Ontwikkeling van een Meercellige Driedimensionale Organotypische model van het menselijk darmslijmvlies geteeld onder Microgravity

Het algemene doel van deze procedure is het beschrijven van de ontwikkeling van een multicellulair 3D organotypisch model van de menselijke darmmucosa, gekweekt onder microzwaartekracht geleverd door rotating wall vessel-bioreactoren. Deze methode heeft een breed potentieel als instrument voor ontdekkingen bij zowel gezonde toestanden als ziekten, inclusief interacties met pathogenen, antigeentransport en ontstekingsprocessen.

De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn het nabootsen van de fenotypische diversiteit van de kat en het gebruik van de D-12 vessel bioreactoren, die een efficiënte diffusie van voedingsstoffen en zuurstof mogelijk maken. Begin met het losschroeven van de dop van de vulpoort van het kweekvat en voeg 50 milliliters van ons PMI toe. Zodra het vat is gevuld, plaatst u de dop terug en veegt u eventueel gemorst medium af met 70% ethanol.

Laat het vat ten minste 15 minuten tot overnacht incuberen bij kamertemperatuur. Wanneer u klaar bent om verder te gaan, gebruikt u de vulpoort om het kweekmedium af te voeren en voegt u 30 milliliters van het 3-D kweekmedium toe aan het vat. Plaats de dop terug op de vulpoort en veeg, opnieuw, eventueel gemorst medium af met 70%ethanol.

Verwijder bijna concurrente flessen met menselijke navelstrengader-endotheelcellen en menselijke colonfibroblasten uit de incubator en was deze tweemaal met PBS. Detacheer vervolgens de cellen door ze te bedekken met een 0,25% trypsine-oplossing met 0,05% trypsine-EDTA. Zodra de cellen loslaten, verzamelt u deze in een buis van 50 milliliter die vooraf is gevuld met 30 milliliter DMEM met 30% FBS.

Centrifugeer de buis 10 minuten om de cellen te pelletteren. Resuspendeer de cellen vervolgens in 30 milliliters DMEM met 30% FBS. Verdun daarna 20 microliters van de geresuspendeerde cellen met 20 microliters trypaanblauw-kleurstof.

Vul de hemocytometer met het celmengsel en tel de concentratie levensvatbare cellen. Resuspendeer vervolgens elk celtype op 50 tot 80 miljoen cellen per milliliter in DMEM met 30% FBS. Plaats eerst het juiste aantal kweekinserts in de wells van een six-well plaat.

Bereid vervolgens het collageenmengsel door eerst 10x DMEM, 10x reconstitutiemedium, 200 millimol L-glutamine en hitte-geïnactiveerd FBS aan een conische buis van 50 milliliter toe te voegen. Voeg daarna bovine collageen type I, laminine, collageen type IV, fibronectine, heparinsulfaatproteoglycaan toe en voeg tot slot natriumhydroxide toe om de pH van de oplossing te neutraliseren. Als het mengsel op enig moment een geelachtige, zure aanblik krijgt, voeg dan een paar druppels steriel 1 normaal natriumhydroxide toe om het mengsel te neutraliseren.

Sluit de buis en meng de oplossing door deze meerdere keren om te keren, waarbij belvorming wordt vermeden. Houd de oplossing op ijs wanneer er niet wordt gemengd om polymerisatie te voorkomen. Voeg na het mengen de celsuspensies toe aan de collageenpreparatie en meng de buizen door ze voorzichtig enkele keren om te keren om belvorming te voorkomen.

Plaats ze vervolgens terug op het ijs. Voeg vier tot vijf milliliter van de collageenoplossing met cellen toe aan elke insert en laat het collageen gedurende één uur in de zuurkast geleren, waarbij minimale of geen beweging plaatsvindt. Na één uur wordt de zes-wellplaat gedurende één tot twee extra uren in een incubator geplaatst.

Plaats de plaat vervolgens terug in de weefselkweekkap en gebruik een steriele pincet en een scalpel om het membraan aseptisch uit de insert te snijden. Los de celbevattende gel los van het membraan en snijd de losgemaakte gel vervolgens in kleine vierkantjes. Voeg de kleine celbevattende collageenvierkantjes toe aan een van de vooraf gevulde 50 milliliter vaten via de vulpoort.

Bereid vervolgens een suspensie van HCT-8 menselijke epitheelcellen voor zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Resuspendeer de cellen op een concentratie van 10 miljoen cellen per milliliter in DMEM met 30% FBS. Voeg daarna één milliliter van de HCT-8 cel-suspensie toe aan het 50 milliliter vat via de vulpoort.

Voeg na het toevoegen van de cellen nog eens 20 milliliters 3-D kweekmedium toe aan het vat, zodat deze bijna vol is. Plaats de dop terug en bevochtig de rand van de vulpoort met 70%ethanol. Plaats vervolgens een spuit van vijf milliliter met drie tot vier milliliters 3-D kweekmedium in één poort van het vat en een lege spuit van vijf milliliter in de andere poort.

Verwijder alle zichtbare luchtbellen door deze in de lege spuit te trekken, terwijl ongeveer hetzelfde volume medium via de andere spuit in het vat wordt geïnjecteerd. Nu alle lucht is verwijderd, worden de vaten in de bioreactor geplaatst, de voeding ingeschakeld en de snelheid ingesteld op 13 tot 14 omwentelingen per minuut. Pas de snelheid indien nodig aan om te voorkomen dat de cellen de wanden van het vat raken.

Kweek de cellen onder microzwaartekracht en vervang het kweekmedium elke drie tot vier dagen. Gebruik om het medium te vervangen de dubbele spuitmethode om ongeveer 30 milliliters van het gebruikte medium te vervangen door vers 3-D kweekmedium. Isoleer na drie tot vijf dagen kweek de mononucleaire cellen uit perifeer bloed zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol.

Verwijder vervolgens het vat uit de bioreactor en voeg via de vulpoort ongeveer 20 miljoen cellen, bestaande uit lymfocyten en monocyten, toe aan de vaten. Plaats de vaten terug in de bioreactor en kweek deze nog vier tot zes dagen. Voeg rond dag negen van de kweek een extra 20 miljoen cellen, bestaande uit lymfocyten en monocyten, toe aan het vat en zet de kweken voort voor maximaal 12 aanvullende dagen.

Gebruik aan het einde van het experiment een transferpipet om elk klein gelfragment, nu een construct genoemd, te oogsten en plaats deze in de putjes van een zesputjesplaat met 10 milliliters 10% formalinebuffer. Fixeer de constructen gedurende drie uur bij kamertemperatuur en ga vervolgens verder met standaard histologische protocollen voor embedding, coupesnijden en kleuring. De in deze video gepresenteerde methoden produceren een multicellulair 3-D organotypisch model van het menselijke darmmucosa.

In microgravitatiekweek raken cellen goed gedifferentieerd en vormen ze tegen dag 20 geordende, villus-achtige structuren. Zodra deze techniek onderbeheersing is, kan deze in zes uur worden uitgevoerd, mits deze correct wordt uitgevoerd. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de richtlijnen voor goede celkweek strikt na te leven.

Het is cruciaal om cellen systematisch te controleren op levensvatbaarheid, mycoplasma-contaminatie en veranderingen in het celgroeigedrag. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals immunohistochemie, worden uitgevoerd om markers voor lineage en celdifferentiatie te identificeren. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een multicellulair 3-D organotypisch model van het menselijke darmslijmvlies ontwikkelt, gekweekt onder microzwaartekracht.