Ontwikkeling van een Meercellige Driedimensionale Organotypische model van het menselijk darmslijmvlies geteeld onder Microgravity
July 25th, 2016
Cellen groeien in een driedimensionale (3-D) milieu vormen een duidelijke verbetering ten opzichte celkweek in 2-D omgevingen (bijvoorbeeld kolven of schalen). Hier beschrijven we de ontwikkeling van een meercellige 3-D model van het organotypische menselijke darmslijmvlies gekweekt onder microzwaartekracht door roterende-wall-vat (RWV) bioreactoren.
Het algemene doel van deze procedure is om de ontwikkeling te beschrijven van een meercellig 3-D organotypisch model van de humane intestinale mucosa gekweekt onder microzwaartekracht, aangeboden door bioreactoren met roterende wandvaten. Deze methode heeft een breed scala aan potentieel als hulpmiddel voor ontdekking in zowel gezondheid als ziekte. Inclusief interacties met pathogenen, antigeentransport en de ontstekingsprocessen.
De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn het nadoen van de fenotypische diversiteit van de kat en het gebruik van de D-12 vaatbioreactoren die een efficiënte diffusie van voedingsstoffen en zuurstof mogelijk maken. Begin door de dop van de vulpoort van het kweekvat los te schroeven en 50 milliliter van onze PMI toe te voegen. Zodra het vat vol is, vervang de dop en veeg eventueel gemorst medium af met 70%ethanol.
Laat het vat gedurende ten minste 15 minuten tot een nacht incuberen bij kamertemperatuur. Wanneer u klaar bent om door te gaan, gebruik de vulpoort om het kweekmedium weg te gooien en voeg 30 milliliter van het 3-D kweekmedium toe aan het vat. Plaats de dop weer op de vulpoort en veeg eventueel gemorst medium op met 70%ethanol.
Verwijder bijna confluente flessen met humane umbilicale vaatendotheelcellen en humane colonische fibroblasten uit de incubator en was ze tweemaal met PBS. Los vervolgens de cellen op door ze te bedekken met een 0,25% trypsine-oplossing met 0,05% trypsine EDTA. Zodra de cellen loskomen, verzamel ze in een 50 milliliter buis voorgeladen met 30 milliliter DMEM met 30%FBS.
Centrifugeer de buis gedurende 10 minuten om de cellen te pellen. Sla vervolgens de cellen opnieuw op in 30 milliliter DMEM met 30%FBS. Verdun vervolgens 20 microliter van de opnieuw opgehangen cellen met 20 microliter trypanblauw kleurstof.
Laad de hemocytometer met het cellenmengsel en tel de concentratie van levensvatbare cellen. Sla vervolgens elk celtype opnieuw op in 50 tot 80 miljoen cellen per milliliter in DMEM met 30%FBS. Plaats eerst het juiste aantal kweekinserts in de putjes van een zes-puttenplaat.
Bereid vervolgens het collageenmengsel voor door eerst 10x DMEM, 10x Herstelmedium, 200 millimolar L-glutamine en thermisch geïnactiveerd FBS toe te voegen aan een 50 milliliter conische buis. Voeg vervolgens bovien collageen type een, laminine, collageen type vier, fibronectine, heparine sulfaatproteoglycaan toe en voeg tenslotte natriumhydroxide toe om de pH van de oplossing te neutraliseren. Als het mengsel op enig moment een gelige kleurige zure uiterlijk krijgt, voeg dan een paar druppels steriele 1 normale natriumhydroxide toe om het mengsel te neutraliseren.
Sluit de buis en meng de oplossing door deze enkele keren om te draaien terwijl u luchtbellen vermijdt. Als u niet mengt, houd de oplossing op ijs om te voorkomen dat deze polymeriseert. Eenmaal gemengd, voegt u de celsuspensies toe aan de collageenvoorbereiding en meng de buizen door de buizen voorzichtig enkele keren om te draaien om luchtbellen te voorkomen.
Plaats ze vervolgens terug op het ijs. Voeg vier tot vijf milliliter van de celbevattende collageenoplossing toe aan elke insert en laat het collageen gedurende een uur in de kap geleren met weinig of geen beweging. Na een uur, brengt u de zes-puttenplaat over naar een incubator voor een tot twee extra uur.
Keer vervolgens terug naar de weefselkweekkap en gebruik een paar steriele pincetten en een scalpel om asseptisch de membraan van de insert te snijden. Los de celbevattende gel los van de membraan en snijd vervolgens de losgemaakte gel in kleine vierkantjes. Voeg de kleine celbevattende collageenvierkantjes toe aan een van de voorgeladen 50 milliliter vaten via de vulpoort.
Bereid vervolgens een suspensie van HCT-8 humane epitheelcellen voor zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Sla de cellen opnieuw op in een concentratie van 10 miljoen cellen per milliliter in DMEM met 30%FBS. Voeg vervolgens een milliliter van de HCT-8-celsuspensie toe aan het 50 milliliter vat via de vulpoort.
Na het toevoegen van de cellen, voegt u nogmaals 20 milliliter 3-D kweekmedium toe aan het vat zodat het bijna vol is. Plaats de dop weer en bevochtig de lip van de vulpoort met 70%ethanol. Plaats vervolgens een vijf milliliter spuit met drie tot vier milliliter 3-D kweekmedium in een poort van het vat en een lege vijf milliliter spuit in de andere poort.
Verwijder eventuele zichtbare luchtbellen door in de lege spuit te trekken terwijl ongeveer hetzelfde volume medium via de andere spuit in het vat wordt geïnjecteerd. Met alle lucht nu verwijderd, plaats de vaten in de bioreactor, zet het apparaat aan en stel de snelheid in op 13 tot 14 rotaties per minuut. Pas de snelheid indien nodig aan om te voorkomen dat de cellen de vatwanden raken.
Kweek de cellen onder microzwaartekracht en ververs het kweekmedium om de drie tot vier dagen. Om het medium te vervangen, gebruik de dubbele spuitmethode om ongeveer 30 milliliter van het gebruikte medium te vervangen door vers 3-D kweekmedium. Na drie tot vijf dagen in cultuur, isoleer perifere bloedmononucleaire cellen zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol.
Verwijder vervolgens het vat uit de bioreactor en voeg ongeveer 20 miljoen cellen bestaande uit lymfocyten en monocyten toe aan de vaten via de vulpoort. Plaats de vaten terug in de bioreactor en kweek ze nog eens vier tot zes dagen. Rond dag negen van de cultuur, voegt u nogmaals 20 miljoen cellen bestaande uit lymfocyten en monocyten toe aan het vat en zet u de kweek voort tot 12 extra dagen.
Aan het einde van het experiment, gebruik een transferpijp om elk klein gelfragment, nu een construct genoemd, te verzamelen en plaats ze in de putjes van een zes-puttenplaat met 10
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel beschrijft de ontwikkeling van een meercellig 3-D organotypisch model van de humane darmmucosa gekweekt onder microzwaartekracht met behulp van rotating-wall-vessel (RWV) bioreactoren. Deze innovatieve aanpak verbetert de celkweek in vergelijking met traditionele 2-D methoden.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Microzwaartekrachtonderzoek
Achtergrond
- 3-D celkweekmodellen bootsen de in vivo omstandigheden beter na.
- Microzwaartekracht omgevingen kunnen cellulair gedrag en interacties beïnvloeden.
- Rotating-wall-vessel bioreactoren vergemakkelijken de diffusie van voedingsstoffen en zuurstof.
- Het begrijpen van de darmmucosa is cruciaal voor gezondheids- en ziekteonderzoek.
Doel van het onderzoek
- Om een 3-D organotypisch model van de humane darmmucosa te ontwikkelen.
- Om cellulaire interacties in een microzwaartekracht omgeving te verkennen.
- Om een platform te bieden voor het bestuderen van gezondheids- en ziektemechanismen.
Gebruikte methoden
- Gebruik van rotating-wall-vessel bioreactoren voor celkweek.
- Voorbereiding van een meercellig model om de darmmucosa te simuleren.
- Beoordeling van cellulaire interacties en reacties.
- Evaluatie van de efficiëntie van de diffusie van voedingsstoffen en zuurstof.
Belangrijkste resultaten
- Het 3-D model bootste met succes de fenotypische diversiteit van darmcellen na.
- Microzwaartekracht condities beïnvloedden cellulair gedrag en interacties.
- Het model toonde potentie voor het bestuderen van pathogene interacties en ontstekingsprocessen.
- Efficiënte diffusie van voedingsstoffen en zuurstof werd bereikt in de bioreactoropstelling.
Conclusies
- Het ontwikkelde model is een belangrijke vooruitgang in celkweektechnologie.
- Het biedt nieuwe inzichten in darmgezondheid en ziektemechanismen.
- Deze aanpak kan een waardevol hulpmiddel zijn voor toekomstig biomedisch onderzoek.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This multicellular 3-D organotypic model of the human intestinal mucosa grown under microgravity provides a physiologically relevant system for studying host-pathogen interactions, antigen trafficking, and inflammatory processes. By mimicking in vivo tissue architecture and cellular diversity, the model enhances predictive confidence in preclinical target validation and mechanistic de-risking. It supports translational continuity from discovery through preclinical stages by enabling reproducible, quantitative assessment of mucosal responses in a disease-relevant system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses involving epithelial-immune interactions in a multicellular human intestinal mucosa model.
- Operational Value: Supports functional target validation by maintaining differentiated, villus-like structures under microgravity conditions.
- Predictive Value: Reduces mechanistic ambiguity in early-stage target selection by modeling human mucosal complexity.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening of compounds affecting barrier function or immune modulation.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility through controlled microgravity culture and defined cell seeding ratios.
- Scalability: Enables platform reuse across multiple experimental runs with consistent construct formation by day 20.
Translational & Preclinical Research
- Translational Relevance: Models human intestinal mucosa with epithelial, endothelial, fibroblast, and lymphocyte components for disease-relevant studies.
- Preclinical Continuity: Supports risk-adjusted advancement decisions by enabling longitudinal culture up to 30 days with stable phenotypic features.
- Mechanistic De-risking: Allows evaluation of inflammatory processes and pathogen interactions in a controlled, human-derived system.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target validation through preclinical modeling, particularly for gastrointestinal and immunology-focused pipelines.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of mucosal immune responses and epithelial integrity in a human-relevant 3-D system.
- Screening: Delivers quantitative outputs via histological and immunohistochemical readouts after construct fixation and sectioning.
- Analytics: Enables comparison of cellular localization, differentiation markers, and structural organization across experimental conditions.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical validation through sustained culture of multicellular constructs.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, rotatable bioreactor-based platform applicable across multiple intestinal disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through phenotypic diversification and villus-like morphogenesis under microgravity.
- Operational Value: Standardization via defined cell seeding, collagen gelation, and bioreactor speed control (13–14 rpm).
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by reducing late-stage failure risk from poor target selection in mucosal targets.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates based on effects in a complex, human-derived intestinal model.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary cell isolation, 3-D gel preparation, and bioreactor operation.
- Dependence on rotating-wall-vessel bioreactors (HARV/STLV) and sterile, bubble-free fluid handling.
- Necessitates cross-team standardization for cell sourcing, collagen mixing, and medium change schedules.
- Adaptation considerations include scaling cell types and ratios for different mucosal regions or disease states.
- Practical limitations include extended culture timelines (up to 30 days) and sensitivity to shear stress if bioreactor speed is not properly adjusted.
