geen invloed op een directe vergelijking tussen de testgroepen worden gemaakt. </li><li> Bepaal het maximum aantal cellen dat kan hechten aan de steiger blootgestelde oppervlak door: Opmerking: Met behulp van een lichtmicroscoop en imaging software, de diameter van menselijke mesenchymale stamcellen werd bepaald op 20 pm (uitgaande cellen zijn rond), dus in casu aantal cellen = 60.200. </li></ol> 3. Steiger Set-up - Cell Culture Inserts (figuur 1A) <ol><li> Onder laminaire stroming, open de steriele 6-well celkweek inserts en scheiden de kortere ringen met de tanden van de bredere geringd lichamen. </li><li> Neem de ring met de tanden naar boven gericht. Draperen éénvan 4 cm scaffolds boven het midden van de ring en zorg ervoor dat overlapt aan beide zijden. Neem de geringde lichaam en positie boven de getande ring en steiger en naar beneden drukken zorg ervoor dat de steiger blijftstaan ​​en ligt door het midden van de celkweek insert. </li><li> Plaats de celkweek insert met steiger in de put van een 6-well, lage bindende plaat. </li><li> Voeg 10 ml van de cultuur media naar het schavot. </li></ol> 4. Steiger Set-up - Trough (Figuur 1B) <ol><li> Onder laminaire stroming, plaats poly (tetrafluorethyleen) (PTFE) troggen in afzonderlijke petrischaaltjes en voeg 10 ml van de cultuur media om de trog. </li><li> Met behulp van een tang draperen één van de 3 cm steigers in de drinkbak, en zorg ervoor zijn lengte ligt parallel aan de trog&#39;s langer rand. </li></ol> 5. Steiger Set-up - bioreactorvat (figuur 1C) <ol><li> Onder laminaire stroming, afzien 10 ml steriele PBS door de bioreactorvat&#39;sbelangrijkste haven en laat 10 min. </li><li> Verwijder de PBS en te vervangen door 8 ml kweekmedium. </li><li> Met behulp van een tang, plaatst u één van de 3 cm steigers in het vat via de grote poort. </li><li> Sluit de belangrijkste haven uit. </li></ol> 6. Celtelling <ol><li> Cultuur menselijke mesenchymale stamcellen (hMSC) verkregen uit beenmerg volgens de fabrikant protocol tot passage 4 voor het oogsten. </li><li> Zuig het materiaal uit een 75 cm 2 kolf met hMSCs afkomstig uit beenmerg (doorgang 4, 80% samenvloeiing). </li><li> Was de cellen met 10 ml steriele PBS en zuig. </li><li> Voeg 3 ml trypsine en incubeer de kolf bij 37 ° C, 5% CO2 totdat de cellen losgemaakt van de fles oppervlak. </li><li> 7 ml kweekmedium om het enzym te inactiveren en breng dit totale volume (10 ml) om een ​​centrifugebuis. </li><li> Resuspendeer deze celsuspensie door en neer te pipetteren meerdere malen homogeen dispergeren cellen in hetmateriaal en de cel agglomeraten (10 ml pipet). </li><li> Verwijder 20 ul van celsuspensie en transfer naar een haemocytometer. </li><li> Plaats de haemocytometer onder een lichtmicroscoop en imago op x10 doelstelling. </li><li> Focus de rasterlijnen en tel het aantal cellen in de 4 x 4 pleinen in elke hoek van het net en die binnen de vierkante vallen en degenen die de rechterhand of onderste grenslijn oversteken. Tellen voor elke set van 4 x 4 vierkantjes (4 tellen per grid). </li><li> Herhaal de resuspensie en celgetal drie keer (stappen 6,6-6,9). </li><li> Bereken het gemiddelde celgetal en het bepalen van het volume van de media nodig voor cel resuspensie (cel concentratie 60.200 in 200 pi). Zo bepalen de gemiddelde celtelling van de hemocytometer en bepalen de totale gemiddelde aantal cellen uit de drie afzonderlijke tellingen. Vermenigvuldig dit met 1 x 10 4 tot aantal cellen per ml en vervolgens vermenigvuldigen geven door het totale volume celsuspensie te gevenTal aantal cellen. Gebruik de volgende vergelijking om het volume van dragers die voor resuspensie bepalen: </li><li> Centrifugeer de celsuspensie bij 241 xg gedurende 5 minuten. </li></ol> 7. Cell Zaaien <ol><li> Zuig het materiaal uit de gecentrifugeerd buis verlaten van de cel pellet en te vervangen door de berekende media volume. </li><li> Resuspendeer de cellen en media voor een nog mengen. </li><li> Met behulp van een P200 Gilson pipet langzaam afgeven 200 ui celsuspensie op elke steiger door uitvoering van de punt van de pipet langs de steiger lengte en onder de media vloeistofoppervlak. Laat staan ​​voor 20 min. </li><li> Voor bioreactor schepen, afzien 200 ul celsuspensie door de belangrijkste haven. Hoogst de resterende 2 ml kweekmedium via de injectiespuit poorten tot een totaal volume van 10 ml. </li></ol> 8. Experimentele Start <ol><li> De bioreactor schepen over te dragen aan de RCC-4DQ bioreactor en ingesteld om te draaien op 9 rpm. </li><li> TranSfer de well platen met celkweek inserts en drinkbakken, om de shaker plaat en ingesteld om te draaien bij 30 rpm. </li><li> Breng de well platen met celkweek inserts en dalen op de plank van een cel incubator ingesteld op 37 ° C, 5% CO2 (statische kweek). </li></ol> 9. DNA-test <ol><li> Bereid oplossingen - lysebuffer, 1x TE-buffer, DNA-normen en cel-DNA werkende oplossing - volgens de instructies van de fabrikant. </li><li> Na 4 uur, verwijder de monsters uit de incubator en plaats onder laminaire stroming. </li><li> Verwijder de media fracties van alle monsters en plaatsen in afzonderlijk gekenmerkt centrifuge buizen. Centrifugeer de buizen 241 xg. Verwijder het supernatant en voeg 3 ml lysis buffer. Resuspendeer de oplossing kunnen breken de cel pellet. </li><li> Behulp van een tang verwijder de steigers en plaats in centrifuge buizen met 3 ml lysis buffer (voor de steigers in de bioreactor schepen, verwijder het schavot voor het opzuigen van het media). Voor steigers gehouden binnen celkweek inserts, eerst bevrijden van de steiger door het snijden van de steiger dicht bij de rand van het inzetstuk met behulp van een scalpel. </li><li> Voeg 3 ml lysis buffer aan elke steiger bakje en schraap het oppervlak (krachtig bewegen voor de bioreactor schepen). Verwijder de lysis buffer en plaats die afzonderlijk gekenmerkt centrifugebuizen. </li><li> Vortex elke centrifugebuis gedurende ongeveer 1 minuut voldoende roeren van de cellen te waarborgen en buffer en lysis van de celmembraan te bevorderen. </li><li> In een zwarte plaat met 96 putjes, 100 ul lysisbuffer per monster fractie - steiger, media en goed (dupliceren). </li><li> In het donker, voeg 100 ul-DNA-oplossing aan alle putjes met lysis buffer en meng voorzichtig. </li><li> Inclusief putjes met lysisbuffer die geen DNA en cel-DNA oplossing voor een negatieve en positieve controles voor zowel plate. </li><li> Met behulp van een fluorescentie-plaat-reader, meet de absorptie van het goeds met 485 nm excitatie en 520 nm emissie. </li><li> Vergelijk de gegevens met de standaardcurve gegenereerd uit de DNA normen volgens de instructies van de fabrikant. </li></ol> 10. Scanning Electron Microscope (SEM) Fixatie <ol><li> Voer de volgende stappen onder laminaire stroming: Na 4 uur, verwijder alle steigers uit hun tanks en plaats in een nieuwe 6-well plaat (aparte putten). </li><li> Was de steigers tweemaal met PBS. </li><li> Voer de volgende stappen op de open bank: Aan elk putje, voeg 2 ml van 1,5% v / v glutaaraldehyde in PBS om volledige dekking van het schavot te garanderen. </li><li> Laat de plaat gedurende minimaal 30 minuten bij 4 ° C voor mobiele fixatie. </li><li> Verwijder de fixeeroplossing en was de steigers tweemaal met PBS. </li><li> Dehydrateer de steigers met toenemende concentraties ethanol in gedestilleerd water beginnend met 50% v / v, gevolgd door 70% v / v en 90% v / v. Voor elke concentratie, volledig onderdompelen de steigers in solution (2 ml) en laat gedurende 3 min. Gooi de oplossing en herhaal. </li><li> Dehydrateer 100% ethanol volledig onderdompelen de steigers in oplossing (2 ml) en vertrekken voor 5 min. Gooi de oplossing en herhaal. </li><li> Chemisch droog de steigers met behulp hexamethyldisilazan (HMDS) binnen een zuurkast. Dompel de steigers in HMDS (2 ml) en laat gedurende 5 min. Verwijder de HMDS en herhaal. </li><li> Verwijder de HMDS en laat de steigers drogen. Monteer de steigers op commercieel beschikbare SEM stubs (in dit geval roestvrijstalen stubs met lijm koolstof tabs). </li><li> Te verlichten bekijken binnen de SEM, de vacht van de monsters met behulp van een gouden-sputter coater gedurende 2 minuten om te zorgen voor een dunne en gelijkmatige dekking. </li><li> Leg monsters binnen de SEM en visualiseren van de cel-geplaatste steigers met behulp van een 5 keV elektronenbundel. </li></ol>

<ol><li>Jauregui, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+adhesion+to+biomaterials.+The+role+of+several+extracellular+matrix+components+in+the+attachment+of+non-transformed+fibroblasts+and+parenchymal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ASAIO+transactions%2FAmerican+Society+for+Artificial+Internal+Organs%22%5BJournal%5D)">Cell adhesion to biomaterials. The role of several extracellular matrix components in the attachment of non-transformed fibroblasts and parenchymal cells.</a> ASAIO transactions/American Society for Artificial Internal Organs. 33 (2), 66-74 (1986).</li>
<li>Puca, A., Russo, G., Giordano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+Mechano-Transduction+via+Simulated+Microgravity+and+its+Effects+on+Intracellular+Trafficking+of+VEGFR%27s%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Properties of Mechano-Transduction via Simulated Microgravity and its Effects on Intracellular Trafficking of VEGFR's.</a> Oncotarget. 3 (4), 426(2012).</li>
<li>Vincent, L., Avancena, P., Cheng, J., Rafii, S., Rabbany, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simulated+microgravity+impairs+leukemic+cell+survival+through+altering+VEGFR-2%2FVEGF-A+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+biomedical+engineering%22%5BJournal%5D)">Simulated microgravity impairs leukemic cell survival through altering VEGFR-2/VEGF-A signaling pathway.</a> Annals of biomedical engineering. 33 (10), 1405-1410 (2005).</li>
<li>Rungarunlert, S., Klincumhom, N., Tharasanit, T., Techakumphu, M., Pirity, M. K., Dinnyes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slow+Turning+Lateral+Vessel+Bioreactor+Improves+Embryoid+Body+Formation+and+Cardiogenic+Differentiation+of+Mouse+Embryonic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Reprogramming%22%5BJournal%5D)">Slow Turning Lateral Vessel Bioreactor Improves Embryoid Body Formation and Cardiogenic Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells.</a> Cellular Reprogramming. 15 (5), 443-458 (2013).</li>
<li>Wu, X., Li, S. H., Lou, L. M., Chen, Z. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Effect+of+the+Microgravity+Rotating+Culture+System+on+the+Chondrogenic+Differentiation+of+Bone+Marrow+Mesenchymal+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biotechnology%22%5BJournal%5D)">The Effect of the Microgravity Rotating Culture System on the Chondrogenic Differentiation of Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells.</a> Molecular biotechnology. 54 (2), 331-336 (2013).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rotating+Microgravity-Bioreactor+Cultivation+Enhances+the+Hepatic+Differentiation+of+Mouse+Embryonic+Stem+Cells+on+Biodegradable+Polymer+Scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Rotating Microgravity-Bioreactor Cultivation Enhances the Hepatic Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells on Biodegradable Polymer Scaffolds.</a> Tissue Engineering Part A. 18 (21-22), 2376-2385 (2012).</li>
<li>Lv, Q., Deng, M., Ulery, B. D., Nair, L. S., Laurencin, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nano-ceramic+Composite+Scaffolds+for+Bioreactor-based+Bone+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Orthopaedics+and+Related+Research%22%5BJournal%5D)">Nano-ceramic Composite Scaffolds for Bioreactor-based Bone Engineering.</a> Clinical Orthopaedics and Related Research. 471 (8), 2422-2433 (2013).</li>
<li>Hammond, T. G., Hammond, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+suspension+culture%3A+the+rotating-wall+vessel%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Optimized suspension culture: the rotating-wall vessel.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 281 (1), F12-F25 (2001).</li>
<li>Bosworth, L. A., Alam, N., Wong, J. K., Downes, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+2D+and+3D+electrospun+scaffolds+intended+for+tendon+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Science%3A+Materials+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Investigation of 2D and 3D electrospun scaffolds intended for tendon repair.</a> Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 24 (6), 1605-1614 (2011).</li>
<li>Dormer, N. H., Qiu, Y., Lydick, A. M., Allen, N. D., Mohan, N., Berkland, C. J., Detamore, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteogenic+differentiation+of+human+bone+marrow+stromal+cells+in+hydroxyapatite-loaded+microsphere-based+scaffolds.%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Osteogenic differentiation of human bone marrow stromal cells in hydroxyapatite-loaded microsphere-based scaffolds.</a> Tissue Engineering Part A. 18 (7-8), 757-767 (2011).</li>
<li>Rayatpisheh, S., Heath, D. E., Shakouri, A., Rujitanaroj, P. O., Chew, S. Y., Chan-Park, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+cell+sheet+technology+and+electrospun+scaffolding+for+engineered+tubular%2C+aligned%2C+and+contractile+blood+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Combining cell sheet technology and electrospun scaffolding for engineered tubular, aligned, and contractile blood vessels.</a> Biomaterials. 35 (9), 2713-2719 (2014).</li>
<li>Wismer, N., Grad, S., Fortunato, G., Ferguson, S. J., Alini, M., Eglin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodegradable+electrospun+scaffolds+for+annulus+fibrosus+tissue+engineering%3A+effect+of+scaffold+structure+and+composition+on+annulus+fibrosus+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Biodegradable electrospun scaffolds for annulus fibrosus tissue engineering: effect of scaffold structure and composition on annulus fibrosus cells in vitro.</a> Tissue Engineering Part A. (3-4), 672-682 (2014).</li>
<li>Yavin, E., Yavin, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attachment+and+culture+of+dissociated+cells+from+rat+embryo+cerebral+hemispheres+on+polylysine-coated+surface%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Attachment and culture of dissociated cells from rat embryo cerebral hemispheres on polylysine-coated surface.</a> The Journal of cell biology. 62 (2), 540-546 (1974).</li>
<li>Chen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guan%2C+of+focal+adhesion+kinase+with+its+potential+substrate+phosphatidylinositol+3-kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Guan, of focal adhesion kinase with its potential substrate phosphatidylinositol 3-kinase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 91 (21), 10148-10152 (1994).</li>
<li>Grant, D. S., Tashiro, K. -I., Segui-Real, B., Yamada, Y., Martin, G. R., Kleinman, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+different+laminin+domains+mediate+the+differentiation+of+human+endothelial+cells+into+capillary-like+structures+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Two different laminin domains mediate the differentiation of human endothelial cells into capillary-like structures in vitro.</a> Cell. 58 (5), 933-943 (1989).</li>
<li>Carrier, R. L., Papadaki, M., Rupnick, M., Schoen, F. J., Bursac, N., Langer, R., Freed, L. E., Vunkaj-Novakovic, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+tissue+engineering%3A+cell+seeding%2C+cultivation+parameters%2C+and+tissue+construct+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+bioengineering%22%5BJournal%5D)">Cardiac tissue engineering: cell seeding, cultivation parameters, and tissue construct characterization.</a> Biotechnology and bioengineering. 64 (5), 580-589 (1999).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Electrospun glasvezel matrices vervaardigd uit biopolymeren worden regelmatig gebruikt om celaanhechting en proliferatie van biomateriaal en / of tissue engineering toepassingen 11,12 ondersteunen. In deze gevallen de matrices vaak dunne vellen van vezels die gemakkelijk de gehele bodem van een celkweek putjesplaat en dus volledig contact met gezaaide cellen die celhechting bevordert. Indien het biomateriaal steiger niet dekken de bodem van de put plaat, is er een grote kans dat een groot deel van de gezaaide cellen niet in contact met de steiger en uiteindelijk niet kunnen hechten. Deze studie onderzocht verschillende methoden zaaien cellen op scaffolds die geen betrekking hebben op de bodem van de put plaat, teneinde een geoptimaliseerde techniek die kan worden aanbevolen voor toekomstige celgebaseerde proeven bepalen. Vijf verschillende set-ups werden onderzocht (figuur 1): scaffolds (electrospun garen) gehouden met behulp van celkweek inserts binnen laag bindende well platen en ofwel onder statische omstandigheden bewaard of geschud bij 30 tpm; steigers geplaatst binnen nauwe PTFE troggen en statische gehouden of geschud bij 30 tpm; en steigers gehuisvest in bioreactor schepen te draaien op 9 rpm. Het bepalen van het aantal cellen dat door DNA test om de electrospun garens hadden gehecht toonde een laag percentage bevestiging voor alle enten setups (figuur 2); en dit werd verder bevestigd door scanning elektronen microfoto (SEM) (Figuur 3). Grootste celaanhechting - 30% of ~ 18.060 cellen -werd waargenomen voor garens die werden gehouden binnen celkweek inserts en onderworpen aan een continue beweging. Interessant laagste celhechting (15%) werd verkregen garens bezit van celkweek inserts maar onder statische omstandigheden gehouden, wat erop wijst dat de opname van radiale beweging een positief effect op het houden van cellen in contact met de steiger. Echter,zij opgemerkt dat permanente omcirkelen van de media stroom belast de cel agglomeraten waargenomen vanuit de SEM beelden kunnen zijn. De shaker plaat werd ingesteld op de laagste stand - 30 toeren - waarin een beperking aan deze set-up zou kunnen zijn. Met behulp van een langzamere radiale beweging kan helpen te voorkomen of te verminderen cel agglomeratie en kon ook het verbeteren van celaanhechting als cellen minder kracht zullen ervaren. Toekomstige experimenten moet zich richten op het optimaliseren van de ideale shaker snelheid voor een betere hechting van cellen. Integratie van ontwerpresolutie garens gehouden binnen de drinkbakken niet resulteren in een soortgelijke trend, met beide scenario&#39;s waardoor 18% attachment (~ 10.836 cellen); maar dit kan vanwege de gedeeltelijke flotatie van de steigers binnen de troggen (waargenomen voor troggen die op de klopperplaat) aangezien zij niet verankerd aan de basis. Gedeeltelijke zweven van de steiger wordt voorkomen dat cellen die gezonken naar de bodem van de trog in contact komt met het materiaal en aanhangende. Voor tzijn bijzondere opstelling werd de trog zich in een petrischaal en een totaal volume 10 ml medium toegevoegd. De kleine afmetingen van de trog betekent dat de meerderheid van de media aanwezig in het petrischaaltje als er enige beweging kunnen cellen weg van de goot drijven in het petrischaaltje blijven volledig buiten het bereik van de steiger. Om deze beperkingen te overwinnen, zouden verdere experimenten omvatten een extra stap in het protocol, waarbij de uiteinden van de steigers worden vastgemaakt aan de bodem van de goten met steriele fijne naalden, omdat dit hun flotatie en beweging (vooral belemmering voor steigers blootgesteld radiale beweging), die uiteindelijk moeten leiden tot een verhoogd aantal cellen verbonden aan de steiger. 16% van de cellen aanwezig in het roterende vaten garens waren aangebracht. Ondanks dat het een goed ingeburgerde techniek voor 3D-cultuur, heeft problemen met het verwijderen van de steigers van de belangrijkste haven van de vaartuigen, die kunnen hebben geleid tot losjes Attached cellen verloren. Schepen die volledig geopend kan worden zou dit probleem op te heffen; Deze zijn te koop, maar zijn aanzienlijk duurder dan het beschikbare schepen gebruikt in deze studie. Deze studie toont de huidige problemen met het zaaien van steigers die geen betrekking hebben op de hele onderkant van de standaard celcultuur well platen. Zaaien een bekend aantal cellen resulteerde in minder dan een derde vastmaken aan de steiger, ondanks oppervlakte van de steiger is waardoor alle cellen te hechten. Dit kan nadelige gevolgen hebben in andere cellen gebaseerde assays die de biocompatibiliteit en cel-materiaal / cel-cel gedrag en interacties met de steiger als potentiële toekomstige medische inrichting kan beoordelen. Verdere beperkingen van de studie kan de 4 hr tijdpunt zijn - ondanks dat lang genoeg is om initiële zaaien van cellen waarborgen (cellen hebben aangetoond dat stevig aan substraten binnen dertig minuten 13,14,15), kan het redelijk zijn inMaastricht onderzoek latere tijdstippen verstrekken cellen niet vermenigvuldigen gedurende een langere termijn, omdat dit anders zou scheef het startnummer cel. Vermindering van de hoeveelheid media, in dit geval 10 ml, kan ook contact tussen de cellen en steiger kan verbeteren, vergroten celhechting. Toekomstige onderzoeken moeten ook cellevensvatbaarheid beschouwen als het proces van cel enten kan celbeschadiging en / of celdood 16 veroorzaken. Cell DNA tests geen onderscheid tussen levensvatbare en niet-levensvatbare cellen als zodanig een levende / dode assay, bijvoorbeeld, zou de levensvatbaarheid kon markeren. Dit onderzoek sensibiliseert het werkelijke aantal cellen die hechten aan het schavot ondanks zaaien een bekende hoeveelheid. Voor studies die van deze uitgangspunten aantal cellen, is het zeer belangrijk dat onderzoekers precies hoeveel van deze omzet in feite zich aan het substraat van belang.

Steigers worden routinematig worden ontwikkeld en onderzocht voor biomateriaal en tissue engineering toepassingen. Als zodanig zijn zij gewoonlijk geënt met cellen en hun in vitro gedrag kenmerk via assays die celproliferatie en celaantal te bepalen, bijvoorbeeld. Voor experimenten zoals deze, is het noodzakelijk dat het aanvankelijke aantal cellen is bekend en onderzoekers stellen vaak zaaien concentratie qua aantal cellen per ml of cm2. Hoewel dit goed gebruik, vooral voor opschaling doeleinden, is het niet goed voor het werkelijke aantal cellen die hechten aan het schavot oppervlak (die ook afhankelijk is van de hechting van het biomateriaal 1). Dit geldt vooral voor steigers die niet de gehele basis van de celkweek titerplaat cellen van het construct kan vallen en, vanwege de vaak statische aard van het experiment, misschien nooit terug in contact met het materiaal van interust. Electrospun vezeldraden zijn een goed voorbeeld van een scaffold die niet bedekt de bodem van de put (Figuur 1A). In dit geval dient lage bindingsaffiniteit putjes die geen oppervlak bewerkt zijn worden gebruikt om cellen te voorkomen hechten aan het oppervlak van de plaat en daarmee het resultaat van een goed gebaseerde bepaling verstoren. Putjesplaten worden gemakkelijk gebruikt voor zaaien van cellen op steigers, maar ze zijn niet de enige methode. Roterende celkweek systemen een soort bioreactor ontwikkeld door de afdeling Life Sciences NASA eind 1980 kan eveneens worden gebruikt voor steigers zaad in een driedimensionale (3D) omgeving met gesimuleerde microzwaartekracht. Dit type bioreactor blijft een populaire keuze met onderzoekers over de hele wereld en is opgenomen in de studies voor cell signaling 2,3, stamcellen 4,5 en tissue engineering 6,7. Wat de roterende bioreactor voorkeur well platen is het onderhoudeen 3D-omgeving die helpt voorkomen gedifferentieerde cellen van dedifferentiërende, zoals vaak het geval is indien gekweekt in conventionele 2D omstandigheden 8. Deze paper onderzoekt verschillende technieken zaaien menselijke mesenchymale stamcellen op electrospun poly (ε-caprolacton) vezeldraden zoals gefabriceerd Bosworth et al., 9 om het aanvankelijke aantal cellen verbonden aan deze scaffolds binnen 4 uur periode te maximaliseren. Voor 2D-cultuur, werden garens stevig vastgehouden binnen well platen of op maat poly (tetrafluorethyleen) (PTFE) troggen en onder statische omstandigheden bewaard, of geschud bij 30 rpm. Voor 3D-cultuur, werden garens en cellen gehouden binnen bioreactor schepen draaiende op 9 rpm.

<table><tbody><tr><td>Gedestilleerde water</td><td>interne voorraad</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Merck</td><td>1117271000</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaat gebufferde zoutoplossing</td><td>Life Technologies</td><td>70013016</td><td></td></tr><tr><td>Menselijk mesenchymaal stamcel</td><td>PromoCell GmbH</td><td>C-12974</td><td></td></tr><tr><td>MSC kweekmedium</td><td>PromoCell GmbH</td><td>C-28010B</td><td>Opgewarmd tot 37 oC voor gebruik</td></tr><tr><td>Suppletiemix</td><td>PromoCell GmbH</td><td>C-39810</td><td>Toevoegen aan kweekmedium</td></tr><tr><td>Antibioticum/antimyoticummix</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5955</td><td>Toevoegen aan kweekmedium</td></tr><tr><td>Trypsine (0,05%) EDTA (0,02%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59417C</td><td>Opgewarmd tot 37 &#176;C voor gebruik</td></tr><tr><td>Celkweekflacons (T75)</td><td>Becton Dickinson Ltd</td><td>353110</td><td></td></tr><tr><td>Laag bindende 6-well platen</td><td>Costar Corning</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>6-well CellCrowns</td><td>Scaffdex</td><td>C00003S</td><td></td></tr><tr><td>Petrischaal 50 ml diep</td><td>Sterilin</td><td>124</td><td></td></tr><tr><td>PTFE gootjes</td><td>interne productie</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Vast RCCS vat 10 ml</td><td>Synthecon</td><td>D-410</td><td></td></tr><tr><td>4 Vessel Rotary Cell Culture System bioreactor</td><td>Synthecon</td><td>RCCS-4DQ</td><td></td></tr><tr><td>Schuddelaarplaat</td><td>Stuart</td><td>SSM1</td><td>Mini Orbitale Schudelaar</td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Digital Bio</td><td>DHC-F01</td><td>Vaste C-Chip</td></tr><tr><td>Centrifugebuis</td><td>Deltalab</td><td>352096, 429901</td><td>15 ml en 50 ml</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Hettich</td><td>Rotafix 32 A</td><td></td></tr><tr><td>Spuit 3 ml</td><td>Shield Medicare Ltd</td><td>3039820</td><td></td></tr><tr><td>Pipetten</td><td>Sterilin</td><td>40305, 47310, 40125</td><td>5, 10 en 25 ml</td></tr><tr><td>Gilson pipetten</td><td>SLS</td><td>F144801, F144802, F123600, F123601, F123602</td><td>P2 - P1000</td></tr><tr><td>Pipettip</td><td>SLS</td><td>PIP7852, PIP7834, PIP7840</td><td></td></tr><tr><td>Micro testbuisje 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>30125.15</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>PicoGreen Assay</td><td>Invitrogen</td><td>P7589</td><td>Assay opstelling in het donker</td></tr><tr><td>Zwarte 96-well plaat</td><td>Greiner Bio One</td><td>655086</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescente plaatlezer</td><td>BGM Labtech</td><td>FLUOstar Optima</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde 25%</td><td>TAAB Laboratories</td><td>G002</td><td>Aangemaakt tot een concentratie van 1,5% v/v in PBS</td></tr><tr><td>Hexamethyldisilazane (HMDS)</td><td>Sigma</td><td>999-97-3</td><td></td></tr><tr><td>Aluminium stubs (SEM)</td><td>Agar Scientific</td><td>G301</td><td></td></tr><tr><td>Carbon tabs (SEM)</td><td>Agar Scientific</td><td>G3347N</td><td></td></tr><tr><td>Gold sputter coater</td><td>Edwards</td><td>S150B</td><td></td></tr><tr><td>Scanning Electron Microscope (SEM)</td><td>Phenom World</td><td>Phenom Pro</td><td></td></tr></tbody></table>

het optimaliseren van bevestiging van menselijke mesenchymale stamcellen op poly (ε-caprolacton) elektrogesponnen yarns

Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on Poly(&#949;-caprolactone) Electrospun Yarns

Onderzoek naar biomaterialen en tissue engineering omvat vaak op basis van cellen in vitro onderzoeken, die een eerste kennis van het startnummer cel vereisen. Terwijl onderzoekers vaak verwijzen naar hun entdichtheid dit betekent niet noodzakelijk het werkelijke aantal cellen die zijn toegetreden tot het materiaal in kwestie. Dit is met name het geval voor de materialen, of steigers, die geen betrekking hebben op de basis van standaard celkweek well platen. Deze studie onderzoekt de initiële hechting van menselijke mesenchymale stamcellen geënt bij een bekend aantal op electrospun poly (ε-caprolacton) garen na 4 uur in de cultuur. Electrospun garens werden gehouden in verschillende set-ups, waaronder bioreactor schepen te draaien op 9 rpm, celkweek inserts geplaatst bij weinig binding well platen en (PTFE) in troggen geplaatst in petrischaaltjes. De laatste twee werden aan hetzij statische omstandigheden of geplaatst op een shaker plaat (30 37 ° C, 5% CO2, werd de locatie van gezaaide cellen bepaald met-DNA-test. Scaffolds werden verwijderd uit de verpakking en geplaatst in lysis buffer. De media fractie werd eveneens verwijderd en gecentrifugeerd - het supernatant verwijderd en pellets gebroken met lysisbuffer. Lysis buffer werd aan elke recipiënt, of goed, en geschraapt om alle cellen die aanwezig kunnen zijn vrij. De cel DNA test bepaald het percentage cellen aanwezig in het schavot, media en goed fracties. Celaanhechting laag was voor alle experimentele set-ups, met de grootste beslag (30%) voor garens gehouden binnen celkweek inserts en onderworpen aan schudden beweging. Deze studie sensibiliseert het werkelijke aantal cellen verbonden aan steigers ongeacht de vermelde cel zaaidichtheid.

De resultaten benadrukken de locatie van cellen na 4 uur na enten per proefopstelling onderzocht. Figuur 2A toont het percentage cellen dat gedurende deze tijd de steiger oppervlak hebben gehecht. Een omrekeningsfactor van 8,5 pg / cel werd gebruikt voor het meten DNA inhoud in celaantal converteren en bepalen dus het percentage cellen 10. Voor alle zaaien opstellingen onderzocht, het percentage celhechting relatief laag, met de grootste celhechting (30%) voor steigers gehouden binnen celkweek inserts en geschud bij 30 rpm (Insert Shaker). Laagste therapietrouw (15%) was voor steigers gehouden binnen de inzetstukken celcultuur en onder statische omstandigheden (Insert Static) gehouden. Een groot aantal cellen aanwezig in de media fractie (figuur 2B) waren, met name voor celkweek inserts gehouden binnen lage bindingsaffiniteit platen (Insert Statisch) en roterende vat was 50% en 51%respectievelijk. Steigers gehouden binnen de troggen toonde een verhoogd aantal cellen aanwezig in de houder zelf - 48% van de cellen voor Trog Shaker en 50% voor trog Statische. Scanning elektronenmicroscopie toegestaan ​​visuele inspectie van de cel geplaatste scaffolds (figuur 3). Representatieve beelden gewezen op een beperkte aanwezigheid van cellen op de vezelachtige oppervlak, ongeacht het zaaien set-up. Echter, een groter aantal cellen en cellen agglomeraten aanwezig op de steigers gehouden binnen de inzetstukken celkweek en geschud bij 30 rpm (Insert Shaker). <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/52135/52135fig1.jpg" /> Figuur 1. Experimentele Set-ups, waar elektrogesponnen Garen wordt gehouden binnen; (A) celkweek inserts en lage bindende well plaat; (B) poly (tetrafluorethyleen) (PTFE) goot en petrischaal; en (C) bioreactorvat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52135/52135fig1highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/52135/52135fig2.jpg" /> Figuur 2. Locatie van Cellen 4 uur na het zaaien op PCL elektrogesponnen Yarns met behulp van verschillende Seeding Set-ups. (A) toont het percentage cellen dat voor het PCL steiger zijn gehecht (gemiddelde ± standaarddeviatie), (B) toont de procentuele verdeling van cellocatie binnen drie fracties - media, goed en steiger (n = 4, gegevens gepresenteerd als gemiddelde waarden). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52135/52135fig2highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <img alt="Figuur 3" src = &quot;/ files / ftp_upload / 52135 / 52135fig3.jpg&quot; /&gt; Figuur 3. Vertegenwoordiger Rasterelektronenmicrografieën voor PCL elektrogesponnen Yarns met menselijke mesenchymale stamcellen, 4 uur na Initial Seeding behulp van verschillende experimentele set-ups. (Alle afbeeldingen op 1000x, schaal bar = 130 micrometer.) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52135/52135fig3highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een foto grotere versie van deze figuur.</a>

Dit artikel beschrijft een reeks configuraties voor het zaaien van menselijke mesenchymale stamcellen op materialen, in dit geval geëlektrospunnen garens, die de basis van standaard kweekputjes niet bedekken om het aantal cellen dat aanvankelijk hecht te maximaliseren en te kwantificeren in vergelijking met de bekende zaaidichtheid.

Het optimaliseren van Bevestiging van menselijke mesenchymale stamcellen op Poly (ε-caprolacton) elektrogesponnen Yarns

Research into biomaterials and tissue engineering often includes cell-based in vitro investigations, which require initial knowledge of the starting cell ...

In deze procedure worden elektro gesponnen PCL-scaffolds op verschillende manieren ingesteld om een optimale celzaai-opstelling te bepalen. Eerst worden de steriele scaffolds geplaatst in de verschillende onderzochte opstellingen, inclusief celkweekinserts, troggen en bioreactor roterende vaten. Eens op hun plaats, wordt een bekend aantal cellen op de scaffold gezaaid en vervolgens 20 minuten ongestoord gelaten.Vervolgens worden alle monsters zorgvuldig overgebracht naar een incubator, ingesteld op 5% koolstofdioxide en 37 graden Celsius, en onderworpen aan statische of dynamische omstandigheden voor uren. Na deze kweektijd wordt het aantal cellen dat zich aan de scaffold heeft gehecht bepaald door een DNA-assay om de hoeveelheid cellen in de scaffold media en welbepaalde fracties te kwantificeren. Uiteindelijk wordt dit bereikt door de DNA-hoeveelheid op de scaffold, de well en in het omringende medium te kwantificeren om de aanhechting van cellen aan scaffolds te bekijken. Hiervoor wordt scanning elektronenmicroscopie of SEM gebruikt.We kwamen eerst op het idee voor dit onderzoek toen we wisten dat onze scaffolds niet de hele bodem van de welbepaalde plaat bedekten, wat betekende dat er een mogelijkheid was dat niet alle cellen in contact zouden komen met de scaffold en dus in staat zouden zijn om zich te hechten. Om te beginnen, zet de celkweekinserts op onder lamina-flow door de steriele zes welbepaalde celkweekinserts te openen en de kortere ringen met tanden te scheiden van de bredere ringenlichamen. Neem vervolgens de ring met de tanden omhoog en spreid een van de vier centimeter scaffolds over het midden van de ring, ervoor zorgen dat het aan beide zijden overlapt.Neem de ringe lichaam en plaats het over de tandring en scaffold. Druk vervolgens naar beneden, ervoor zorgen dat de scaffold op zijn plaats blijft en door het midden van de celkweekInsert loopt. Plaats de celkweekinsert met scaffold in de welbepaalde van een zes welbepaalde laagbindende plaat, en voeg 10 milliliter kweekmedium toe aan de scaffold.Plaats vervolgens polytetrafluorethyleen troggen in individuele petrischalen en voeg 10 milliliter kweekmedium toe aan de trog. Gebruik een pincet om een van de drie centimeter scaffolds in de trog te draperen, ervoor zorgen dat de lengte ervan parallel ligt aan de langere rand van de trog. Om de bioreactorvat onder lamina-flow in te stellen, doseer 10 milliliter steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing of PBS door de hoofdpoort van de bioreactorvat.Na 10 minuten, verwijder de PBS en vervang met acht milliliter kweekmedium met behulp van een pincet. Voer een van de drie centimeter scaffolds in het vat in via de hoofdpoort. Vervolgens poseer de hoofdpoort uit.Na het uitvoeren van menselijke mesenchymale stamceltelling zoals beschreven in het tekstprotocol, aspireer het medium van de centrifugeerbuis en vervang het door het berekende mediumvolume. Resuspens de cellen en media voor een gelijkmatige mix. Gebruik een P 200 Gilson pipette om langzaam 200 microliters celsuspensie in elk scaffold te doseren door de punt van de pipette langs de lengte van het scaffold te laten lopen en onder het oppervlak van de media vloeistof.Laat 20 minuten ongestoord, of de bioreactorvaten doseerden 200 microliters van de celsuspensie door de hoofdpoort. Vul de resterende twee milliliter kweekmedium aan door de spuitpoorten om een totaal volume van 10 milliliter te geven. Breng vervolgens de bioreactorvaten over naar de roterende vatenbioreactor en stel in om te roteren.Bij negen RPM, breng de welbepaalde platen met celkweekinserts en troggen over naar de shakerplaat en stel in om te roteren bij 30 RPM in een 37 graden Celsius, 5% koolstofdioxide incubator of de statische kweek. Breng de welbepaalde platen met de celkweekinserts en troggen over naar de plank van een celkweekincubator. Stel in op 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide.Na vier uur, verwijder de monsters uit de incubator en plaats ze onder lamina-flow. Verwijder vervolgens de mediafracties van alle monsters en plaats ze in apart gelabelde centrifugeerbuizen. Na centrifugatie gedurende vijf minuten bij 241 keer G, verwijder de supernatant voordat u drie milliliter lysisbuffer voor de vortex toevoegt, de oplossing om de celpellet die de scaffolds binnen de celkweekinserts vasthielden te breken. Bevrijd eerst de scaffold door de scaffold dicht bij de rand van de inserts te snijden met behulp van een scaffold.Verwijder vervolgens met behulp van een pincet de scaffolds en plaats ze in centrifugeerbuizen die drie milliliter lysisbuffer bevatten. Voeg vervolgens drie milliliter lysisbuffer toe aan elke scaffoldreceptakel en schraap het oppervlak. Verwijder de lysisbuffer en plaats deze in apart gelabelde centrifugeerbuizen.Vortex elke centrifugeerbuis gedurende ongeveer een minuut om voldoende agitatie te garanderen en om de lysis van het celmembraan aan te moedigen. Voeg in een zwarte 96 welbepaalde plaat 100 microliters lysisbuffer toe voor elke steekproeffractie scaffold media en welbepaalde en vervolgens in het donker, voeg 100 microliters cel-DNA-oplossing toe aan alle welbepaalde bevattende lysisbuffer en meng. Gebruik voorzichtig welbepaalde met lysisbuffer bevattende geen DNA en cel-DNA-oplossing om een negatieve en positieve controle voor de welbepaalde plaat te bieden.Gebruik een fluorescentie plate reader om de absorptie van de welbepaalde te meten bij 485 nanometer excitatie en 520 nanometer emissie. Vergelijk de gegevens met de standaardcurve gegenereerd uit de DNA-standaarden volgens de instructies van de fabrikant om SEM-fixatie uit te voeren. Na vier uur incubatie, verwijder alle scaffolds uit hun receptacels en plaats ze in afzonderlijke welbepaalde van een nieuwe zes welbepaalde plaat en een lamina-flow.Was vervolgens de scaffolds twee keer met PBS per welbepaalde. Voeg twee milliliter 1,5% glutaaraldehyde in PBS toe om volledige dekking op de scaffold te garanderen. Laat de plaat minimaal 30 minuten bij vier graden Celsius staan voor celfixatie.Verwijder de fixatieoplossing en was de scaffolds twee keer met PBS. Breng vervolgens de scaffolds over naar een nieuwe welbepaalde plaat om ze te dehydrateren met toenemende concentraties ethanol in gedistilleerd water, beginnend met 50% ethanol gevolgd door 70% en

optimizing-attachment-human-mesenchymal-stem-cells-on-poly

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Het proces van electrospinning polymeren voor tissue engineering en cel cultuur wordt behandeld in dit artikel. In het bijzonder, is de electrospinning van fotoreactieve macromers met extra verwerkingsmogelijkheden van photopatterning en multi-polymeer electrospinning beschreven.

Electrospinning Stapel-Polymer Stellingen voor Tissue Engineering en Cell Culture

Het doel van deze studie was om de inheemse drie gelaagde architectuur van de vaatwand na te bootsen. Om dit te bereiken, was electrospinning in dienst met het gebruik van een 3-1 (input-output) nozzle en mengsels van polycaprolacton, elastine en collageen.

Tri-gelaagde Electrospinning Native Arteriële Architectuur met behulp van polycaprolacton, Elastine en Collageen Mimic: Een voorbereidende studie

Uitgelijnd electrospun vezels direct de groei van neuronen in vitro en zijn een potentieel onderdeel van de zenuw regeneratie steigers. We beschrijven een procedure voor het bereiden van electrospun vezels substraten en de serum-vrije cultuur van primaire rat E15 sensorische (DRG) en de motor neuronen. Visualisatie van de neuronen door middel van immunocytochemie is ook inbegrepen.

De cultuur van primaire motorische en sensorische neuronen in de gedefinieerde media op electrospun Poly-L-lactide Nanovezel Steigers

Electrospinning technieken kan een verscheidenheid van nanofibrous scaffolds voor tissue engineering of andere toepassingen. We beschrijven hier een procedure om de parameters van de electrospinning oplossing en apparatuur te optimaliseren om vezels te verkrijgen met de gewenste morfologie en uitlijning. Veel voorkomende problemen en het oplossen van problemen technieken worden ook gepresenteerd.

Electrospinning Fundamentals: Het optimaliseren van Solution en Apparatuur Parameters

Electrospun steigers kunnen worden verwerkt post-productie voor tissue engineering toepassingen. Hier beschrijven we methoden voor het spinnen complexe steigers (door opeenvolgende spinnen), voor het maken van dikkere steigers (door meerdere lagen met behulp van warmte of damp gloeien), voor het bereiken van steriliteit (aseptische productie of sterilisatie post-productie) en zorgt voor een juiste biomechanische eigenschappen.

Postproduction Verwerking van electrospun Vezels voor Tissue Engineering

Synthese en de fabricage van electrospun lange vezels verspreid over een grotere storting gebied via een nieuw ontworpen verzamelaar uit een roman biologisch afbreekbaar polymeer genoemd poly (glycerol-dodecanoaat) (PGD) werd gemeld. De vezels waren in staat de groei van cellen afkomstig van muizen pluripotente stamcellen ondersteunen.

Electrospun Stapel Stellingen van Poly (glycerol-dodecanedioate) voor Engineering zenuwweefsel Van muis embryonale stamcellen

Hier presenteren we een protocol om elektrogesponnen nanovezel steigers met gradated organisatie van vezels fabriceren en hun toepassingen verkennen in het reguleren van de cel morfologie / oriëntatie. Verlopen met betrekking tot fysische en chemische eigenschappen van de nanovezel scaffolds biedt een grote verscheidenheid aan toepassingen op biomedisch gebied.

Electrospun Nanovezel Steigers met gradaties in Fiber Organisatie

Twee- en driedimensionale superhydrofobe polymere materialen worden bereid door middel van elektrospinnen of elektrosprayen van biologisch afbreekbare polymeren vermengd met een polymeer met een lagere oppervlakte-energie van vergelijkbare samenstelling.

Fabriceren superhydrophobic polymere materialen voor biomedische toepassingen

Dit protocol fungeert als een uitgebreide richtsnoer te fabriceren steigers via electrospinning met polymeer in een directe schrijven-modus smelt. Wij systematisch overzicht van het proces en de juiste parameterinstellingen definiëren voor het bereiken van gerichte steiger platforms.

Electrospinning schrijven van driedimensionale Poly(ε-caprolactone) steigers met controleerbare Morphologies voor Tissue Engineering toepassingen smelten

Dit manuscript wordt de procedure beschreven om te fabriceren en karakteriseren van Griffithsin gemodificeerde poly (melkzuur-co-glycolic zuur) electrospun vezels waaruit krachtige lijm en antivirale activiteit tegen humaan immunodeficiëntie virus type 1 infectie in vitro. Methoden die worden gebruikt voor het synthetiseren, oppervlakte-wijzigen, en de resulterende morfologie, conjugatie, karakteriseren en desorptie van Griffithsin van oppervlak gemodificeerde vezels worden beschreven.

Fabricage en karakterisering van de vezel Griffithsin gemodificeerde steigers voor preventie van seksueel overdraagbare infecties

Leer hoe je de hechting van menselijke mesenchymale stamcellen op elektrogesponnen PCL-garens optimaliseert met DNA-assays en SEM. Deze methode verbetert de initiële celhechting in weefselengineeringonderzoek.

Het optimaliseren van Bevestiging van menselijke mesenchymale stamcellen op Poly (ε-caprolacton) elektrogesponnen Yarns

Meer video's verkennen