Correleren Gen-specifieke DNA-methylatie Wijzigingen met Expression en transcriptionele activiteit van de astrocyten KCNJ10 (Kir4.1)

Het algemene doel van deze procedure is om de DNA-methylatiestatus van KCNJ 10 te beoordelen in een verrijkte populatie van astrocyten en DNA-methylatiewijzigingen van de promotor te correleren met transcriptionele optionele activiteit. Dit wordt bereikt door eerst een verrijkte populatie van corticale astrocyten te isoleren uit het hele knaagdierbrein via facts sorting, waarna DNA wordt geïsoleerd uit de verrijkte populatie van astrocyten. Vervolgens wordt de DNA-methylatiestatus van KC J 10 beoordeeld door methylatiegevoelige hoge resolutie smeltanalyse of MS.HRMA te gebruiken.

Ten slotte wordt de KC J 10-promotor gehypermethyleerd en wordt een lucifers-assay gebruikt om veranderingen in DNA-methylatie van de promotor te correleren met transcriptionele activiteit. Uiteindelijk worden MS.HRMA en de luciferase-assay gebruikt om de DNA-methylatiestatus van KCNJ 10 te meten en veranderingen in de methylatie van de promotor en transcriptionele activiteit van het gen te correleren. Het uitvoeren van de procedure zal worden gedemonstreerd. Een postdoctoraal onderzoeker uit mijn laboratorium, Alle dieren werden behandeld in overeenstemming met de richtlijnen van de National Institutes of Health, het Animal Care and Use Committee aan de Universiteit van Alabama in Birmingham keurde het gebruik van dieren goed.

Alle buffers en reagentia werden volgens het tekstprotocol bereid. Na het disseceren van de cortices van het hoofd van een geëuthanaseerd dier, volgens het tekstprotocol, snijd of dremel een gat in de bovenkant van een 50 milliliter conische buis om slangen in de buis te voeren. Voeg vervolgens een papine-oplossing toe aan de buis.

Plaats de gedissecteerde cortices in een 10 millimeter kweekschaal met dissociatiemedium geëquilibreerd tot 95%O2 tot 5%CO2 en gebruik een schone scheermes om het weefsel in stukken van één bij één vierkante millimeter te snijden. Met een 10 milliliter pipet breng je het weefsel over naar de 50 milliliter buis met de pepane-oplossing. Laat het weefsel naar de bodem van het overdrachtspipet zinken voordat je het loslaat.

Om de hoeveelheid dissociatiemedium die overgebracht wordt zonder dat er luchtbellen in de pepane-oplossing ontstaan, te minimaliseren, breng je een constante stroom van 95%O2 tot 5%CO2 aan via oppervlaktegasuitwisseling terwijl je in een 37 graden Celsius waterbad gedurende 20 minuten incubeert. Na de incubatie, gebruik je een 10 milliliter overdrachtspipet om het weefsel langzaam 10 keer te mengen centrifugeer de troebele celsuspensie bij 300 G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Breng de DNA's albumine-remmeroplossing in evenwicht via oppervlaktegasuitwisseling en suspendeer de gepelletiseerde cellen in drie milliliter van de oplossing.

Bereid vervolgens een commercieel discontinu dichtheidsgradiënt volgens de instructies van de fabrikant. Draai de discontinu dichtheidsgradiënt gedurende zes minuten op 70 G. Vervolgens isoleer je de gedissocieerde cellen van de bodem van de buis door een pipet te gebruiken om media af te zuigen.

Gebruik twee tot drie milliliter DPBS met 0,02% bovijn serumalbumine en één milligram per milliliter DNA of voorkeursmedium. Om de gedissocieerde cellen te hergebruiken, suspendeer je de cellen. Laat de cellen door een 40 microgram filter gaan voordat je facts sorting en DNA- of RNA-extractie uitvoert volgens het tekstprotocol.

Nadat je primers hebt ontworpen tegen een bi-sulfiet geconverteerde DNA-sequentie en het DNA hebt geamplificeerd volgens het tekstprotocol door 500 tot 1000 nanogram DNA van elk monster en gemethyleerd DNA-standaarden variërend van nul tot 100% van dezelfde diersoort te sulfiet converteren met behulp van een voorkeurs-DNA-polymerase en vijf micromolar primers. Zet 20 microliter reacties op voor Ms HRM-amplificatie. Volgens deze tabel, voer alle monsters inclusief fax, DNA en gemethyleerde standaarden in drievoudig uit, afhankelijk van de analysesoftwareset, pre en post start en stop parameters rond de overgangen van de smeltcurve.

Stel de prem smelt, start en prem smelt stop parameters in. Het verschil tussen de twee is 0,2 tot 0,5 graden Celsius. Stel post smelt, start en stop op een vergelijkbare manier in en extraheer de temperatuurverschilgegevens voor elk monster met behulp van procent gemethyleerde standaarden en hun overeenkomstige temperatuurverschillen.

Genereer een lineaire regressievergelijking. Gebruik deze lineaire regressievergelijking om de methylatiestatus van onbekende monsters te schatten na het identificeren van CPG-eilanden van belang en het amplificeren en klonen van CPG-eiland Luke twee plasmide volgens het tekstprotocol. Gebruik voorkeurscuttersoftware om sites voor restrictiedigestie te verifiëren om dubbele sneden te voorkomen en lineairiseer 30 microgram plasmide nadat het monster is gedigesteerd met de juiste enzymen.

Verwarm inactieve enzymen bij de juiste temperatuur en duur in 50 microliter reacties. Gebruik vijf eenheden CPG methylaat om te methyleren. 700 microgram gelineaireerde plasmiden bij 30 graden Celsius gedurende 13 tot 19 uur.

Na het reinigen van het DNA zoals beschreven in het tekstprotocol, voer een HPA twee restrictiedigestie uit op een microgram monsters van gemethyleerd DNA door incubatie bij 37 graden Celsius gedurende een uur. Na het reinigen van het DNA, draai monsters op een 1% agros DNA-gel bij 100 volt gedurende 45 minuten voor visualisatie. Onderwerp vervolgens gemethyleerde en niet-gemethyleerde plasmiden aan dubbele digestie met geschikte restrictie-enzymen gedurende de nacht om de volledige lengte Luke twee vector en CPG-eilandfragmenten vrij te maken.

Verwarm de enzymen in na de digestie. Draai de dubbel gedigesteerde monsters op een 1% DNA agros gel bij 100 volt gedurende een uur om vector en insert te scheiden, vervolgens, terwijl je bescherming tegen UV-licht draagt, plaats je de gel op een zwarte lamp en snij je met schone chirurgische messen de gemethyleerde en niet-gemethyleerde inserts uit na gelextractie van het DNA volgens het tekstprotocol, gebruik T vier DNA Ligase en een verhouding van vector tot insert van één tot vier om de gemethyleerde en niet-gemethyleerde inserts te religeren in een niet-gemethyleerde vector. Incubeer bij negentig twintig graden Celsius of op ijs gedurende de nacht na de ligatie.