Name: Correleren Gen-specifieke DNA-methylatie Wijzigingen met Expression en transcriptionele activiteit van de astrocyten KCNJ10 (Kir4.1) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Leer DNA-methylatieanalyse van KCNJ10 in astrocyten met MS.HRMA en luciferase-assays. Deze methode correleert epigenetische veranderingen met transcriptieactiviteit voor neurowetenschappelijk onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door R01NS075062-01A1. FACS-sortering uitgevoerd in de UAB Comprehensive Flow Cytometry Core-faciliteit (P30 AR048311, P30 A1027767). Dr. Scott Philips van de UAB Neurobiology Core-faciliteit en Dr. Susan Nozell van de UAB CDIB hebben geassisteerd met technische aspecten van de luciferase-assay.

Alle dieren werden behandeld volgens de National Institutes of Health richtlijnen. De Animal Care en gebruik Comite aan de Universiteit van Alabama in Birmingham goedgekeurde gebruik van dieren. 1. Het verkrijgen van RNA en DNA van een verrijkte astrocyten Bevolking met behulp van TL Activated Cell Sorting (FACS) van Astrocyten van Whole Brain Tissue <ol><li> Bezadigd dier met CO 2 gedurende 1 minuut en vervolgens snel onthoofden. Ontleden cortex zoals beschreven in Albuquerque et al, 26.; Het is niet noodzakelijk hersenvliezen verwijderd. Opmerking: Transgene ratten uitdrukken eGFP onder de S100β (een astrocyten marker) promotor werden gegenereerd door Itakura et al 27 en gebruikt voor FACS sorteren van astrocyten.. </li><li> Bereid hele hersenhomogenaat met een papaïne dissociatie kit onder niet-steriele omstandigheden volgens het protocol van de fabrikant. Heat activeren papaïne bij 37 ° C in een waterbad gedurende 10 min. Let op:Papaïne oplossing wordt geleverd door fabrikant en bevat L-cysteïne en EDTA (Zie tabel van Materialen). <ol><li> Snij of dremel een opening in de top van een 50 ml conische buis te laten uitvoeren buizenstelsel 95% O2: 5% CO 2 wordt toegevoerd aan een gesloten conische buis (figuur 1A). Plaats ontleed cortex in 10 mm kweekschaal met dissociatie medium (MEM gesupplementeerd met 20 mM glucose en penicilline / streptomycine (500 U / ml) en geëquilibreerd met 95% O2: 5% CO 2) en gebruik een schoon scheermesje om weefsel te vermalen in 1 x 1 mm 2 stuks. </li></ol></li><li> Overdracht weefsel met behulp van 10 ml handmatige pipetman met 50 ml conische buis met papaïne oplossing. Sta weefsel om zich te vestigen op bodem van transferpipet alvorens af te voeren om de hoeveelheid dissociatie media overgedragen minimaliseren. Houd papaïne oplossing geëquilibreerd met 95% O2: 5% CO 2 via oppervlakte gasuitwisseling voor de duur van de incubatie. Niet bubble papaine solutiop. Incubeer weefsel voor 20 min in 37 ° C waterbad. </li><li> Na incubatie in papaïne oplossing, vermaal weefsel 10 keer met een 10 ml transferpipet bij lage snelheid. Centrifuge bewolkte celsuspensie bij 1000 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. <ol><li> Equilibreer DNase / albumine-remmer oplossing (geleverd door de fabrikant) via oppervlak gasuitwisseling en resuspendeer gepelleteerde cellen in 3 ml DNase / albumine-remmer oplossing. Bereid commerciële gradiënt discontinue dichtheid volgende instructies van de fabrikant. </li></ol></li><li> Spin discontinue gradiënt dichtheid bij 1000 xg gedurende 6 min. Isoleer gedissocieerde cellen van de bodem van de buis zuigen bodem pellet met behulp van een pipet. </li><li> Resuspendeer gedissocieerde cellen in 2-3 ml van DPBS met 0,02% runderserumalbumine en 1 mg / ml DNase of gewenste HEPES gebufferd kweekmedium. Passeren 40 urn filter vóór FACS (Figuur 2A). Houd cellen op ijs tot het sorteren. <ol><li> Voeren FACS 28. &lt;/ li&gt; <li> Pellet cellen in 1,5 ml centrifugebuizen bij 2000 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Opmerking: Gepelleteerd astrocyten kan onmiddellijk worden gebruikt of -80 ° C bewaard totdat DNA-extractie. </li></ol></li><li> Extract RNA en DNA met aangewezen isolatie methode 29 30. Beoordelen RNA en DNA-concentratie en kwaliteit via de spectrofotometer en bioanalyzer 31. Opmerking: Gebruik alleen hoge kwaliteit RNA en DNA in de daaropvolgende stappen, 260/280 = 2,0-2,2 en 1,8-1,9, respectievelijk. Bioanalyzer analyse is essentieel om na afbraak van RNA of DNA fragmentatie. RNA of DNA kan direct worden gebruikt of opgeslagen in -80 ° C of -20 ° C, respectievelijk latere studies. </li></ol> 2. Het beoordelen van DNA methylatie status van een gen met methylatie-gevoelige met hoge resolutie Melt Analyse (MS-HRMA) <ol><li> Voer gen sequentie van belang in de voorkeur online methylatie mapping software om elke CpG eilanden in gen te identificerenvan belang 32. <ol><li> Ontwerp van primers tegen bisulfiet omgezet DNA-sequentie 33 en versterken met behulp van geprefereerde DNA polymerase volgens het protocol van de fabrikant. Controleer Amplified productgrootte worden uitgevoerd door een 1% agarose gel van DNA bij 100 V gedurende 45 min. WINKEL primers op voorraad concentratie van 20 uM bij -20 ° C. </li></ol></li><li> Bisulfiet omgezet 500-1000 ng DNA van elk monster en gemethyleerd DNA standaarden variërend van 0-100% van dezelfde diersoort 34. Elueer monsters tot een concentratie van 20 ng / ul verschaffen. Controleer de concentratie van bisulfiet geconverteerde DNA via spectrofotometer 31. </li><li> Setup 20 gl reacties voor MS-HRM amplificatie met gewenste DNA polymerase en primers aan 5 uM concentratie overeenkomstig tabel 1 en 2. Uitvoeren alle monsters, inclusief FACS DNA en gemethyleerde standaarden in drievoud. </li><li> Afhankelijk analysesoftware, vastgesteld voor en na de start en stop parametersrond de overgangen van de smelt curve. Set pre-melt start en pre-smelt stop parameters, zodat het verschil tussen beide is 0,2-0,5 ° C. Set post-smelt start en post-smelt stoppen op vergelijkbare wijze. Extract piek temperatuurverschil gegevens voor elk monster. </li><li> Met behulp procent gemethyleerde standaarden (y-waarde) en de bijbehorende gemiddelde piek temperatuurverschillen (x-value) genereren van een lineaire regressievergelijking (figuur 3A-B, tabel 3-4). Gebruik deze lineaire regressie vergelijking om methylatie status van onbekende monsters 35 schatten. </li></ol> 3. Het beoordelen van Hyper-gemethyleerd promotor activiteit via Gebruik van Luciferase Assay <ol><li> Identificeer CpG eilanden van target-gen (Stap 2.1). PCR versterken regio&#39;s van belang 36 en kloon stroomopwaarts van de luc2 Firefly luciferasereportergen om CpG-eiland-luc2 plasmiden 37 te produceren. </li><li> Lineariseren 30 ug CpG-eiland-luc2 plasmide via beperkingenzymdigestie 38. Controleer voor restrictie digest en voorkoming van dubbele sneden met favoriete mes software 38. Heat-enzymen inactiveren bij geschikte temperatuur en tijdsduur na digestie volgens het protocol van de fabrikant. Minimaal verlies van DNA optreedt tijdens de linearisatie stap. </li><li> Methylaat gelineariseerde plasmiden met CpG methylase (M.Sssl) O / N bij 30 ° C of laat onbehandeld volgende fabrikant protocol, behalve voor de volgende aanpassingen. </li><li> Voer 50 pi reacties. </li><li> Gebruik 5 eenheden van CpG methylase tot 700 ng gelineariseerde plasmide methyleren. </li><li> Run reacties O / N voor 13-19 uur. </li><li> Na CpG methylase reactie uitgevoerd met behulp van standaard DNA opruimen handel verkrijgbare silicagel membraan schoonmaken kit volgens protocol van de fabrikant. Aanzienlijke verliezen van DNA optreden na CpG methylase reactie, 30-60% verlies. </li><li> Controleer methylering van plasmiden via een Hpa II restrictiedigest. </li&gt; <li> Neem 1 ug van gemethyleerd of niet-gemethyleerd DNA en restrictie digest met Hpa II gedurende 1 uur bij 37 ° C. Gebruik 5-10 eenheden van Hpa II voor elk ug DNA. Na Hpa II vertering uitvoeren DNA opruimen behulp voorkeur, in de handel verkrijgbaar silicagel membraan schoonmaken kit. Run zowel CpG gemethyleerd en niet-gemethyleerd plasmiden op 1% agarose gel in TAE-DNA of TBE buffer bij 100 V gedurende 45 min voor het zichtbaar (Figuur 4B). </li><li> Betreft zowel gemethyleerde en niet-gemethyleerde plasmiden dubbele digestie met geschikte restrictie-enzymen om full-length luc 2 (vector) en CpG eiland (insert) fragmenten 38 vrijgeven. Voeren dubbele ontsluiting O / N op de juiste temperatuur en warmte-inactiveren enzymen volgende spijsvertering volgens het protocol van de fabrikant. Minimaal verlies van DNA-concentratie optreedt tijdens dubbele restrictiedigest. </li><li> Run double verteerd plasmiden op 1% DNA agarosegel bij 100 V gedurende 1 uur toe te staan ​​voor de scheiding of vector en plaats (Figuur 4C). Voorzichtigheid. Het dragen van beschermende UV-gezichtsbescherming, plaatsen DNA-gel op een tafelblad zwart licht aan banden te visualiseren. Op basis van grootte, accijnzen gemethyleerde en niet-gemethyleerde insert en niet-gemethyleerde vector met een schone chirurgische mes. </li><li> Gel extract DNA met verzadigd fenol, pH 6,6. In het kort, wegen DNA gel met vector of insert. Gebruik 100 ul fenol per 0,1 gram DNA gel. Homogeniseren DNA gel in fenol met behulp van glas Dounce homogenisator. </li><li> Chloroform (met 1/5 van fenol volume) toe en schud monsters voor 20 sec. Incubeer monsters bij kamertemperatuur gedurende 2-3 min. Centrifugeer gedurende 15 minuten bij maximale snelheid (16,1 x 1.000 x g) bij 4 ° C. </li><li> Verwijder waterige oplossing en voeg 0,1X volume van 3 M natriumacetaat en 2,5 maal volume ethanol. Incubeer de monsters gedurende 1 uur bij -80 ° C. Na incubatie verwijderen ethanol en resuspendeer DNA in 30 ui buffer voorkeur. Aanzienlijk verlies van DNA optreedt na isolatie van inserts en vectoren, 30-50% loss. </li><li> Opnieuw Ligeer gemethyleerde en niet-gemethyleerde inzetstukken voor niet-gemethyleerd vector met behulp van T4 DNA-ligase 38. Met een 1: 4 verhouding van vector in te voegen voor ligatiereacties. Setup reactie volgens instructies van de fabrikant. Gebruik een totaal volume van 50 pi voor reacties en geïncubeerd O / N bij -20 ° C of op ijs met deksel over ijs emmer. </li><li> Na ligatie uitgevoerd DNA opruimen behulp voorkeur, in de handel verkrijgbaar silicagel membraan schoonmaken kit. Aanzienlijk verlies van DNA optreden na ligatiereactie, bij benadering 30-50% verlies van DNA. Controleer opnieuw ligatie door lopen op 1% agarose gel van DNA bij 100 V gedurende 45 minuten en evalueren concentratie van het opnieuw geligeerde plasmiden (figuur 4D). </li><li> Transfecteren gemethyleerd of niet-gemethyleerd plasmiden in D54-cellen onder toepassing van een commercieel transfectie reagens volgens het protocol van de fabrikant. Seed D54 cellen op 12-well plaat op een 0,14 x 10 6 cellen / well. </li><li> Na 24 uur, transfecteren cellen with gelijke concentraties van ofwel (1) niet methyated CpG-luc2 plasmide + Renilla of andere controle-luciferase vector of (2) gemethyleerde CpG-luc2 plasmide + Renilla of andere controle-luciferase vector. </li><li> Laat cellen te transfecteren voor 24 uur voordat duale luciferasetest. Voer bepaling volgens instructies van de fabrikant. Voer metingen met behulp van een luminometer. Lees elk putje in drievoud. </li><li> Bereken verhouding firefly luciferase activiteit Renilla of andere controle-luciferaseactiviteit. Normaliseren gemethyleerde Firefly: controle luciferase activiteit niet-gemethyleerd Firefly: controle luciferase activiteit met gemethyleerd luciferasewerkzaamheid delen door niet-gemethyleerd luciferaseactiviteit </li></ol>

De auteurs hebben geen openbaarmakingen.

Dit protocol beschrijft de isolatie van een verrijkte populatie van astrocyten via FACS, evenals een verscheidenheid aan technieken die zowel correlatieve als causale studies mogelijk maken tussen DNA-methylatie en genexpressie. Deze technieken, gebruikt in isolatie of in combinatie, zijn bijzonder nuttig voor laboratoria die werken met weefsel van hoge cellulaire heterogeniteit of die geïnteresseerd zijn in de DNA-methylatiestatus van een bepaald gen of gengebied versus globale DNA-methyleringsveranderingen. Een relatie...

Epigenetics is de studie van chemische modificaties die de transcriptionele activiteit van het genoom kunnen beïnvloeden. Essentieel, zonder een verandering in de DNA-sequentie, zijn epigenetische modificaties zoals DNA-methylatie, histon-acetylatie en histon-methylatie voldoende om patronen van genexpressie 1omkeerbaar te veranderen. DNA-methylatie, een krachtige regulator van genexpressie, is de meest goed gekarakteriseerde epigenetische modificatie. DNA-methylatie is de covalente binding van methylgroepen op de C5-positie van een cytosine, meestal de cytosine van een cytosine-guanine dinucleotide, ook bekend als een CpG-site. Gebieden met een hoge dichtheid aan CpG-sites staan bekend als CpG-eilanden (CGI's). CGI's worden vaak geassocieerd met transcriptionele startplaatsen (TSS) en genpromotors 1-3. Dus, terwijl veranderingen in DNA-methylatie bij CGI's niet altijd samengaan met veranderingen in cellulaire expressie of functie, kunnen veranderingen in DNA-methylatie bij CGI's krachtige regulatie uitoefenen op transcriptionele activiteit 2. 
Histologisch werd DNA-methylatie gezien als essentieel in embryogenese, imprinting en ontwikkeling, met weinig veranderingen in de niveaus van DNA-methylatie die plaatsvinden in post-mitotische cellen (met uitzondering van veranderingen in kanker-gerelateerde genen) 4,5. Echter, het veld van neuro-epigenetica heeft een belangrijke niet-ontwikkelingsrol voor DNA-methylatie benadrukt. Specifiek heeft cognitieve epigenetica DNA-methylatie herdefinieerd als een zeer plastisch mechanisme dat integraal is in het mediëren van zowel de transcriptionele activering als repressie van genen die essentieel zijn voor het proces van leren en geheugen 6. Afgezien van cognitieve epigenetica, karakteriseren studies die ischemische schade en neuropathische pijn modelleren DNA-methylatie als een labieel mechanisme dat snel reageert op een verscheidenheid aan CNS-letsels 7-9. Wat betreft astrocyten, suggereren verschillende bewijslijnen dat DNA-methylatie een belangrijke rol speelt in astrogliogenese. Fan et al., vonden dat conditionele KO van DNMT1 in neurale progenitorcellen (NPC's) resulteerde in vroegtijdige ontwikkeling van astrocyten, in overeenstemming met een globale toestand van hypomethylatie 10. Bovendien concludeerden Perisic et al., dat differentiële niveaus van DNA-methylatie van de GLT-1 promotor differentiële niveaus van expressie van de glutamaattransporter in de cortex en cerebellum medieerden, wat een rol benadrukt van DNA-methylatie in het vestigen van hersengebied-specifieke patronen van astrocytaire genexpressie 11. Al met al onderstrepen talrijke studies de dynamische en labiele aard van DNA-methylatie in het CNS aangezien omgeving, medicijnen en letsel allemaal zijn aangetoond DNA-methylatie te veranderen en vaak, genexpressie 4,9. Samen wijzen deze neuro-epigenetische studies op DNA-methylatie als een haalbaar therapeutisch doelwit met het potentieel om een verscheidenheid aan CNS-pathologieën te mitigeren.
Naarmate het veld van epigenetica zijn begrip van de rol van DNA-methylatie in neuro-ontwikkeling en ziekte uitbreidt, is de uitdaging om DNA-methylatie naar een therapeutisch doelwit te verplaatsen het uitvoeren van niet alleen correlatieve, maar oorzakelijke studies die specifieke gendoelwitten en -plaatsen definiëren. Bovendien blijft het onderzoeken van veranderingen in DNA-methylatie specifiek voor hersengebied en celtype een doorlopende en tijd waardige uitdaging die uniek is voor het veld van neuro-epigenetica. Dit protocol gebruikt een verscheidenheid aan technieken, inclusief fluorescentie-geactiveerd celsorteren (FACS) van astrocyten, methylatie-gevoelige hoog-resolutie smeltanalyse (MS-HRM) en een methylatie luciferase-assay om de DNA-methylatiestatus van KCNJ10 te onderzoeken, een gen dat codeert voor Kir4.1. Kir4.1 is een gliac-specifiek kaliumkanaal dat zowel hersengebied als cel-specifieke patronen van expressie in het CNS aantoont 12-16. Kir4.1 expressie neemt toe bij het bewegen van rostrale naar caudale CNS-gebieden, met de hoogste expressie in het ruggenmerg 15. Hoewel het kanaal wordt uitgedrukt in ependymale cellen, oligodendrocyten en hun precursorcellen, wordt Kir4.1 voornamelijk tot expressie gebracht in astrocyten en wordt gedacht essentieel te zijn voor het handhaven van homeostatische niveaus van kalium, evenals het ondersteunen van glutamaat-opname door het astrocyten rustmembraanpotentiaal op een gehyperpolariseerde -80mV te stellen 12,16-19. Belangrijk is dat de expressie van Kir4.1 niet-statisch is zowel tijdens ontwikkeling als na meerdere vormen van CNS-letsel 20-25. We wilden de epigenetische regulatie van dit kanaal onderzoeken, specifiek in astrocyten tijdens ontwikkeling. De gebruikte technieken bieden gen-specifieke en gerichte CpG-site analyses die causaal bewijs leveren voor een rol van DNA-methylatie in het reguleren van KCNJ10 genexpressie. Deze technieken kunnen op andere genen worden toegepast.

<table><tbody><tr><td>Papain Dissociation System</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LK003150</td><td></td></tr><tr><td>AllPrep DNA/RNA Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>80204</td><td></td></tr><tr><td>Methyl Primer</td><td>Applied Biosystems</td><td>online</td><td>software om CpG-eilanden te lokaliseren</td></tr><tr><td>EZ DNA methylation Kit</td><td>Zymo Research</td><td>D5001</td><td></td></tr><tr><td>Rat Premixed Calibration Standard</td><td>EpiGenDx</td><td>80-8060R-Premix</td><td></td></tr><tr><td>CpG Methylase (M.Sssl)</td><td>Zymo Research</td><td>E2010</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction&nbsp;</td><td>QIagen</td><td>28704</td><td>Gebruikt voor gelextractie en DNA-opruiming</td></tr><tr><td>Restriction enzymes</td><td>New England BioLabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NEB cutter</td><td>New England BioLabs</td><td>online</td><td>verificatie van restrictie-digestieplaatsen</td></tr><tr><td>Dual Luciferase Reporter Assay System</td><td>Promega</td><td>E1910</td><td></td></tr><tr><td>Luc2 vector, pGL4.10</td><td>Promega</td><td>E6651</td><td></td></tr><tr><td>renilla vector, pGL4.74</td><td>Promega</td><td>E2241</td><td></td></tr><tr><td>TD-20/20 Luminometer</td><td>Turner Designs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine LTX and Plus Reagent</td><td>Life Technologies</td><td>A12621</td><td></td></tr><tr><td>Phenol, saturated pH 6.6/6.9</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 17501-100</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000/2000c Spectrophtometer</td><td>ThermoScientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MeltDoctor Master Mix</td><td>Life Technologies</td><td>4415440</td><td></td></tr><tr><td>High Resolution Melt (HRM) Software v2.0</td><td>Life Technologies</td><td>4397808</td><td></td></tr><tr><td>AB SDS software v2.3</td><td>Life Technologies</td><td>online</td><td></td></tr><tr><td>AB High Resolution Melting Getting Started Guide&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>online</td><td></td></tr><tr><td>AB 7900HT Fast Real-Time System</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

correleren gen-specifieke dna-methylatie wijzigingen met expression en transcriptionele activiteit van de astrocyten<em&gt; kcnj10</em&gt; (kir4.1)

Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 (Kir4.1)

DNA-methylatie dient om genexpressie te reguleren door de covalente binding van een methylgroep op de C5-positie van een cytosine in een cytosine-guanine-dinucleotide. Hoewel DNA-methylatie langdurige en stabiele veranderingen in genexpressie veroorzaakt, zijn patronen en niveaus van DNA-methylatie ook onderhevig aan verandering op basis van een verscheidenheid aan signalen en stimuli. Als zodanig functioneert DNA-methylatie als een krachtige en dynamische regulator van genexpressie. De studie van neuro-epigenetica heeft een verscheidenheid aan fysiologische en pathologische toestanden onthuld die geassocieerd zijn met zowel globale als gen-specifieke veranderingen in DNA-methylatie. Specifiek bestaan er opvallende correlaties tussen veranderingen in genexpressie en DNA-methylatie bij neuropsychiatrische en neurodegeneratieve aandoeningen, tijdens synaptische plasticiteit en na een CZS-letsel. Echter, naarmate het veld van neuro-epigenetica zijn begrip van de rol van DNA-methylatie in de CZS-fysiologie blijft uitbreiden, zijn causale relaties in verband met veranderingen in genexpressie en DNA-methylatie essentieel. Bovendien, met betrekking tot het grotere veld van de neurowetenschappen, vereisen de aanwezigheid van uitgebreide regio- en celspecifieke verschillen technieken die deze variaties aanpakken bij het bestuderen van het transcriptoom, proteoom en epigenoom. Hier beschrijven we FACS-sortering van corticale astrocyten die een vervolgonderzoek mogelijk maakt van zowel RNA-transcriptie als DNA-methylatie. Verder beschrijven we een techniek om DNA-methylatie te onderzoeken, methylatie-gevoelige hoge resolutie smeltanalyse (MS-HRMA) evenals een luciferase promotor-assay. Door het gebruik van deze gecombineerde technieken is men niet alleen in staat om correlatieve veranderingen tussen DNA-methylatie en genexpressie te onderzoeken, maar ook om direct te beoordelen of veranderingen in de DNA-methylatiestatus van een bepaald gengebied voldoende zijn om transcriptionele activiteit te beïnvloeden.

Een verrijkte populatie van astrocyten werd verworven via FACS sortering van eGFP-S100β transgene dieren 27. Door afnemende kwaliteit van cellen en moleculair molecules die uit dieren ouder dan postnatale dag 50 (p50), dieren p0-p40 ouder zijn optimaal voor dergelijke experimenten. Corticaal weefsel werd gebruikt voor deze experimenten. Cortex vanaf 2 om 6 dieren werden samengevoegd. FACS werd uitgevoerd bij UAB Comprehensive flowcytometrie Core faciliteit. Sorteren werd uitgevoerd op Becton Dickinson FACSAri...

DNA-methylatie is in staat om stabiele niveaus van genregulatie te handhaven, evenals dynamische veranderingen in genregulatie mogelijk te maken als reactie op verschillende stimuli. We beschrijven technieken die het mogelijk maken om gen-specifieke veranderingen in DNA-methylatie en de invloed van deze veranderingen op genregulatie te bestuderen.

Correleren Gen-specifieke DNA-methylatie Wijzigingen met Expression en transcriptionele activiteit van de astrocyten<em&gt; KCNJ10</em&gt; (Kir4.1)

DNA methylation serves to regulate gene expression through the covalent attachment of a methyl group onto the C5 position of a cytosine in a ...

Het hoofddoel van deze procedure is om de DNA-methyleringsstatus van KCNJ 10 te beoordelen in een verrijkte populatie astrocyten en de veranderingen in DNA-methylering van de promoter te correleren met de transcriptionele activiteit. Dit wordt bereikt door eerst een verrijkte populatie corticale astrocyten uit het gehele knaagdierenbrein te isoleren via FACS-sortering, waarna DNA uit de verrijkte populatie astrocyten wordt geïsoleerd. Vervolgens wordt de DNA-methyleringsstatus van KCNJ 10 beoordeeld met behulp van methyleringsgevoelige high-resolution melt-analyse of MS.HRMA.Ten slotte is de KCNJ10-promotor hypergemethyleerd en wordt een luciferase-assay gebruikt om veranderingen in de DNA-methylering van de promotor te correleren met de transcriptionele activiteit. Uiteindelijk worden MS-HRMA en de luciferase-assay gebruikt om de DNA-methyleringsstatus van KCNJ10 te meten en om veranderingen in de methylering van de promotor te correleren met de transcriptionele activiteit van het gen. De procedure zal worden gedemonstreerd. Een postdoc uit mijn laboratorium heeft dit uitgevoerd. Alle dieren werden behandeld in overeenstemming met de richtlijnen van de National Institutes of Health; het Animal Care and Use Committee aan de University of Alabama at Birmingham heeft het gebruik van dieren goedgekeurd.Alle buffers en reagentia werden bereid volgens het tekstprotocol. Nadat de cortices uit de kop van een geëuthanaseerd dier zijn gedissekeerd, conform het tekstprotocol, wordt er in de bovenkant van een conische buis van 50 milliliter een gat gesneden of gefreesd met een dremel om de slang door de buis te kunnen voeren. Voeg vervolgens de papine-oplossing toe aan de buis.Plaats de gedissecteerde cortices in een kweekschaal van 10 millimeter met dissociatiemedium geëquilibreerd aan 95%O2 en 5%CO2, en gebruik een schoon scheermesje om het weefsel fijn te snijden in stukjes van één bij één vierkante millimeter. Verplaats het weefsel met een pipet van 10 milliliter naar de buis van 50 milliliter met de pepsine-oplossing. Laat het weefsel naar de bodem van de overdrachtspipet zakken voordat u het uitstoot.Om de hoeveelheid overgedragen dissociatiemedium te minimaliseren zonder de pepaine-oplossing te laten bruisen, wordt een constante stroom van 95%O2 tot 5%CO2 via gasuitwisseling aan het oppervlak toegepast tijdens incubatie in een waterbad van 37 graden Celsius gedurende 20 minuten. Na de incubatie wordt het weefsel met een transferpipet van 10 milliliter langzaam 10 keer op en neer bewogen. Centrifugeer de troebele celsuspensie bij 300 G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Equilibreer de albumineremmeroplossing voor het DNA via gasuitwisseling aan het oppervlak en resuspendeer de gepelletteerde cellen in drie milliliters van deze oplossing.Bereid vervolgens een commerciële discontinue dichtheidsgradiënt voor volgens de instructies van de fabrikant. Centrifugeer de discontinue dichtheidsgradiënt bij 70 G gedurende zes minuten. Isoleer vervolgens de gedissocieerde cellen van de bodem van de buis door het medium met een pipet af te zuigen.Gebruik twee tot drie milliliter DPBS met 0,02% bovine serumalbumine en één milligram per milliliter DNA of het gewenste medium. Om de cellen te resuspenderen, worden de gedissocieerde cellen gesuspendeerd. Leid de cellen door een 40 µm filter voordat u overgaat tot FACS-sortering en DNA- of RNA-extractie volgens het tekstprotocol.Ontwerp primers tegen een met bisulfit geconverteerde DNA-sequentie en amplificeer het DNA volgens het tekstprotocol door 500 tot 1000 nanogram DNA van elk monster en gemethyleerde DNA-standaarden variërend van 0% tot 100% van dezelfde diersoort te gebruiken met een voorkeur-DNA-polymerase en 5 micromolaire primers. Stel reacties van 20 microliter op voor Ms HRM-amplificatie. Voer volgens deze tabel alle monsters uit, inclusief blanks, DNA en gemethyleerde standaarden, in triplikaat; stel, afhankelijk van de analysesoftware, de pre- en post-start- en stopparameters in rond de overgangen van de smeltcurve.Stel de parameters in voor het begin en het einde van de premelt, zodat het verschil tussen deze twee 0,2 tot 0,5 °C bedraagt. Stel op soortgelijke wijze het begin en het einde van de postmelt in en extraheer de gegevens van het temperatuurverschil van de piek voor elk monster met behulp van percentages van gemethyleerde standaarden en hun bijbehorende temperatuurverschillen van de piek.Genereer een lineaire regressievergelijking. Gebruik deze lineaire regressievergelijking om de methyleringsstatus van onbekende monsters te schatten, nadat de relevante CpG-eilanden zijn geïdentificeerd en het CpG-eiland Luke two-plasmide is geamplificeerd en gekloneerd volgens het tekstprotocol. Gebruik preferred cutter-software om de sites voor de restrictieverdijsting te verifiëren om dubbele knippen te voorkomen en lineariseer 30 µg plasmide zodra het monster met de juiste enzymen is verteerd.Inactieveer enzymen door verhitting bij de juiste temperatuur en duur in reacties van 50 µL. Gebruik vijf eenheden CPG-methyltransferase voor methylering. Gebruik 700 µg gelineariseerde plasmiden bij 30 °C gedurende 13 tot 19 uur.Na het reinigen van het DNA zoals beschreven in het tekstprotocol, wordt een HPA II-restrictiedigest uitgevoerd op monsters van één microgram gemethyleerd DNA door incubatie bij 37 °C gedurende één uur. Na het reinigen van het DNA worden de monsters 45 minuten lang bij 100 volt gerun op een 1% agarose-DNAgel voor visualisatie. Vervolgens worden gemethyleerde en niet-gemethyleerde plasmiden overnacht onderworpen aan dubbele digestie met geschikte restrictie-enzymen om het volledige Luke 2-vector- en CpG-eilandfragmenten vrij te maken.Inactiveer de enzymen door verhitting na de digestie. Run de dubbel gedigesteerde monsters op een 1% DNA-agarosegel bij 100 volt gedurende één uur om de vector en het insert te scheiden. Plaats de gel vervolgens, terwijl u UV-bescherming draagt, onder een UV-lamp en snijd met schone chirurgische scalpels de gemethyleerde en niet-gemethyleerde inserts uit. Nadat het DNA volgens het tekstprotocol uit de gel is geëxtraheerd, gebruikt u T4 DNA-ligase en een ratio van één tot vier vector ten opzichte van insert om de gemethyleerde en niet-gemethyleerde inserts in een niet-gemethyleerde vector te ligeren. Incubeer na de ligatie overnacht bij -20 °C of op ijs.Zuiver het DNA en verifieer de herligatie door monsters op een 1% DNA-agarosegel te laden en bepaal de concentratie van het hergeligeerde plasmide. Zaai CD 54-cellen uit op een 12-wellplaat met 140.000 cellen per well. Na 24 uur wordt een commercieel transfectiereagens gebruikt om de cellen te transfecteren met gelijke concentraties van het niet-gemethyleerde CpG-loop 2-plasmide plus REN-vanilla of een andere controle-luciferasevector, of het gemethyleerde CpG-loop 2-plasmide plus ELLA of een andere controle-luciferasevector. Laat de cellen 24 uur transfecteren voordat een luciferase-assay wordt uitgevoerd.Gebruik volgens de instructies van de fabrikant een luminometer om elke well in triplikaat uit te lezen. Bereken de ratio van de firefly luciferase-activiteit ten opzichte van ran vanilla of een andere controle van de luciferase-activiteit.Normaliseer de gemethyleerde vuurvlieg-controleluciferase-activiteit ten opzichte van de niet-gemethyleerde vuurvlieg-controleluciferase-activiteit door de gemethyleerde activiteit te delen door de gemethyleerde luc-activiteit. Zoals hier gedemonstreerd, werd een verrijkte populatie astrocyten verkregen via FACS-sortering van E-G-F-P-S 100 beta transgene dieren. Er werd een gated populatie geselecteerd op basis van forward en side scatter, en een levende celpopulatie werd bepaald met behulp van een bromide-dead cell-indicator; de hier getoonde gating bevat representatieve beelden van EGFP-positieve astrocyten na dissociatie, maar vóór de sortering, alsook na de sortering. Deze figuur toont een geïsoleerde EGFP-positieve celpopulatie die een 40-voudige toename in mRNA voor de astrocytspecifieke marker vertoonde.Een LDH 1:1. Daarnaast werd, ondanks de gedeelde expressie van S100 bèta en NG2 in positieve OPC's en astrocyten, een viervoudige afname in NG2 mRNA waargenomen, een marker voor oligodendrocyt-precursorcellen, wat duidt op de isolatie van een verrijkte astrocytaire celpopulatie. Deze tabel vermeldt het totaal aan RNA en DNA, geïsoleerd van dieren van verschillende leeftijden en aantallen, en dient als referentie voor de verwachte opbrengst van moleculen na extractie.Ten slotte werd een duale luciferase-assay gebruikt om de transcriptionele activiteit van hypergemethyleerde regio's van het gen van belang te beoordelen, nadat het gemethyleerde insert in een niet-gemethyleerde vector was overgebracht. HPA II, dat alleen niet-gemethyleerd DNA verteert, werd gebruikt om de methyleringsstatus van het plasmide te verifiëren. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een verrijkte populatie astrocyten kunt isoleren met behulp van FACS, evenals hoe u de DNA-methylering van een gen kunt meten en veranderingen in de DNA-methylering van de promotor kunt correleren met de transcriptionele activiteit, respectievelijk met behulp van methyleringsgevoelige high-resolution melt-analyse en een luciferase-assay.

correlating-gene-specific-dna-methylation-changes-with-expression

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Een gestroomlijnde workflow om DNA-methylatie en expressie van genen veranderingen te bestuderen op de jeugd stress wordt weergegeven. Vanaf moeder scheiding van pasgeboren muizen en isolatie van discrete hersenweefsel vertegenwoordigen wij een protocol van DNA en RNA tegelijk isoleren van hersenweefsel ponsen voor latere bisulfiet sequencing en RT-PCR analyse.

Geoptimaliseerd Analyse van DNA-methylatie en Gene Expression uit kleine, anatomisch gedefinieerde gebieden van de hersenen

De bereiding van acute hersenplakjes van hippocampi geïsoleerd, evenals de gelijktijdige elektrofysiologische opnames van astrocyten en neuronen...

Dubbele Elektrofysiologische Opnames van synaptisch-opgeroepen astrogliale en Neuronale responsen bij acute hippocampus Slices

Deze studie beschrijft de procedures van het opzetten van een nieuwe neuronale axon en (astro) glia co-cultuur platform. In deze co-cultuur systeem, manipulatie van directe interactie tussen een axon (en single gliale cel) wordt het mogelijk, waardoor mechanistische analyse van de wederzijdse neuron naar gliale signalering.

Imaging Analyse van de Neuron tot Glia Interactie in Microfluïdische Cultuur Platform (MCP)-gebaseerde Neuronale Axon en Glia Co-cultuur systeem

Hier beschrijven we een aanpassing van de protocollen voor homeostatische plasticiteit induceren in neuronen voor de studie van plasticiteit van astrocytaire G-proteïne gekoppelde receptoren. Onlangs gebruikt om wijzigingen in astrocytaire I mGluRs bij jonge muizen te onderzoeken, kan de werkwijze worden toegepast voor de schaal van verschillende astrocytaire GPCRs meten in weefsel van volwassen muizen in situ en in vivo, en een betere waardering van de gevoeligheid van astrocytaire receptoren...

Inducerende Plasticiteit van astrocyten receptoren door Manipulatie van neuronale tarieven

De eigenschappen en functies van astrocytenintracellulaire Ca2+ signalen in het striatum blijven onvolledig onderzocht. We beschrijven methoden om genetisch gecodeerde calciumindicatoren in striatale astrocyten tot expressie te brengen met behulp van adeno-geassocieerde virussen van serotype 2/5 (AAV2/5), evenals procedures om Ca2+ signalen binnen striatale astrocyten in situ betrouwbaar te beeldhouwen.

Imaging intracellulaire Ca 2+ Signalen in Striatale Astrocyten van volwassen muizen met behulp van genetisch gecodeerd Calcium Indicatoren

Het doel van dit protocol is om de techniek van fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) te gebruiken om specifieke typen neurale cellen te sorteren voor daaropvolgende analyse van celtype-specifieke genexpressie, epigenetische markers en/of eiwitexpressie.

Met behulp van fluorescentie-geactiveerde Cell Sorting voor Onderzoek Cell-type-specifieke genexpressie in Rat Brain Tissue

Het doel van dit verslag is om te beschrijven van het protocol voor robuuste immunohistochemische detectie van epigenetische markers, 5-methylcytosine (5mC) en 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) bij de ontwikkeling en postmitotic muis netvlies.

Immunohistochemische detectie van 5-Methylcytosine en 5-Hydroxymethylcytosine bij de ontwikkeling en Postmitotic muis Retina

Astrocyten betegelen de hersenschors uniform, waardoor de analyse van hun complexe morfologie uitdagend is op cellulair niveau. Het protocol dat hier wordt verstrekt, maakt gebruik van multicolor-etikettering op basis van in utero-elektroporatie om corticale astrocyten uit te schakelen en hun volume en morfologie te analyseren met een gebruiksvriendelijke pijplijn voor beeldanalyse.

In Utero Electroporation of Multiaddressable Genome-Integrating Color (MAGIC) Markers om Cortical Mouse Astrocytes te individualiseren

Dit artikel introduceert een protocol voor het gebruik van DeepSpaceDB, een dynamische, interactieve database voor ruimtelijke transcriptomics, die analyseworkflows en voorbeelden biedt om weefselorganisatie en ziektegerelateerde genexpressie te onderzoeken.

Mining Spatial Transcriptomics-datasets met behulp van DeepSpaceDB

Dit protocol biedt een uitgebreide beschrijving van een methode voor het gelijktijdig registreren van calciumsignalen van neuronen en astrocyten over meerdere geheugengerelateerde hersengebieden en demonstreert de toepassing ervan tijdens een leer- en geheugengedragsparadigma.

Een tweekleurige vezelfotometriemethode voor het registreren van activiteit van astrocytenneuronen over meerdere hersengebieden tijdens leer- en geheugengedrag

Leer DNA-methylatieanalyse van KCNJ10 in astrocyten met MS.HRMA en luciferase-assays. Deze methode correleert epigenetische veranderingen met transcriptieactiviteit voor neurowetenschappelijk onderzoek.

Correleren Gen-specifieke DNA-methylatie Wijzigingen met Expression en transcriptionele activiteit van de astrocyten KCNJ10 (Kir4.1) (Video) | JoVE Journal

Correleren Gen-specifieke DNA-methylatie Wijzigingen met Expression en transcriptionele activiteit van de astrocyten

Meer video's verkennen