Procedure voor Adaptive Laboratorium Evolutie van micro-organismen met behulp van een Chemostat
September 20th, 2016
Hier presenteren we een protocol laboratorium adaptieve evolutie van micro-organismen onder omstandigheden met behulp chemostaat cultuur te verkrijgen. Ook is genomische analyse van het vrijkomende stam besproken.
Het algemene doel van deze procedure is om een micro-organisme in staat te stellen zich te ontwikkelen onder laboratoriumomstandigheden. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het veld van de microbiologie te beantwoorden, zoals relaties met bijnierfunctie, stressreacties, metabole engineering en natuurlijk evolutie. Het grote voordeel van deze techniek is de continue selectie van de meest aangepaste nakomeling onder specifieke laboratoriumomstandigheden.
Begin deze procedure met de voorbereiding van de apparatuur, evenals het initiële medium, stressmedium en hoog stressmedium, zoals beschreven in het tekstprotocol. Inoculeer een enkele kolonie of wild type E.coli in een 15-milliliter testbuis met vier milliliter van het initiële medium. Incubeer de testbuis gedurende 12 uur in een schudende incubator bij 37 graden Celsius en 220 tpm.
Incubeer de chemostaatpot voor beluchting en agitatie gedurende zes uur bij 37 graden Celsius. Na de incubatie, verbind aseptisch het uiteinde van de siliconen slang van de pompen naar de chemostaatpot. Breng aseptisch een milliliter van de voorkweek over naar de chemostaatpot.
Start de uitlaatpomp en verzamel de cultuur in de exponentiële fase. Controleer de optische dichtheid bij 600 nanometer van de cultuur uit de uitlaatslang. Start vervolgens de inlaatpomp.
Controleer de optische dichtheid van de cultuur bij 600 nanometer van de uitlaatslang elke 24 uur. Na 96 uur gebruik van de chemostaat, wat een 9,6 volledige omwenteling is, vervang het reservoir door de laagste concentratie van hoog stressmedium. Wanneer u het reservoir vervangt door een hoger stressmedium, kunnen de cellen geschokt raken.
Als de celdichtheid te laag is, stop dan voor een tijdje met het voeden van het hogere stressmedium om de celdichtheid te herstellen. Als de optische dichtheid lager is dan 0,2, stop dan de voedende inlaatpomp gedurende zes uur. Start de inlaatpomp opnieuw en controleer of de optische dichtheid boven de 0,2 ligt.
Verhoog geleidelijk de concentratie van de stressor door incrementeel over te schakelen naar een reservoir met een hogere stressorconcentratie. Neem monsters van de aangepaste cultuur wanneer deze een stressor-aanpassingsmijlpaal bereikt en bewaar ze voor verdere genomische analyse. Voor het bewaren van monsters, meng het 0,5 milliliter cultuurmonster met 0,5 milliliter van een gesteriliseerde 80%glycerine-oplossing en bewaar het bij 80 graden Celsius.
Bereid een 1,6% agar plate medium voor dat dezelfde stressor bevat in dezelfde concentratie als in het medium. Plateer 0,1 milliliter van de uitlaatcultuur van de chemostaat en incubeer gedurende 16 uur bij 37 graden Celsius. Na de incubatie, pluk enkele kolonies van de plaat met een steriele tandenstoker en inoculeer ze in 15 milliliter testbuizen met dezelfde stressor en dezelfde mediumconcentratie als in de chemostaat.
Incubeer gedurende zes uur. Breng een milliliter van de cultuurvloeistof over in een 250 milliliter erlenmeyerkolf met 50 milliliter medium. Haal elke uur 0,5 milliliter van de cultuurvloeistof en meet de optische dichtheid bij 600 nanometer.
Vergelijk de groeisnelheid van de aangepaste stam met die van de wilde typestam gegeven de stressor. De wilde typestam van E.coli werd gedurende 270 dagen geëvolueerd in een hoge succinaatstresstoestand, wat overeenkomt met bijna 930 generaties. Wanneer hogere succinaatstress werd toegevoegd, werd de biomassaconcentratie onmiddellijk verlaagd en vervolgens hersteld.
Hier is een schematisch diagram van de chemostaat met een mutant die tolerant is tegen de hoge succinaatstress. De meeste wilde type cellen worden weggespoeld onder de stressomstandigheden en de mutant groeit meer. Uiteindelijk neemt de populatie van de mutant-nakomeling toe.
De tweede en derde mutaties worden continu geselecteerd en domineren uiteindelijk de chemostaat. Deze figuur laat zien dat de aangepaste stam zonder vertraging groeide onder hoge succinaatstressomstandigheden, terwijl de wilde typestam dat niet deed. Een vergelijkbare strategie kan worden toegepast op adaptieve laboratoriumevolutie met behulp van een chemostaat met een variatie van stressors.
Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u het micro-organisme onder een bepaalde voorwaarde kunt verkrijgen en laten evolueren. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in een paar maanden worden uitgevoerd. Terwijl u deze procedure probeert, is het belangrijk om te onthouden om chemostaatcellen niet weg te spoelen door te veel stress tegelijk toe te voegen en om de optische dichtheid elke dag te controleren.
Volgend op deze procedure kunnen methoden zoals genoomanalyse en transcriptoomanalyse worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals welke mutatie bijdraagt aan de stresstolerante evolutie?
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor de adaptieve laboratoriumevolutie van micro-organismen met behulp van chemostaatcultuur. Het bespreekt de genomische analyse van de geëvolueerde stam en de implicaties ervan in de microbiologie.
Belangrijke studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Microbiologie
- Laboratoriumevolutie
- Genomische analyse
Achtergrond
- Adaptieve laboratoriumevolutie maakt het mogelijk dat micro-organismen evolueren onder gecontroleerde omstandigheden.
- Deze methode kan inzichten opleveren in stressresponsen en metabole engineering.
- Continue selectie van nakomelingen verbetert de studie van evolutionaire processen.
- Eerste voorbereiding van media is cruciaal voor een succesvolle implementatie.
Doel van het onderzoek
- Om micro-organismen in staat te stellen om te evolueren in een laboratoriumomgeving.
- Om relaties tussen stressresponsen en evolutionaire aanpassingen te onderzoeken.
- Om metabole engineeringstudies te vergemakkelijken.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van initieel, stress- en hoogstressmedium.
- Inoculatie van E. coli in een testbuis met initieel medium.
- Incubatie in een schudende incubator onder gespecificeerde omstandigheden.
- Continue monitoring van microbiële evolutie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle evolutie van micro-organismen onder gecontroleerde omstandigheden.
- Inzichten in stressresponsmechanismen.
- Mogelijke toepassingen in metabole engineering.
- Genomische analyse onthult aanpassingen in geëvolueerde stammen.
Conclusies
- Het protocol maakt effectieve laboratoriumevolutie van micro-organismen mogelijk.
- Bevindingen dragen bij aan het begrip van microbiële aanpassingen.
- Deze methode kan worden toegepast op verschillende onderzoeksvragen in de microbiologie.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Adaptive laboratory evolution using chemostat culture enables continuous selection of microbial strains under controlled stress conditions, supporting target validation and mechanistic de-risking in early discovery. This approach generates diverse populations through high cell division rates, improving predictive confidence for strain engineering and pathway optimization. The method facilitates translational continuity by linking laboratory evolution to genomic and transcriptomic analysis for identifying adaptive mutations.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through stressor-induced evolution and pathway clarification.
- Operational Value: Supports biological de-risking by identifying dominant adaptive strains under selective pressure.
- Predictive Value: Generates diverse mutant populations for functional target validation and lead identification.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems with stabilized stress-tolerant phenotypes for downstream screening.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility through continuous culture and defined stressor gradients.
- Scalability: Enables platform reuse across multiple stressors and microbial hosts for screening readiness.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Connects evolved strain phenotypes to genomic changes, supporting translational biomarker alignment.
- Operational Value: Provides evolutionary continuity from discovery through preclinical validation via traceable adaptation milestones.
- Risk Mitigation: Informs risk-adjusted advancement decisions by linking stress tolerance to specific mutations.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing in early discovery to lead identification and preclinical validation, supported by continuous selection and genomic analysis outputs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through controlled stressor exposure and mutant enrichment.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible cultures with quantitative optical density monitoring for strain comparison.
- Analytics: Enables comparative genomic and transcriptome analysis to identify mutations contributing to stress tolerance.
- Translational Research: Connects laboratory evolution to preclinical continuity through documented adaptation milestones and cryopreserved samples.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for evolving microorganisms under varying stressors across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in strain engineering by revealing mechanisms of stress adaptation.
- Operational Value: Reduces labor intensity post-setup through automated continuous culture and defined sampling intervals.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking evolutionary outcomes to genomic drivers of fitness.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of strains based on validated adaptive mutations and growth performance.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microbiology, chemostat operation, and aseptic technique.
- Depends on instrumentation for precise pump control, aeration, agitation, and optical density monitoring.
- Necessitates cross-team standardization for media preparation, stressor gradients, and sampling protocols.
- Involves adaptation considerations when transferring evolved strains to shake-flask or plate-based validation assays.
- Includes practical limitations such as cell washout risk under excessive stress and the need for daily optical density checks to maintain culture stability.
