Name: Ontwikkeling van een Meercellige Driedimensionale Organotypische model van het menselijk darmslijmvlies geteeld onder Microgravity (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Leer hoe je een meercellig 3D-organotypisch model van het menselijk darmslijmvlies ontwikkelt onder microgravitatie met behulp van RWV-bioreactoren. Deze methode bootst in vivo-omstandigheden na voor onderzoek naar gezondheid en ziekte.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door NIAID, NIH, DHHS federale onderzoekssubsidies R01 AI036525 en U19 AI082655 (CCHI) aan MBS en door NIH-subsidie DK048373 aan AF. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële opvattingen van het National Institute of Allergy And Infectious Diseases of de National Institutes of Health.

Ethiek statement: Alle bloedmonsters werden verzameld uit vrijwilligers die deelnamen aan protocol nummer HP-00.040.025-1. De Universiteit van Maryland Institutional Review Board goedkeuring van dit protocol en toestemming gegeven voor de inzameling van bloedmonsters van gezonde vrijwilligers voor de studies in dit manuscript. Het doel van deze studie werd uitgelegd aan vrijwilligers, en alle vrijwilligers gaven geïnformeerd ondertekende toestemming voor de bloedafname. Opmerking: Zie tabel 1 voor middelgrote supplement voorbereiding. Zie tabel 2 voor de bereiding van de 3-D kweekmedia. 1. Voorbereiding van Cultuur Schepen <ol><li> Schroef de dop van de vulopening van de ml-schip 50 en vul met 50 ml steriel kweekmedium (bijv., RPMI). Voer alle procedures onder steriele omstandigheden in een laminaire kap. </li><li> Plaats de dop en veeg gemorste medium op elk oppervlak met 70% ethanol. </li><li> Laat het vaartuig incubaten minstens 15 min op O / N bij kamertemperatuur. </li><li> Gebruik de vulpoort aan het kweekmedium verwijderen en voeg 30 ml van 3-D kweekmedium. </li><li> Veeg eventueel gemorste medium op elk oppervlak met 70% ethanol. </li></ol> 2. Bereiding van de cellen <ol><li> Human epitheliale cellijn (HCT-8) 24,40. <ol><li> Kweekcellen in RPMI gesupplementeerd met 100 U / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine, 50 ug / ml gentamicine, 2 mM L-glutamine, 1 mM natriumpyruvaat, 10 mM HEPES buffer en 10% hitte-geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS ) (bijlage 1). Bij 70% confluentie, split cellen bij een verhouding van 1: 5. </li></ol></li><li> Human colon fibroblasten (CCD-18Co cellen) 24,41. <ol><li> Kweekcellen in Basal Eagle&#39;s medium verrijkt met supplement 1 Bij confluentie splitsen cellen in een verhouding van 1:. 3. </li></ol></li><li> Menselijke navelstreng endotheel (HUVEC) cellen <sup&gt; 24,42. <ol><li> Kweekcellen in Endotheliale Basal Medium (EBM) medium aangevuld met 100 ug / ml heparine, 3 ug / ml endotheliale celgroei Supplement (ECGS), en vullen 1 Bij 70% confluentie, split cellen bij een verhouding van 1:. 2. </li></ol></li><li> Lymfocyten / monocyten <ol><li> Isoleer Perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC) uit bloed door dichtheidsgradiënt centrifugering met standaardtechnieken 43. <ol><li> Kort samengevat, met een ml-pipet 10, wordt voorzichtig 30 ml verdund bloed (1: 1 bloed fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)) in een 50 ml conische buis met 10 ml dichtheidscentrifugatie media. Na de centrifugatie stap zal lymfocyten en monocyten bevinden zich in de &quot;witte&quot; laag tussen de dichtheid centrifugatie media en plasma lagen. </li><li> Verzamel de witte laag met behulp van een overdracht pipet. Vermijd granulocyten besmetting door het beperken van het verzamelen van de dichtheid centrifugeren media. Na wassen 43, use PBMC zoals is of gecryopreserveerd in vloeibare N2. Opmerking: Het is van belang te benadrukken dat grotendeels uit PBMC van lymfocyten en monocyten, terwijl een klein deel van dendritische cellen en andere celtypen. </li></ol></li></ol></li><li> Groeien alle cellen onder standaard kweekomstandigheden bij 37 ° C in een atmosfeer van 5% CO2. </li></ol> 3. Bereiding van collageen ingebedde cellen <ol><li> Bepaal het aantal inserts nodig is gebaseerd op het aantal experimentele condities te worden opgezet. Plaats het juiste aantal inserts in de putjes van een 6-wells plaat. </li><li> Maak een suspensie van HUVEC en fibroblasten: <ol><li> Was de kolven tweemaal in PBS en los van de cellen met behulp van trypsine, 0,25% (1x) met 0,05% trypsine-tetranatriumethyleendiaminetetraacetaat (trypsine-EDTA). Voeg genoeg trypsine oplossing voor het geheel van de celkweek oppervlak bedekken. Detachement gebeurt meestal binnen 5 tot 15 minuten </li><li> Verzamelenlosgemaakte cellen in een 50 ml-buis met 30 ml Dulbecco&#39;s gemodificeerd Eagle&#39;s medium (DMEM) -30% FBS medium. </li><li> Centrifugeer de buis bij 500 xg gedurende 10 min. </li><li> Resuspendeer de cellen in 30 ml DMEM-30% FBS medium. </li><li> Tel het aantal levensvatbare cellen door het verdunnen van 20 ul van de geresuspendeerde cellen met 20 pi trypan blauwe kleurstof. Laad de hemocytometer de cel mengsel. Levensvatbare PBMCs wordt wit duidelijk zijn; levensvatbaar PBMC zal de kleurstof verwerven en blauw worden. <ol><li> Resuspendeer elk celtype in DMEM-30% FBS medium in een concentratie van 5-8 x 10 7 cellen ml - 1. </li></ol></li></ol></li><li> Bereid celbevattende collageengels Opmerking: Elk vaartuig de bereiding van ~ 5 ml celbevattende collageengel vereisen. <ol><li> In een 50 ml kegelvormig buisje bereiden collageen mengsel door het toevoegen van 1 x DMEM medium, aangevuld met 50 ug / ml gentamicine, 2 mM L-glutamine en 10% hitte-inactivated FBS plus 3 mg / ml collageen-I, 10 ug / ml laminine, 40 ug / ml collageen IV, 10 ug / ml fibronectine, 2 ug / ml heparine sulfaat proteoglycanen en 15 mM NaOH (tot de fysiologische pH te bereiken). </li><li> Sluit de buis en meng door een paar keer om te keren tot het mengsel volledig is gehomogeniseerd. Vermijd belvorming. BELANGRIJK: Houd het mengsel op ijs om gelvorming te voorkomen. <ol><li> Cruciale stap: Indien het mengsel een zuur ontwikkelt uiterlijk (geelachtige kleur), enkele druppels steriel 1 N NaOH om het mengsel te neutraliseren. </li></ol></li><li> Voeg geconcentreerd HUVEC en fibroblasten bij een dichtheid van 1,0-1,2 en 1,5-2,0 x 10 6 cellen / ml van het verrijkt collageen-mengsel (hierboven beschreven). Sluit de buizen en meng door een paar keer om te keren tot het mengsel volledig is gehomogeniseerd. Vermijd belvorming. BELANGRIJK: Houd het mengsel op ijs om gelvorming te voorkomen. </li><li> Voeg 4-5 ml van de celbevattende collageengel om elke insert, vooraf geladen in een 6 wells plaat en men liet gelify in de kap met weinig of geen beweging 1 uur. </li><li> Na 1 uur en spoel de 6-well plaat een 37 ° C, 5% CO2 incubator 1 - 2 extra uren. </li><li> Zet de 6-well plaat aan de kap, en met behulp van een steriele pincet en scalpel aseptisch afgesneden het membraan van het inzetstuk losmaken van de celbevattende gel van het membraan. Snijd de vrijstaande gel in kleine vierkantjes (~ 5 x 5 mm). </li><li> Voeg de kleine-cel met vierkanten in een 50-ml HARV via de vulpoort. </li></ol></li><li> Maak een suspensie van HCT-8 epitheelcellen: <ol><li> Was de kolven tweemaal in PBS en los de cellen met behulp van trypsine, 0,25% (1x) met trypsine-EDTA behandeling. Voeg genoeg trypsine oplossing voor het geheel van de celkweek oppervlak bedekken. Detachement gebeurt meestal binnen 10 tot 15 minuten. </li><li> Verzamel losgemaakte cellen in 30 ml DMEM-30% FBS medium. </li><li> CENTRIFUGE DMEM-30% FBS medium bevattende buis bij 500 xg gedurende 10 min. </li><li> Resuspendeer de cellen in 30 ml DMEM-30% FBS medium. </li><li> Tel het aantal levensvatbare cellen zoals beschreven in 3.2.5. </li><li> Resuspendeer de HCT-8 epitheelcellen in DMEM-30% FBS medium in een concentratie van 10 7 cellen ml - 1. </li><li> Voeg 1 ml van de geconcentreerde HCT-8 epitheelcellen in de 50 ml HARV via de vulpoort. </li></ol></li><li> Via de vulpoort, voeg extra 3-D kweekmedium tot het vaartuig bijna vol (~ 20 ml). </li><li> Plaats de dop en veeg de lip van de vulling haven met 70% ethanol. </li><li> Plaats een spuit in elke spuit haven van de RWV: plaats een 5 ml-spuit met 3-4 ml 3-D kweekmedium in een poort en een 5 ml-lege spuit in de andere poort. </li><li> Verwijder alle zichtbare luchtbellen door trekken in de lege injectiespuit terwijl ongeveer hetzelfde volume medium wordt geïnjecteerd door de andere spuit poort. </li><li> Plaats de vessel in de bioreactor, zet de kracht en de snelheid tot ongeveer 13 tot 14 omwentelingen per minuut. Let op: Kritische stap: Rotatie snelheid kan het nodig zijn een paar keer aan te passen tijdens een experiment om de cellen een baan in het vat, waardoor het contact met de vaatwanden te voorkomen te behouden. </li><li> Kweekcellen bij 37 ° C, 5% CO 2 onder microzwaartekracht, door de RWV bioreactor. </li><li> Change kweekmedium elke 3-4 dagen door het vervangen van ongeveer 30 ml met verse 3-D kweekmedium. </li><li> Na 4 dagen (± 1 dag), verwijder de schepen uit de bioreactor en voeg lymfocyten / monocyten naar de vaten (2 x 10 7 / vat). </li><li> Plaats de vaten opnieuw in de bioreactor bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende nog eens 5 dagen (± 1 dag). </li><li> Na nog 5 dagen (dag 9 van de cultuur), voeg lymfocyten / monocyten aan de vaten (2 x 10 7 / vat) en verder de kweken tot 12 extra dagen. </li&gt; <li> Change kweekmedium elke 3-4 dagen door het vervangen van ongeveer 30 ml met verse 3-D kweekmedium. </li></ol> 4. Oogsten 3-D Cultures for histologie <ol><li> Met behulp van een transferpipet oogst elke kleine gelfragment, nu &quot;construeren&quot; in een zes-well plaat met 10 ml 10% formaline buffer. Laat gedurende 3 uur bij kamertemperatuur of gedurende 12-16 uur bij 4 ° C. </li><li> Bereid het weefsel verwerking en inbedding cassettes door het merken en het toevoegen van twee stukken van biopsie foam pads in elke cassette. </li><li> Dompel de cassettes in 10% formaline buffer. </li><li> Met behulp van forceps plaats de vaste-constructen tussen de beide vullingen. </li><li> Dompel de cassettes in 10% formaline buffer. </li><li> Ga verder met de standaard procedures voor het inbedden, snijden en vlekken 44. </li></ol>

De auteurs verklaren dat een US Non-Provisional octrooiaanvraag is ingediend bij het U.S. Patent and Trademark Office (Nummer: 13/360.539).

In dit manuscript beschrijven we de ontwikkeling van een bioengineered model van het menselijke darmslijmvlies omvat veelvouden celtypen waaronder primaire humane lymfocyten, fibroblasten en endotheelcellen, alsook intestinale epitheliale cellijnen 24. In deze 3-D-model, worden de cellen gekweekt in een collageen-rijke extracellulaire matrix onder microzwaartekracht omstandigheden 24. Zoals eerder beschreven, de belangrijkste kenmerken van dit model zijn: (i)</s...

De eerste doorbraak in de opbouw van een 3-D model werd gemeld in het begin van 1980 Toen men verschillende types van de steiger (bijv., Laminine, collageen type I, collageen IV, en fibronectine) en cocktails van groeifactoren te verbeteren onderzoeken cel-tot-cel en ECM interacties van &quot;statische&quot; 3-D modellen 1-7. Sindsdien is het grootste probleem van deze modellen zijn beperkingen bij de overdracht van voedingsstoffen en zuurstof in het medium en weefselconstructen 8. In tegenstelling tot cellen in de in vivo omgeving met een constante stroom van voedingsstoffen en zuurstof uit aangrenzende netwerken van bloedvaten ontvangt, de statische aard van deze modellen belemmert doelmatige verwerking ervan aan de cellen. Zo zal celaggregaten gegenereerd in vitro statische modellen die enkele millimeters groot overschrijdt onveranderlijk ontwikkelen hypoxische, necrotische kernen 9. De RWV bioreactoren kan dit probleem te omzeilendoor vloeistofdynamica dat efficiënte diffusie van voedingsstoffen en zuurstof 10-12 laten. Tot op heden, werk met behulp RWV bioreactoren zijn beperkt tot het opnemen van een of twee celtypen 13-17. Bovendien, in plaats van een ruimtelijke oriëntatie Soortgelijke natieve weefsels die cellen gevormd celaggregaten. De belangrijkste reden voor deze beperking is het ontbreken van een scaffold kunnen cellen nemen in een geïntegreerde manier geweest. De steigers worden gebruikt in de RWV bioreactoren tot op heden bestaan, op enkele uitzonderingen na 16-18, voornamelijk van synthetische microbolletjes, buisvormige cilinders of kleine vellen 13-15,19-23. Dit zijn stijve materialen waarvan de samenstelling en flexibiliteit kan worden gemanipuleerd, en welke cellen gehecht aan hun oppervlak. Derhalve is het onwaarschijnlijk dat deze modellen een systeem waarin evalueren dienen met een geïntegreerde wijze de verschillende celcomponenten zoals bindweefselcellen (bijv. Fibroblasten, immuun- en endotheelcellen) die ishould worden verspreid binnen het schavot om menselijk weefsel na te bootsen. Hier beschrijven we de ontwikkeling van een meercellige 3-D model van het organotypische menselijke darmslijmvlies uit een intestinale epitheliale cellijn en primaire humane lymfocyten, endotheelcellen en fibroblasten 24. Deze cellen werden gekweekt onder microzwaartekracht te verschaffen door de RWV bioreactor 13,25-30. In het 3-D-model, het ECM bezit vele verschillende eigenschappen, zoals een osmolaliteit vergelijkbaar met het kweekmedium (bijv., Verwaarloosbare diffusie beperkingen in cultuur) en het vermogen om cellen en andere relevante extracellulaire matrixeiwitten nemen, evenals de geschikte stijfheid voor gebruik in bioreactoren 24. Biologische systemen zijn zeer complex, en de afgelopen jaren is er een verschuiving in de focus van mucosale onderzoek naar het onderzoek van de cel interacties met hun omgeving geweest in plaats van ze te bestuderen in isolation. In het bijzonder wordt het belang van cel-cel interacties in het beïnvloeden intestinale celoverleving en differentiatie goed gedocumenteerd 31-34. Met name de communicatie tussen epitheliale cellen en hun niche heeft een grote invloed op de epitheelcellen expansie en differentiatie 35. Inderdaad wordt algemeen aangenomen dat niet alleen de cel-cel maar ook cel-ECM interacties zijn essentieel voor het onderhoud en differentiatie van epitheelcellen in 3-D cultuurmodellen. Eerdere studies hebben aangetoond dat darm ECM eiwitten zoals collageen I 24,36,37, 38 laminine en fibronectine 39 zijn belangrijk bij het ​​beïnvloeden van darmepitheelcellen tot ruimtelijke oriëntatie vergelijkbaar met de natieve verwerven mucosa. Daarom is de ontwikkeling van nieuwe technologieën, zoals onze 3-D model 24, dat kan nabootsen de fenotypische diversiteit van de darm vereist als onderzoekers gaan de complexe cellulaire en structurele architectuur recreërenen functie van de darm micromilieu. Deze modellen vormen een belangrijk instrument voor de ontwikkeling en evaluatie van nieuwe orale geneesmiddelen en vaccins kandidaten.

<table><tbody><tr><td>Quad Rotator/Independent Rotating Wall Vessel (RWV) bioreactor&nbsp;</td><td>Synthecon</td><td>RCCs-4DQ</td><td>Voor maximaal 4 vaten. Modellen met meer of minder vaten zijn ook beschikbaar.</td></tr><tr><td>Disposable 50 ml-vat</td><td>Synthecon</td><td>D-405</td><td>Doos met 4 vaten</td></tr><tr><td>HCT-8 epitheliale cellen&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>CCL-244</td><td></td></tr><tr><td>CCD-18Co Fibroblasten&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>CRL-1459</td><td></td></tr><tr><td>Human Umbilical Vein Endotheelcellen</td><td>ATCC</td><td>CRL-1730</td><td>HUVEC</td></tr><tr><td>Fibroblast Growth Factor-Basic&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>F0291</td><td>bFGF</td></tr><tr><td>Stem Cell Factor&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S7901</td><td>SCF</td></tr><tr><td>Hepatocyte Growth Factor&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H1404</td><td>HGF</td></tr><tr><td>Endothelin 3</td><td>Sigma</td><td>E9137</td><td></td></tr><tr><td>Laminine</td><td>Sigma</td><td>L2020</td><td>Geïsoleerd uit muis Engelbreth-Holm-Swarm tumor</td></tr><tr><td>Vascular Endothelial Growth Factor&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>V7259</td><td>VEGF</td></tr><tr><td>Leukemia Inhibitory Factor&nbsp;</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-4377</td><td>(LIF</td></tr><tr><td>Adenine</td><td>Sigma</td><td>A2786</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma</td><td>I-6634</td><td></td></tr><tr><td>3,3',5-triiodo-L-thyronine&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T-6397</td><td>T3</td></tr><tr><td>Cholera Toxine</td><td>Sigma</td><td>C-8052</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectine</td><td>BD</td><td>354008</td><td>Geïsoleerd uit menselijk plasma</td></tr><tr><td>apo-Transferrine</td><td>Sigma</td><td>T-1147</td><td></td></tr><tr><td>Heparine</td><td>Sigma</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>Heparan sulfaat&nbsp; proteoglycaan</td><td>Sigma</td><td>H4777</td><td>Geïsoleerd uit basement membraan van muis&nbsp; Engelbreth-Holm-Swarm tumor</td></tr><tr><td>Collageen IV</td><td>Sigma</td><td>C5533</td><td>Geïsoleerd uit menselijke placenta</td></tr><tr><td>Heat-inactivated foetaal bovien serum&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>D-MEM, poeder</td><td>Invitrogen</td><td>12800-017</td><td></td></tr><tr><td>10% formalin&ndash;PBS&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>SF100-4</td><td></td></tr><tr><td>Bovine type I collageen&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A1064401</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyruvaat</td><td>Invitrogen</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicine&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline/streptomycine&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Invitrogen</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Ham's F-12</td><td>Invitrogen</td><td>11765-054</td><td></td></tr><tr><td>Basal Medium Eagle</td><td>Invitrogen</td><td>21010-046</td><td>BME</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Invitrogen</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Endotheel Basal Medium</td><td>Lonza</td><td>CC-3156</td><td>EBM-2</td></tr><tr><td>Endotheelcel groei supplement</td><td>Millipore</td><td>02-102</td><td>ECGS</td></tr></tbody></table>

ontwikkeling van een meercellige driedimensionale organotypische model van het menselijk darmslijmvlies geteeld onder microgravity

Development of a Multicellular Three-dimensional Organotypic Model of the Human Intestinal Mucosa Grown Under Microgravity

Omdat cellen groeien in een driedimensionale (3-D) omgeving hebben het potentieel om vele gaten van celkweek in 2-D omgevingen (bijv., Kolven of schalen) te overbruggen. In feite wordt algemeen erkend dat cellen gekweekt in kolven of schotels neiging te de-differentiëren en verliest speciale functies van het weefsel waarvan ze zijn afgeleid. Momenteel zijn er in hoofdzaak twee types van 3-D kweeksystemen waarbij de cellen worden gezaaid in steigers nabootsen van de natieve extracellulaire matrix (ECM): (a) statische modellen en (b) modellen met bioreactoren. De eerste doorbraak was de statische 3-D modellen. 3-D-modellen met bioreactoren zoals de draaiende-wall-vat (RWV) bioreactoren zijn een meer recente ontwikkeling. Het originele concept van de RWV bioreactoren ontwikkeld aan NASA Johnson Space Center in de vroege jaren 1990 en wordt beschouwd als de beperkingen van statische modellen overwinnen zoals de ontwikkeling van hypoxische, necrotische kernen. De RWV bioreactoren kunnen omzeilen this probleem op door vloeistofdynamica dat efficiënte diffusie van voedingsstoffen en zuurstof toe. Deze bioreactoren bestaan ​​uit een rotator basis die dient ter ondersteuning en draaien twee verschillende formaten kweekvaten die verschillen door hun beluchting brontype: (1) traagdraaiende Laterale Vessels (STLVs) met een coaxiaal oxygenator in het centrum, of (2 ) High Aspect Ratio Vessels (HARVs) met zuurstof via een platte, siliconenrubber gas overdracht membraan. Deze schepen toelaten efficiënt gas overdracht terwijl het vermijden van de vorming van bubble en de daaruit voortvloeiende onrust. Deze omstandigheden leiden tot een laminaire stroming en minimale dwarskracht die modellen verminderde zwaartekracht (microzwaartekracht) in het kweekvat. Hier beschrijven we de ontwikkeling van een meercellige 3-D model van het organotypische menselijke darmslijmvlies uit een intestinale epitheliale cellijn en primaire humane lymfocyten, endotheelcellen en fibroblasten gekweekt onder microzwaartekracht door de RWV bioreactor. &lt;/ P&gt;

<html> Eerder hebben we een meercellige 3-D model van het organotypische menselijke darmslijmvlies bestaat uit een intestinale epitheliale cellijn en primaire humane lymfocyten, endotheelcellen en fibroblasten gekweekt onder microzwaartekracht 24 (figuur 1) ontworpen. Fibroblasten en endotheelcellen werden ingebed in een matrix collageen I verrijkt met extra darm kelder membraaneiwitten 45 (bijv., Laminine, collageen IV, fibronectine en hepa...

Cellen groeien in een driedimensionale (3-D) milieu vormen een duidelijke verbetering ten opzichte celkweek in 2-D omgevingen (bijvoorbeeld kolven of schalen). Hier beschrijven we de ontwikkeling van een meercellige 3-D model van het organotypische menselijke darmslijmvlies gekweekt onder microzwaartekracht door roterende-wall-vat (RWV) bioreactoren.

Ontwikkeling van een Meercellige Driedimensionale Organotypische model van het menselijk darmslijmvlies geteeld onder Microgravity

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., ...

Het algemene doel van deze procedure is het beschrijven van de ontwikkeling van een multicellulair 3D organotypisch model van de menselijke darmmucosa, gekweekt onder microzwaartekracht geleverd door rotating wall vessel-bioreactoren. Deze methode heeft een breed potentieel als instrument voor ontdekkingen bij zowel gezonde toestanden als ziekten, inclusief interacties met pathogenen, antigeentransport en ontstekingsprocessen.De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn het nabootsen van de fenotypische diversiteit van de kat en het gebruik van de D-12 vessel bioreactoren, die een efficiënte diffusie van voedingsstoffen en zuurstof mogelijk maken. Begin met het losschroeven van de dop van de vulpoort van het kweekvat en voeg 50 milliliters van ons PMI toe. Zodra het vat is gevuld, plaatst u de dop terug en veegt u eventueel gemorst medium af met 70% ethanol.Laat het vat ten minste 15 minuten tot overnacht incuberen bij kamertemperatuur. Wanneer u klaar bent om verder te gaan, gebruikt u de vulpoort om het kweekmedium af te voeren en voegt u 30 milliliters van het 3-D kweekmedium toe aan het vat. Plaats de dop terug op de vulpoort en veeg, opnieuw, eventueel gemorst medium af m

development-multicellular-three-dimensional-organotypic-model-human

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Verbeterde beeldvormingstechnologie maakt driedimensionale beeldvorming van organen mogelijk tijdens de ontwikkeling. Hier beschrijven we een systeem voor de kweek van hele organen dat levende beeldvorming van de zich ontwikkelende villi in de foetale muizendarm mogelijk maakt.

Muis Foetale Hele Darm Cultuur System voor Ex Vivo Manipulatie van signaalwegen en Driedimensionale Live-Imaging van Villus Development

Hier presenteren we een protocol bij de menselijke cultuur-enteroid of colonoid monolayers moeten intact barrièrefunctie gastheer epitheliale-microbiota interacties op het cellulaire en biochemisch niveau studeren.

Menselijke Colonoid Monolayers studie van interacties tussen ziekteverwekkers, Commensals en Host intestinaal epitheel

Hier beschrijven we de voorbereiding van van menselijke organoïden afgeleide intestinale epitheliale monolagen voor het bestuderen van de darmbarrièrefunctie, permeabiliteit en transport. Omdat organoïden de oorspronkelijke reactie van epitheelweefsel op externe stimuli vertegenwoordigen, combineren deze modellen de voordelen van uitbreidbaarheid van cellijnen en de relevantie en complexiteit van primair weefsel.

Organoïde-afgeleide epitheliale monolaag: een klinisch relevant in vitro model voor de darmbarrièrefunctie

Hier presenteren we twee protocollen die het modelleren van intestinale apicale-specifieke interacties mogelijk maken. Organoïde-afgeleide intestinale monolagen en Air-Liquid Interface (ALI) culturen vergemakkelijken de generatie van goed gedifferentieerde epithelia toegankelijk vanaf zowel luminale als basolaterale zijden, terwijl polariteit-omgekeerde intestinale organoïden hun apicale kant blootstellen en vatbaar zijn voor hoge doorvoertesten.

Kweekmethoden om apicale-specifieke interacties te bestuderen met behulp van intestinale organoïde modellen

Biopsie-afgeleide intestinale organoïden en organ-on-a-chips technologieën worden gecombineerd in een microfysiologisch platform om regiospecifieke darmfunctionaliteit te recapituleren.

Het combineren van menselijke organoïden en organ-on-a-chip-technologie om intestinale regiospecifieke functionaliteit te modelleren

Het huidige protocol beschrijft het opzetten van een murine colon organoïde systeem om de activiteit en werking van colonstamcellen te bestuderen in een claudin-7 knock-out model.

Driedimensionale cultuur van Murine Colonic Crypts om de intestinale stamcelfunctie ex vivo te bestuderen

We beschrijven een protocol om murine dunne darmcrypten en kweekdarm 3D-organoïden uit de crypten te isoleren. Daarnaast beschrijven we een methode om organoïden te genereren uit een enkele darmstamcel in afwezigheid van een sub-epitheliale cellulaire niche.

De 3D-kweek van organoïden uit murine darmcrypten en een enkele stamcel voor organoïde onderzoek

Hier presenteren we een protocol om darmorganoïden van ratten te genereren en deze te gebruiken in verschillende stroomafwaartse toepassingen. Ratten zijn vaak een geprefereerd preklinisch model, en het robuuste intestinale organoïdesysteem voorziet in de behoefte aan een in vitro systeem om in vivo studies te begeleiden.

Generatie en manipulatie van darmorganoïden van ratten

Hier beschrijven we de constructie van een basis driedimensionaal (3D) intestinale cellijnmodelsysteem en een paraffine-inbeddingsprotocol voor lichtmicroscopische evaluatie van vaste darmequivalenten. Kleuring van geselecteerde eiwitten maakt de analyse van meerdere visuele parameters van een enkel experiment mogelijk voor mogelijk gebruik in preklinische onderzoeken naar geneesmiddelen.

Basis driedimensionaal (3D) darmmodelsysteem met een immuuncomponent

Integratie van darmorganoïden bij honden en een Gut-on-a-Chip microfluïdisch systeem biedt relevante translationele modellen voor menselijke darmziekten. De gepresenteerde protocollen maken 3D-morfogenese en dynamische in vitro modellering van de darm mogelijk, wat helpt bij de ontwikkeling van effectieve behandelingen voor darmziekten bij honden en mensen met One Health.

Driedimensionale morfogenese bij darm-op-een-chip bij honden met behulp van darmorganoïden afkomstig van patiënten met inflammatoire darmaandoeningen

Deze studie schetst een protocol voor het genereren van 2D-monolagen van varkensorganoïden afkomstig van de dunne en dikke darm. De groei van deze monolagen wordt gekenmerkt door toenemende TEER-waarden, wat wijst op een robuuste epitheliale integriteit. Bovendien vertonen deze monolagen fysiologische secretoire reacties in Ussing-kamerexperimenten na de toepassing van forskolin.

Tweedimensionale darmorganoïden van varkens die de fysiologische eigenschappen van de inheemse darm weerspiegelen

Leer hoe je een meercellig 3D-organotypisch model van het menselijk darmslijmvlies ontwikkelt onder microgravitatie met behulp van RWV-bioreactoren. Deze methode bootst in vivo-omstandigheden na voor onderzoek naar gezondheid en ziekte.

Ontwikkeling van een Meercellige Driedimensionale Organotypische model van het menselijk darmslijmvlies geteeld onder Microgravity (Video) | JoVE Journal

Ontwikkeling van een Meercellige Driedimensionale Organotypische model van het menselijk darmslijmvlies geteeld onder Microgravity

Meer video's verkennen