Het optimaliseren van Bevestiging van menselijke mesenchymale stamcellen op Poly (ε-caprolacton) elektrogesponnen Yarns

In deze procedure worden elektro gesponnen PCL-scaffolds op verschillende manieren ingesteld om een optimale celzaai-opstelling te bepalen. Eerst worden de steriele scaffolds geplaatst in de verschillende onderzochte opstellingen, inclusief celkweekinserts, troggen en bioreactor roterende vaten. Eens op hun plaats, wordt een bekend aantal cellen op de scaffold gezaaid en vervolgens 20 minuten ongestoord gelaten.

Vervolgens worden alle monsters zorgvuldig overgebracht naar een incubator, ingesteld op 5% koolstofdioxide en 37 graden Celsius, en onderworpen aan statische of dynamische omstandigheden voor uren. Na deze kweektijd wordt het aantal cellen dat zich aan de scaffold heeft gehecht bepaald door een DNA-assay om de hoeveelheid cellen in de scaffold media en welbepaalde fracties te kwantificeren. Uiteindelijk wordt dit bereikt door de DNA-hoeveelheid op de scaffold, de well en in het omringende medium te kwantificeren om de aanhechting van cellen aan scaffolds te bekijken. Hiervoor wordt scanning elektronenmicroscopie of SEM gebruikt.

We kwamen eerst op het idee voor dit onderzoek toen we wisten dat onze scaffolds niet de hele bodem van de welbepaalde plaat bedekten, wat betekende dat er een mogelijkheid was dat niet alle cellen in contact zouden komen met de scaffold en dus in staat zouden zijn om zich te hechten. Om te beginnen, zet de celkweekinserts op onder lamina-flow door de steriele zes welbepaalde celkweekinserts te openen en de kortere ringen met tanden te scheiden van de bredere ringenlichamen. Neem vervolgens de ring met de tanden omhoog en spreid een van de vier centimeter scaffolds over het midden van de ring, ervoor zorgen dat het aan beide zijden overlapt.

Neem de ringe lichaam en plaats het over de tandring en scaffold. Druk vervolgens naar beneden, ervoor zorgen dat de scaffold op zijn plaats blijft en door het midden van de celkweekInsert loopt. Plaats de celkweekinsert met scaffold in de welbepaalde van een zes welbepaalde laagbindende plaat, en voeg 10 milliliter kweekmedium toe aan de scaffold.

Plaats vervolgens polytetrafluorethyleen troggen in individuele petrischalen en voeg 10 milliliter kweekmedium toe aan de trog. Gebruik een pincet om een van de drie centimeter scaffolds in de trog te draperen, ervoor zorgen dat de lengte ervan parallel ligt aan de langere rand van de trog. Om de bioreactorvat onder lamina-flow in te stellen, doseer 10 milliliter steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing of PBS door de hoofdpoort van de bioreactorvat.

Na 10 minuten, verwijder de PBS en vervang met acht milliliter kweekmedium met behulp van een pincet. Voer een van de drie centimeter scaffolds in het vat in via de hoofdpoort. Vervolgens poseer de hoofdpoort uit.

Na het uitvoeren van menselijke mesenchymale stamceltelling zoals beschreven in het tekstprotocol, aspireer het medium van de centrifugeerbuis en vervang het door het berekende mediumvolume. Resuspens de cellen en media voor een gelijkmatige mix. Gebruik een P 200 Gilson pipette om langzaam 200 microliters celsuspensie in elk scaffold te doseren door de punt van de pipette langs de lengte van het scaffold te laten lopen en onder het oppervlak van de media vloeistof.

Laat 20 minuten ongestoord, of de bioreactorvaten doseerden 200 microliters van de celsuspensie door de hoofdpoort. Vul de resterende twee milliliter kweekmedium aan door de spuitpoorten om een totaal volume van 10 milliliter te geven. Breng vervolgens de bioreactorvaten over naar de roterende vatenbioreactor en stel in om te roteren.

Bij negen RPM, breng de welbepaalde platen met celkweekinserts en troggen over naar de shakerplaat en stel in om te roteren bij 30 RPM in een 37 graden Celsius, 5% koolstofdioxide incubator of de statische kweek. Breng de welbepaalde platen met de celkweekinserts en troggen over naar de plank van een celkweekincubator. Stel in op 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide.

Na vier uur, verwijder de monsters uit de incubator en plaats ze onder lamina-flow. Verwijder vervolgens de mediafracties van alle monsters en plaats ze in apart gelabelde centrifugeerbuizen. Na centrifugatie gedurende vijf minuten bij 241 keer G, verwijder de supernatant voordat u drie milliliter lysisbuffer voor de vortex toevoegt, de oplossing om de celpellet die de scaffolds binnen de celkweekinserts vasthielden te breken. Bevrijd eerst de scaffold door de scaffold dicht bij de rand van de inserts te snijden met behulp van een scaffold.

Verwijder vervolgens met behulp van een pincet de scaffolds en plaats ze in centrifugeerbuizen die drie milliliter lysisbuffer bevatten. Voeg vervolgens drie milliliter lysisbuffer toe aan elke scaffoldreceptakel en schraap het oppervlak. Verwijder de lysisbuffer en plaats deze in apart gelabelde centrifugeerbuizen.

Vortex elke centrifugeerbuis gedurende ongeveer een minuut om voldoende agitatie te garanderen en om de lysis van het celmembraan aan te moedigen. Voeg in een zwarte 96 welbepaalde plaat 100 microliters lysisbuffer toe voor elke steekproeffractie scaffold media en welbepaalde en vervolgens in het donker, voeg 100 microliters cel-DNA-oplossing toe aan alle welbepaalde bevattende lysisbuffer en meng. Gebruik voorzichtig welbepaalde met lysisbuffer bevattende geen DNA en cel-DNA-oplossing om een negatieve en positieve controle voor de welbepaalde plaat te bieden.

Gebruik een fluorescentie plate reader om de absorptie van de welbepaalde te meten bij 485 nanometer excitatie en 520 nanometer emissie. Vergelijk de gegevens met de standaardcurve gegenereerd uit de DNA-standaarden volgens de instructies van de fabrikant om SEM-fixatie uit te voeren. Na vier uur incubatie, verwijder alle scaffolds uit hun receptacels en plaats ze in afzonderlijke welbepaalde van een nieuwe zes welbepaalde plaat en een lamina-flow.

Was vervolgens de scaffolds twee keer met PBS per welbepaalde. Voeg twee milliliter 1,5% glutaaraldehyde in PBS toe om volledige dekking op de scaffold te garanderen. Laat de plaat minimaal 30 minuten bij vier graden Celsius staan voor celfixatie.

Verwijder de fixatieoplossing en was de scaffolds twee keer met PBS. Breng vervolgens de scaffolds over naar een nieuwe welbepaalde plaat om ze te dehydrateren met toenemende concentraties ethanol in gedistilleerd water, beginnend met 50% ethanol gevolgd door 70% en