Procedure voor Adaptive Laboratorium Evolutie van micro-organismen met behulp van een Chemostat

Het algemene doel van deze procedure is om een micro-organisme in staat te stellen zich te ontwikkelen onder laboratoriumomstandigheden. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het veld van de microbiologie te beantwoorden, zoals relaties met bijnierfunctie, stressreacties, metabole engineering en natuurlijk evolutie. Het grote voordeel van deze techniek is de continue selectie van de meest aangepaste nakomeling onder specifieke laboratoriumomstandigheden.

Begin deze procedure met de voorbereiding van de apparatuur, evenals het initiële medium, stressmedium en hoog stressmedium, zoals beschreven in het tekstprotocol. Inoculeer een enkele kolonie of wild type E.coli in een 15-milliliter testbuis met vier milliliter van het initiële medium. Incubeer de testbuis gedurende 12 uur in een schudende incubator bij 37 graden Celsius en 220 tpm.

Incubeer de chemostaatpot voor beluchting en agitatie gedurende zes uur bij 37 graden Celsius. Na de incubatie, verbind aseptisch het uiteinde van de siliconen slang van de pompen naar de chemostaatpot. Breng aseptisch een milliliter van de voorkweek over naar de chemostaatpot.

Start de uitlaatpomp en verzamel de cultuur in de exponentiële fase. Controleer de optische dichtheid bij 600 nanometer van de cultuur uit de uitlaatslang. Start vervolgens de inlaatpomp.

Controleer de optische dichtheid van de cultuur bij 600 nanometer van de uitlaatslang elke 24 uur. Na 96 uur gebruik van de chemostaat, wat een 9,6 volledige omwenteling is, vervang het reservoir door de laagste concentratie van hoog stressmedium. Wanneer u het reservoir vervangt door een hoger stressmedium, kunnen de cellen geschokt raken.

Als de celdichtheid te laag is, stop dan voor een tijdje met het voeden van het hogere stressmedium om de celdichtheid te herstellen. Als de optische dichtheid lager is dan 0,2, stop dan de voedende inlaatpomp gedurende zes uur. Start de inlaatpomp opnieuw en controleer of de optische dichtheid boven de 0,2 ligt.

Verhoog geleidelijk de concentratie van de stressor door incrementeel over te schakelen naar een reservoir met een hogere stressorconcentratie. Neem monsters van de aangepaste cultuur wanneer deze een stressor-aanpassingsmijlpaal bereikt en bewaar ze voor verdere genomische analyse. Voor het bewaren van monsters, meng het 0,5 milliliter cultuurmonster met 0,5 milliliter van een gesteriliseerde 80%glycerine-oplossing en bewaar het bij 80 graden Celsius.

Bereid een 1,6% agar plate medium voor dat dezelfde stressor bevat in dezelfde concentratie als in het medium. Plateer 0,1 milliliter van de uitlaatcultuur van de chemostaat en incubeer gedurende 16 uur bij 37 graden Celsius. Na de incubatie, pluk enkele kolonies van de plaat met een steriele tandenstoker en inoculeer ze in 15 milliliter testbuizen met dezelfde stressor en dezelfde mediumconcentratie als in de chemostaat.

Incubeer gedurende zes uur. Breng een milliliter van de cultuurvloeistof over in een 250 milliliter erlenmeyerkolf met 50 milliliter medium. Haal elke uur 0,5 milliliter van de cultuurvloeistof en meet de optische dichtheid bij 600 nanometer.

Vergelijk de groeisnelheid van de aangepaste stam met die van de wilde typestam gegeven de stressor. De wilde typestam van E.coli werd gedurende 270 dagen geëvolueerd in een hoge succinaatstresstoestand, wat overeenkomt met bijna 930 generaties. Wanneer hogere succinaatstress werd toegevoegd, werd de biomassaconcentratie onmiddellijk verlaagd en vervolgens hersteld.

Hier is een schematisch diagram van de chemostaat met een mutant die tolerant is tegen de hoge succinaatstress. De meeste wilde type cellen worden weggespoeld onder de stressomstandigheden en de mutant groeit meer. Uiteindelijk neemt de populatie van de mutant-nakomeling toe.

De tweede en derde mutaties worden continu geselecteerd en domineren uiteindelijk de chemostaat. Deze figuur laat zien dat de aangepaste stam zonder vertraging groeide onder hoge succinaatstressomstandigheden, terwijl de wilde typestam dat niet deed. Een vergelijkbare strategie kan worden toegepast op adaptieve laboratoriumevolutie met behulp van een chemostaat met een variatie van stressors.

Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u het micro-organisme onder een bepaalde voorwaarde kunt verkrijgen en laten evolueren. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in een paar maanden worden uitgevoerd. Terwijl u deze procedure probeert, is het belangrijk om te onthouden om chemostaatcellen niet weg te spoelen door te veel stress tegelijk toe te voegen en om de optische dichtheid elke dag te controleren.

Volgend op deze procedure kunnen methoden zoals genoomanalyse en transcriptoomanalyse worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals welke mutatie bijdraagt aan de stresstolerante evolutie?