Onderzoek van Rapid Dopamine Dynamics met Fast scan cyclische voltammetrie Tijdens intra-orale Tastant Administration in Awake Rats
12 augustus 2015
Snelle schommelingen in extracellulair dopamine (DA) bemiddelen zowel beloningsverwerking als gemotiveerd gedrag bij zoogdieren. Dit manuscript beschrijft het gecombineerde gebruik van snelle scancyclische voltammetrie (FSCV) en intra-orale toediening van smaakstoffen om te bepalen hoe smaakstoffen de snelle dopamine-afgifte bij wakkere, vrij bewegende ratten veranderen.
Het algemene doel van deze procedure is om dopaminereacties in subseconden op orale smaak te meten. Dit wordt bereikt door eerst orale katheters, referentie-elektroden en koolstofvezelelektroden te maken die nodig zijn voor de chirurgische ingrepen en de daaropvolgende registratie via snelle scancyclische V-telemetrie. De tweede stap is om de orale katheters, de intracraniale elektrode en de geleidecanule voor de koolstofvezelelektrode chirurgisch te implanteren.
Een week later kan de koolstofvezel micro-elektrode in de nucleus accumbens worden neergelaten om veranderingen in extracellulaire dopamine-afgifte te registreren als reactie op intraorale toediening van smaken. De laatste stap na de registratie is om de elektrode te kalibreren en om hoofdcomponentenanalyse te gebruiken om gegevens te isoleren die informatie bevatten over dopamine. Uiteindelijk wordt de gecombineerde toepassing van intraorale smaak en toediening en snelle scancyclische vol-telemetrie gebruikt om veranderingen in dopaminereacties in subseconden op taten te tonen.
Er zijn twee belangrijke voordelen van deze gecombineerde techniek ten opzichte van bestaande methoden. Ten eerste heeft snelle IC-fotometrie een hoge tijdelijke resolutie en ten tweede minimaliseert intraorale toediening van taten de beweging die de rat moet maken om de tatin te verkrijgen en stelt ons in staat om dopaminereacties op de tatin beter te isoleren. Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn met deze methode worstelen met het fabriceren van de orale katheter.
Het construeren van een goede en betaalde orale katheter zal echter zorgen voor een goede pasvorm van de katheter tussen de wang en de bovenste kiezen en de kans op een succesvol experiment vergroten. Om de opname-elektrode voor te bereiden, zuigt u eerst een T zes 50 koolstofvezel met een diameter van zeven micron in een bora sili kaatglazen capillair met een binnendiameter van 0,4 millimeter. Plaats vervolgens de capillair in een verticaal elektrodenpool, trek in eerste instantie met een verwarmer ingesteld op 55,0 en de magneet uit, en pas vervolgens aan zoals nodig.
Nadat de pipet onder een microscoop is getrokken, snijdt u het blootgestelde koolstofvezel zodat het 75 tot 100 micron verder reikt dan het glas. Het vezel in het glas moet goed worden afgedicht, anders moet de voorbereiding worden weggegooid. Strip vervolgens de isolatie van de helft van een drie inch 30 gauge draad, breng heat shrink aan om de elektrode aan de micromanipulator te bevestigen.
Breng vervolgens een dunne laag zilververf aan op de draad terwijl de verf nog nat is. Steek de draad in het open uiteinde van de elektrode en bevestig deze aan het koolstofvezel daarin. Controleer deze contact onder een microscoop.
Neem de elektrode in de micromanipulator en zet deze vast met heat shrink. Plaats de voorbereide koolstofvezelelektrode in IPA gedurende ten minste 10 minuten om het elektrodeoppervlak te reinigen en de gevoeligheid voor dopamine te verhogen. Nadat de elektrode uit IPA is verwijderd, spoelt u het koolstofvezel met kraanwater om de IPA te verwijderen.
Bereid vervolgens de referentie-elektrode voor vanuit een 13 millimeter zilverdraad met een zes millimeter zilver, zilverchloride gaas met een diameter van 0,4 millimeter, snijd het niet-geweven gedeelte van de draad af en soldeer het aan een gouden pin. Breng vervolgens epoxy aan op de soldeer. Dompel vervolgens het gaasgedeelte vijf keer in een copolymere zuur.
Laat het 30 minuten in de lucht drogen tussen de duiken na de laatste duik. Laat het 's nachts drogen. De volgende dag.
Bakken de gaasgedeelte van de draad gedurende een uur op 120 graden Celsius. Om de orale katheter te maken, snijdt u eerst polyethyleen 100-buis in segmenten van zes centimeter.
Maak vervolgens een kleine platte schijf bij een van de buissegmenten door het uiteinde te smelten en het op een vlakke koele oppervlakte in het midden van de schijf te drukken. Gebruik een 18 gauge naald om een gat te maken. Bevestig het andere uiteinde van het buissegment aan het stompe uiteinde van een 18 gauge naald.
Maak vervolgens met een pons verschillende stukken polytetrafluorethyleen met een diameter van zes millimeter en een dikte van 3,18 millimeter. Maak vervolgens in het midden van deze schijven een gat, waardoor de schijven in sluitringen worden omgezet. Snijd de sluitring in een trapeziumvorm om ze tijdens de implantatie van de kies te helpen vastzetten.
Om de katheter te voltooien, duwt u een naald die is bevestigd aan PE-buis volledig door de sluitring en schuift u de sluitring vlak tegen de buis. Het volgende protocol duurt ongeveer 75 minuten om te voltooien. Begin met een rat die klaar is voor de operatie en open zijn mond met een wattenstaafje.
Duw vervolgens de naald op een canule in het weefsel tussen de wang en de eerste bovenste kies, zodat de naald net achter en mediaal van de oren uitkomt. Verplaats vervolgens de canule en bevestig de sluitring aan de kiezen om de katheter op het blootgestelde naald te bevestigen. Schuif een sluitring en breng deze strak naar de incisie.
Bevestig deze sluitring in positie. Knip de buis zodat er twee tot vier centimeter boven het hoofd van de rat blijft blootliggen. Gebruik vervolgens dezelfde techniek om een katheter in de andere kant van de mond te plaatsen.
Hierop volgend, plaats de rat in een stereotaxische frame en boor drie gaten voor de canules en elektroden om registraties te maken in de nucleus accumbens kernpositie. De geleidecanule 1,2 millimeter anterieur en 1,4 millimeter. Lateraal torema.
Laat het canula-apparaat zakken totdat de plastic basis vlak is met de schedel. Plaats de referentie-elektrode in het tegenoverliggende halfrond van de geleidecanule. Laat de referentie ongeveer twee millimeter onder de dura zakken.
Plaats vervolgens de stimulerende elektrode, 5,2 millimeter posterior en 1,0 millimeter lateraal torema. Om het ventrale tegmentale gebied te targeten. Laat de stimulerende elektrode 8,0 millimeter onder de dura
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie onderzoekt hoe orale smaakstoffen de snelle afgifte van dopamine beïnvloeden bij wakke, vrij bewegende ratten. Met behulp van fast scan cyclic voltammetry (FSCV) beoogt het onderzoek subseconde dopamine-responsen op smaakstimuli te meten.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Gedragswetenschap
- Elektrofysiologie
Achtergrond
- Dopamine speelt een cruciale rol bij beloningsverwerking en gemotiveerd gedrag.
- Het begrijpen van de dopamine-dynamiek kan inzicht verschaffen in gedragsreacties op stimuli.
- Fast scan cyclic voltammetry maakt real-time meting van de afgifte van neurotransmitters mogelijk.
- Orale smaakstoffen kunnen dienen als effectieve stimuli voor het bestuderen van dopamine-afgifte.
Doel van de studie
- Om snelle dopamine-responsen op orale smaakstoffen te meten.
- Om de relatie tussen smaakstimuli en dopaminevrijgave te onderzoeken.
- Om geavanceerde technieken te gebruiken voor de nauwkeurige meting van neurotransmitterdynamiek.
Gebruikte methoden
- Vervaardiging van orale katheters en elektroden voor registratie.
- Chirurgische implantatie van elektroden en leidingscanulae.
- Registratie van dopaminevrijgave in de nucleus accumbens.
- Kalibratie van elektroden en data-analyse met behulp van principale componentenanalyse.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle meting van subseconde dopamine-responsen op intraorale smaakstoffen.
- Aangetoonde veranderingen in dopamine-afgiftepatronen als reactie op smaakstimuli.
- Inzichten verschaft in de dynamiek van dopamine in relatie tot beloningsverwerking.
- Validatie van het gebruik van FSCV in wakke, vrij bewegende ratten voor het bestuderen van dopamine-afgifte.
Conclusies
- De studie benadrukt de impact van orale smaakstoffen op de dopaminedynamiek.
- FSCV is een effectieve methode voor de real-time meting van de afgifte van neurotransmitters.
- De bevindingen dragen bij aan het begrip van de neurochemische basis van beloning en motivatie.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Leidinggevenden
Deze methode maakt directe meting van subseconde dopamine-dynamiek in reactie op orale smaakstoffen mogelijk, waardoor verwarrende beloningsgerichte gedragingen worden omzeild. Het biedt een mechanistisch instrument voor risicoreductie bij de validatie van targets in beloningsgerelateerde pathways door primaire stimulusresponsen te isoleren van motorische of leergerelateerde confounders. De aanpak ondersteunt de voorspellende betrouwbaarheid in vroege ontdekkingsfasen door fasische dopaminevrijgave te kwantificeren als translationele biomarker voor orale bekrachtigingsmechanismen.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door dopamineafgifte te meten die specifiek gekoppeld is aan primaire smaakstimulatie, waardoor mechanistische ambiguïteit bij het onderzoeken van beloningspaden wordt verminderd.
- Operationele waarde: Maakt functionele targetvalidatie mogelijk via real-time, subseconde neurotransmitter-read-outs in wakker animals, wat bijdraagt aan de biologische risicoreductie van targets die betrokken zijn bij orale bekrachtiging.
- Voorspellende waarde: Genereert kwantitatieve, tijdgekoppelde dopamineconcentratiegegevens die kunnen bijdragen aan lead-identificatie en portfoliotriage voor verbindingen die gericht zijn op gustatoire beloningspaden.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Bereidt gevalideerde biologische systemen (nucleus accumbens in wakker ratten) voor op downstream compound screening door een reproduceerbaar platform te vestigen voor het detecteren van snelle dopamine-fluctuaties.
- Kwantitatieve output: Produceert concentratie-versus-tijdprofielen via FSCV en PCA, wat gestandaardiseerde, schaalbare meting van stimulus-opgewekte dopamine-afgifte mogelijk maakt voor assay-optimalisatie.
- Relevantie voor screening: Ondersteunt een betrouwbare evaluatie van compounds door dopamine-responsen op orale stimuli te isoleren van artefacten gerelateerd aan beweging of leren, waardoor de signaal-ruisverhouding in preklinische smaak-beloningsassays wordt verbeterd.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Verbindt dopaminestroom-dynamiek in de ontdekkingsfase met preklinische validatie door gebruik te maken van ziekterelateerde orale stimuli (bijv. sucrose, menthol) die de menselijke gustatoire beloningsverwerking modelleren.
- Mechanistische risicoreductie: Verduidelijkt of de waargenomen veranderingen in dopamine direct door de smaakstof worden aangestuurd, waardoor fout-positieven in target-engagementstudies worden verminderd en risico-gecorrigeerde beslissingen voor verdere ontwikkeling worden ondersteund.
- Afstemming van biomarkers: Positioneert fasische dopamineafgifte als een potentiële translationele biomarker voor orale bekrachtiging, in overeenstemming met klinische eindpunten in onderzoek naar voedingsgedrag en verslaving.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van hypothesetoetsing tot leadidentificatie, in het bijzonder voor targets die orale beloning en motivatie moduleren, door vroege mechanistische readouts te leveren die voorafgaan aan het testen van de gedragseffectiviteit.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en pathway-verheldering door de afgifte van dopamine in de nucleus accumbens core te meten als reactie op gedefinieerde orale stimuli, waardoor targets in mesolimbische pathways kunnen worden gede-riskt.
- Screening: Zorgt voor assay-gereedheid via gestandaardiseerde protocollen voor elektrode-implantatie en kalibratie, wat reproduceerbare dopamine-metingen garandeert over verschillende sessies van compound-testen.
- Analytics: Maakt gebruik van principale componentenanalyse om dopamine-specifieke signalen te isoleren van achtergrondruis, wat kwantitatieve readouts genereert die een vergelijking tussen condities van stimulus-evokeerde afgifte mogelijk maken.
- Translationeel Onderzoek: Bevordert de preklinische continuïteit door intraorale infusie te gebruiken om menselijke smaakstimulatie te modelleren, waarbij acute dopamine-responsen worden gekoppeld aan langetermijnprocessen van reinforcement learning.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar chirurgisch en registratieplatform dat toepasbaar is op meerdere tastanten, compounds of genetische modellen, waardoor redundante validatie-inspanningen worden verminderd.
Operationele impact & impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Biedt voorspellend vertrouwen bij target-validatie door primaire dopaminerge reacties op orale stimuli te isoleren, waardoor ambiguïteit in de modulatie van beloningspaden wordt verminderd.
- Operationele waarde: Garandeert standaardisatie en reproduceerbaarheid via gedefinieerde stappen voor elektrodevoorbereiding, chirurgische implantatie en kalibratie, wat consistentie tussen laboratoria mogelijk maakt.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door vroege, mechanisme-gebaseerde read-outs te leveren over target-engagement in beloningscircuits, waardoor biologische risico's in een laat stadium bij de ontwikkeling van neuropsychiatrische geneesmiddelen worden verminderd.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering mogelijk van verbindingen die invloed hebben op orale beloningspaden via kwantitatieve, temporeel opgeloste dopaminegegevens die mechanische risicoreductie ondersteunen.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in stereotaxische chirurgie, de fabricage van elektroden en fast scan cyclic voltammetry om de signaalkwaliteit en het dierenwelzijn te waarborgen.
- Is afhankelijk van gespecialiseerde instrumentatie, waaronder potentiostaten, koolstofvezelelektroden, referentie-elektroden en microfluïdische infusiesystemen voor intraorale toediening.
- Maakt standaardisatie tussen de chirurgische, elektrofysiologische en data-analyseteams noodzakelijk om de getrouwheid van de elektroden en de interpreteerbaarheid van het signaal te behouden.
- Omvat overwegingen voor aanpassing bij uitbreiding naar verschillende hersengebieden, typen smaakstoffen of ziektemodellen, waarbij validatie vereist is voor elke nieuwe conditie.
- Praktische beperkingen omvatten de technische uitdaging van de fabricage van orale katheters en de noodzaak van postchirurgische herstelperioden, wat de doorvoer bij grootschalige screeningscampagnes kan beïnvloeden.
Veelgestelde vragen over Biofarmacie
Chapters in this video
0:05
Title
1:56
Fabricating the Electrodes
4:14
Fabricating Oral Catheters
7:16
Taking Voltametric Recordings in Awake, Freely Moving Rats
5:24
Combined Intraoral Surgery and Intracranial Cannulation Surgery
8:52
Results: Tastant Stimulated Dopamine Release Measured in the NAc
10:11
Conclusion
