Correleren Gen-specifieke DNA-methylatie Wijzigingen met Expression en transcriptionele activiteit van de astrocyten

Het hoofddoel van deze procedure is om de DNA-methyleringsstatus van KCNJ 10 te beoordelen in een verrijkte populatie astrocyten en de veranderingen in DNA-methylering van de promoter te correleren met de transcriptionele activiteit. Dit wordt bereikt door eerst een verrijkte populatie corticale astrocyten uit het gehele knaagdierenbrein te isoleren via FACS-sortering, waarna DNA uit de verrijkte populatie astrocyten wordt geïsoleerd. Vervolgens wordt de DNA-methyleringsstatus van KCNJ 10 beoordeeld met behulp van methyleringsgevoelige high-resolution melt-analyse of MS.HRMA.

Ten slotte is de KCNJ10-promotor hypergemethyleerd en wordt een luciferase-assay gebruikt om veranderingen in de DNA-methylering van de promotor te correleren met de transcriptionele activiteit. Uiteindelijk worden MS-HRMA en de luciferase-assay gebruikt om de DNA-methyleringsstatus van KCNJ10 te meten en om veranderingen in de methylering van de promotor te correleren met de transcriptionele activiteit van het gen. De procedure zal worden gedemonstreerd. Een postdoc uit mijn laboratorium heeft dit uitgevoerd. Alle dieren werden behandeld in overeenstemming met de richtlijnen van de National Institutes of Health; het Animal Care and Use Committee aan de University of Alabama at Birmingham heeft het gebruik van dieren goedgekeurd.

Alle buffers en reagentia werden bereid volgens het tekstprotocol. Nadat de cortices uit de kop van een geëuthanaseerd dier zijn gedissekeerd, conform het tekstprotocol, wordt er in de bovenkant van een conische buis van 50 milliliter een gat gesneden of gefreesd met een dremel om de slang door de buis te kunnen voeren. Voeg vervolgens de papine-oplossing toe aan de buis.

Plaats de gedissecteerde cortices in een kweekschaal van 10 millimeter met dissociatiemedium geëquilibreerd aan 95%O2 en 5%CO2, en gebruik een schoon scheermesje om het weefsel fijn te snijden in stukjes van één bij één vierkante millimeter. Verplaats het weefsel met een pipet van 10 milliliter naar de buis van 50 milliliter met de pepsine-oplossing. Laat het weefsel naar de bodem van de overdrachtspipet zakken voordat u het uitstoot.

Om de hoeveelheid overgedragen dissociatiemedium te minimaliseren zonder de pepaine-oplossing te laten bruisen, wordt een constante stroom van 95%O2 tot 5%CO2 via gasuitwisseling aan het oppervlak toegepast tijdens incubatie in een waterbad van 37 graden Celsius gedurende 20 minuten. Na de incubatie wordt het weefsel met een transferpipet van 10 milliliter langzaam 10 keer op en neer bewogen. Centrifugeer de troebele celsuspensie bij 300 G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Equilibreer de albumineremmeroplossing voor het DNA via gasuitwisseling aan het oppervlak en resuspendeer de gepelletteerde cellen in drie milliliters van deze oplossing.

Bereid vervolgens een commerciële discontinue dichtheidsgradiënt voor volgens de instructies van de fabrikant. Centrifugeer de discontinue dichtheidsgradiënt bij 70 G gedurende zes minuten. Isoleer vervolgens de gedissocieerde cellen van de bodem van de buis door het medium met een pipet af te zuigen.

Gebruik twee tot drie milliliter DPBS met 0,02% bovine serumalbumine en één milligram per milliliter DNA of het gewenste medium. Om de cellen te resuspenderen, worden de gedissocieerde cellen gesuspendeerd. Leid de cellen door een 40 µm filter voordat u overgaat tot FACS-sortering en DNA- of RNA-extractie volgens het tekstprotocol.

Ontwerp primers tegen een met bisulfit geconverteerde DNA-sequentie en amplificeer het DNA volgens het tekstprotocol door 500 tot 1000 nanogram DNA van elk monster en gemethyleerde DNA-standaarden variërend van 0% tot 100% van dezelfde diersoort te gebruiken met een voorkeur-DNA-polymerase en 5 micromolaire primers. Stel reacties van 20 microliter op voor Ms HRM-amplificatie. Voer volgens deze tabel alle monsters uit, inclusief blanks, DNA en gemethyleerde standaarden, in triplikaat; stel, afhankelijk van de analysesoftware, de pre- en post-start- en stopparameters in rond de overgangen van de smeltcurve.

Stel de parameters in voor het begin en het einde van de premelt, zodat het verschil tussen deze twee 0,2 tot 0,5 °C bedraagt. Stel op soortgelijke wijze het begin en het einde van de postmelt in en extraheer de gegevens van het temperatuurverschil van de piek voor elk monster met behulp van percentages van gemethyleerde standaarden en hun bijbehorende temperatuurverschillen van de piek.

Genereer een lineaire regressievergelijking. Gebruik deze lineaire regressievergelijking om de methyleringsstatus van onbekende monsters te schatten, nadat de relevante CpG-eilanden zijn geïdentificeerd en het CpG-eiland Luke two-plasmide is geamplificeerd en gekloneerd volgens het tekstprotocol. Gebruik preferred cutter-software om de sites voor de restrictieverdijsting te verifiëren om dubbele knippen te voorkomen en lineariseer 30 µg plasmide zodra het monster met de juiste enzymen is verteerd.

Inactieveer enzymen door verhitting bij de juiste temperatuur en duur in reacties van 50 µL. Gebruik vijf eenheden CPG-methyltransferase voor methylering. Gebruik 700 µg gelineariseerde plasmiden bij 30 °C gedurende 13 tot 19 uur.

Na het reinigen van het DNA zoals beschreven in het tekstprotocol, wordt een HPA II-restrictiedigest uitgevoerd op monsters van één microgram gemethyleerd DNA door incubatie bij 37 °C gedurende één uur. Na het reinigen van het DNA worden de monsters 45 minuten lang bij 100 volt gerun op een 1% agarose-DNAgel voor visualisatie. Vervolgens worden gemethyleerde en niet-gemethyleerde plasmiden overnacht onderworpen aan dubbele digestie met geschikte restrictie-enzymen om het volledige Luke 2-vector- en CpG-eilandfragmenten vrij te maken.

Inactiveer de enzymen door verhitting na de digestie. Run de dubbel gedigesteerde monsters op een 1% DNA-agarosegel bij 100 volt gedurende één uur om de vector en het insert te scheiden. Plaats de gel vervolgens, terwijl u UV-bescherming draagt, onder een UV-lamp en snijd met schone chirurgische scalpels de gemethyleerde en niet-gemethyleerde inserts uit. Nadat het DNA volgens het tekstprotocol uit de gel is geëxtraheerd, gebruikt u T4 DNA-ligase en een ratio van één tot vier vector ten opzichte van insert om de gemethyleerde en niet-gemethyleerde inserts in een niet-gemethyleerde vector te ligeren. Incubeer na de ligatie overnacht bij -20 °C of op ijs.

Zuiver het DNA en verifieer de herligatie door monsters op een 1% DNA-agarosegel te laden en bepaal de concentratie van het hergeligeerde plasmide. Zaai CD 54-cellen uit op een 12-wellplaat met 140.000 cellen per well. Na 24 uur wordt een commercieel transfectiereagens gebruikt om de cellen te transfecteren met gelijke concentraties van het niet-gemethyleerde CpG-loop 2-plasmide plus REN-vanilla of een andere controle-luciferasevector, of het gemethyleerde CpG-loop 2-plasmide plus ELLA of een andere controle-luciferasevector. Laat de cellen 24 uur transfecteren voordat een luciferase-assay wordt uitgevoerd.

Gebruik volgens de instructies van de fabrikant een luminometer om elke well in triplikaat uit te lezen. Bereken de ratio van de firefly luciferase-activiteit ten opzichte van ran vanilla of een andere controle van de luciferase-activiteit.

Normaliseer de gemethyleerde vuurvlieg-controleluciferase-activiteit ten opzichte van de niet-gemethyleerde vuurvlieg-controleluciferase-activiteit door de gemethyleerde activiteit te delen door de gemethyleerde luc-activiteit. Zoals hier gedemonstreerd, werd een verrijkte populatie astrocyten verkregen via FACS-sortering van E-G-F-P-S 100 beta transgene dieren. Er werd een gated populatie geselecteerd op basis van forward en side scatter, en een levende celpopulatie werd bepaald met behulp van een bromide-dead cell-indicator; de hier getoonde gating bevat representatieve beelden van EGFP-positieve astrocyten na dissociatie, maar vóór de sortering, alsook na de sortering. Deze figuur toont een geïsoleerde EGFP-positieve celpopulatie die een 40-voudige toename in mRNA voor de astrocytspecifieke marker vertoonde.

Een LDH 1:1. Daarnaast werd, ondanks de gedeelde expressie van S100 bèta en NG2 in positieve OPC's en astrocyten, een viervoudige afname in NG2 mRNA waargenomen, een marker voor oligodendrocyt-precursorcellen, wat duidt op de isolatie van een verrijkte astrocytaire celpopulatie. Deze tabel vermeldt het totaal aan RNA en DNA, geïsoleerd van dieren van verschillende leeftijden en aantallen, en dient als referentie voor de verwachte opbrengst van moleculen na extractie.

Ten slotte werd een duale luciferase-assay gebruikt om de transcriptionele activiteit van hypergemethyleerde regio's van het gen van belang te beoordelen, nadat het gemethyleerde insert in een niet-gemethyleerde vector was overgebracht. HPA II, dat alleen niet-gemethyleerd DNA verteert, werd gebruikt om de methyleringsstatus van het plasmide te verifiëren. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een verrijkte populatie astrocyten kunt isoleren met behulp van FACS, evenals hoe u de DNA-methylering van een gen kunt meten en veranderingen in de DNA-methylering van de promotor kunt correleren met de transcriptionele activiteit, respectievelijk met behulp van methyleringsgevoelige high-resolution melt-analyse en een luciferase-assay.