Name: Procedure voor Adaptive Laboratorium Evolutie van micro-organismen met behulp van een Chemostat (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 3 s
Description: Leer adaptieve laboratoriumevolutie van micro-organismen met behulp van een chemostaat. Deze methode maakt continue selectie van stressbestendige afstammelingen mogelijk voor microbiologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze studie werd financieel ondersteund door het Koreaanse ministerie van Wetenschap, ICT en Toekomstplanning (Intelligent Synthetic Biology Center-programma 2012M3A6A8054887). P. Kim werd ondersteund door een beurs van de Katholieke Universiteit van Korea (2015).

1. apparatuur Voorbereiding <ol><li> Verkrijgen van een chemostat pot (150-250 ml) of een erlenmeyer (250 ml) die een inlaatpoort en een uitlaatpoort. Sluit de poorten met siliconenslang waardoor stroomsnelheden van 10-100 ml / uur. Optioneel gebruik van een ontluchter, een luchtuitlaat poort, en temperatuurgecontroleerde water inlaat en uitlaat poorten. </li><li> Verkrijgen van een apparaat om de chemostaat pot die voorziet roeren en temperatuurregeling (of een roterende schudincubator). </li><li> Verkrijgen twee peristaltische pompen om vers medium te leveren en het verzamelen van de cultuur. </li><li> Zorg voor een reservoir jar (10-20 L) met een medium uitlaatpoort en een luchtinlaat poort. </li><li> Verkrijgen van silicium slangen die geschikt zijn voor de verdunning (dat wil zeggen, ID 0,8 mm, stroom range 0,06-36 ml / min; L / S 13 buizen). </li></ol> 2. Medium Voorbereiding en Sterilisatie <ol><li> Initial Medium <ol><li> Los op 0,3 g glucose, 0,08 g NH4Cl, 0,05 g NaCl, 0,75 g Na 2 HPO 4 · 2H 2 O, en 0,3 g KH 2 PO 4 in 90 ml gedestilleerd water (DW) in een chemostaat pot. </li><li> Sluit de chemostat pot samen met de slang met behulp van klemmen. Niet sluit de ontluchter. </li><li> Steriliseer het chemostaat pot in een autoclaaf bij 121 ° C gedurende 15 minuten. Na sterilisatie, slaan de chemostaat pot bij kamertemperatuur. </li><li> Ontbinden 0,02 g MgSO4 · 7H 2 O, 0,01 g CaCl 2 en 0,1 mg thiamine in 10 ml DW (oplossing A). </li><li> Filteroplossing Een behulp van een injectiespuit en een voorgevulde injectiespuit filter gesteriliseerd (0,45 urn poriën een filter). </li><li> Voeg de oplossing A filtraten de chemostaat pot. </li></ol></li><li> Stress Medium <ol><li> Los op 30 g glucose, 8 g NH 4 Cl, 5 g NaCl, 75 g Na 2 HPO 4 · 2H 2 O, 30 g KH 2 PO 4, en 300 g dinatriumsuccinaat hexahydraat (Na 2 · succinaat · 6H &lt;sub&gt; 2 O; de stressor gebruikt in dit experiment) in 9,9 L DW in een reservoir pot. </li><li> Sluit de reservoir pot samen met de slang met behulp van klemmen. Niet sluit de ontluchter. </li><li> Steriliseer het reservoir pot in een autoclaaf bij 121 ° C gedurende 15 minuten. Na sterilisatie Bewaar de kruik bij kamertemperatuur. </li><li> Los 2 g MgSO4 · 7H 2 O, 1 g CaCl 2 en 10 mg thiamine in 100 ml DW (oplossing A). </li><li> Filteroplossing A met een injectiespuit en een voorgevulde injectiespuit filter gesteriliseerd (0,45 urn poriën een filter). </li><li> Voeg de oplossing A filtraten het reservoir pot. </li><li> Aseptisch sluit de gesteriliseerde silicium slang aan het reservoir pot en bevestig de peristaltische pompen. </li></ol></li><li> High-stress-Medium <ol><li> Bereid het medium volgens punt 2.2, maar met een grotere concentratie van stressor (dwz 3-5 g / l hoger succinaat adaptatie). Let op: Dit protocol is voor de aanpassing aan een stress-thop kan worden geleverd via het medium. Bij fysische stressfactoren zoals temperatuur, roeren of verlichting moet de teelt dienovereenkomstig worden ontworpen. </li></ol></li></ol> 3. Eerste Teelt <ol><li> Inoculeer een enkele kolonie van wild-type E. coli in een 15 ml reageerbuis met 4 ml oorspronkelijke medium. </li><li> Incubeer de reageerbuis in een schudincubator gedurende 12 uur bij 37 ° C en 220 rpm. </li><li> Aseptisch overdracht 1 ml voorkweek de chemostaat pot. </li><li> Incubeer de chemostaat pot, voorziet beluchting (lucht 50 ml / min) en roeren (200 rpm) bij 37 ° C gedurende 6 uur. </li></ol> 4. Stress Adaptation <ol><li> Aseptisch sluit het einde van het silicium slang van de pompen naar de chemostaat pot. </li><li> Start de pomp uitlaat (10 ml / u of hoger) en verzamel cultuur. Opmerking: De cultuur moet in de exponentiële fase typisch 4-8 uur na initiële kweek. </li><li> check de optische dichtheid (600 nm) van de kweek van de uitlaat slang. </li><li> Start de inlaatpomp (10 ml / uur, overeenkomend met een snelheid van verdunning van 0,1 h-1). </li><li> Controleer de optische dichtheid van de kweek bij 600 nm van de uitvoerslang elke 24 uur. </li><li> Bedien de chemostaat voor 96 uur (omzet 9,6-voudig) of meer. Als de optische dichtheid stabiel, wisselen het reservoir met de zwaar belaste medium. Als de optische dichtheid lager dan 0,2, stopt de toevoertransporteur inlaatpomp voor 6 uur. Herstart de inlaat pomp en controleer of de optische dichtheid is voorbij 0.2. </li><li> Geleidelijk verhogen van de concentratie van de stressor door het veranderen van een reservoir met een hogere concentratie stressor. </li><li> Monsters van de kweek aangepast wanneer het een mijlpaal bereikt (bijvoorbeeld een stam aangepast om 100 g / l succinaat stress), en opslag voor verdere genomische analyse. </li><li> Voor monster opslag, meng de cultuur monster (0,5 ml) met een gesteriliseerde 80% glycerol solution (0,5 ml) en het op -80 ° C. Opmerking: Als het micro-organisme verwerft het vermogen om de stressor afgebroken tijdens de ALE proces de stressor concentratie in de fermentatie pot is niet dezelfde als die in de verse reservoir. </li></ol> 5. Single-kolonie Isolatie van de stress-aangepaste stam <ol><li> Bereid agarplaat-medium (1,6% agar) die dezelfde stressor en bij dezelfde concentratie drager. </li><li> Plaat de uitlaat kweek (0,1 ml) van de chemostaat en incubeer bij 37 ° C gedurende 16 uur. </li><li> Pick enkele kolonies van de plaat met een steriele tandenstoker en beënt ze in 15 ml reageerbuizen die dezelfde stressor en in hetzelfde medium concentratie in de chemostaat en incubeer gedurende 6 uur. </li><li> Breng 1 ml van de cultuur bouillon in een 250 ml Erlenmeyer die 50 ml medium. Oogst 0,5 ml van de kweekbouillon elke 1 uur, en meet de OD bij 600 nm. Vergelijk de groei van de aangepaste Strain met die van de wildtype gezien de stressor. </li></ol>

<ol><li>Rando, O. J., Verstrepen, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timescales+of+genetic+and+epigenetic+inheritance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Timescales of genetic and epigenetic inheritance.</a> Cell. 128, 655-668 (2007).</li>
<li>Kim, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-term+differential+adaptation+to+anaerobic+stress+via+genomic+mutations+by+Escherichia+coli+strains+K-12+and+B+lacking+alcohol+dehydrogenase%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Short-term differential adaptation to anaerobic stress via genomic mutations by Escherichia coli strains K-12 and B lacking alcohol dehydrogenase.</a> Front Microbiol. 5, 476(2014).</li>
<li>Mendizabal, I., Keller, T. E., Zeng, J., Yi, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics+and+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Integr+Comp+Biol%22%5BJournal%5D)">Epigenetics and evolution.</a> Integr Comp Biol. 54, 31-42 (2014).</li>
<li>Lee, J. Y., Seo, J., Kim, E. S., Lee, H. S., Kim, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+evolution+of+Corynebacterium+glutamicum+resistant+to+oxidative+stress+and+its+global+gene+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Lett%22%5BJournal%5D)">Adaptive evolution of Corynebacterium glutamicum resistant to oxidative stress and its global gene expression profiling.</a> Biotechnol Lett. 35, 709-717 (2013).</li>
<li>Lee, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+oxidative+stress-tolerant+Corynebacterium+glutamicum%5BTitle%5D)+AND+%22AMB+Express%22%5BJournal%5D)">Artificial oxidative stress-tolerant Corynebacterium glutamicum.</a> AMB Express. 4, 15(2014).</li>
<li>Narang, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+steady+states+of+microbial+growth+on+mixtures+of+substitutable+substrates+in+a+chemostat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Theor+Biol%22%5BJournal%5D)">The steady states of microbial growth on mixtures of substitutable substrates in a chemostat.</a> J Theor Biol. 190, 241-261 (1998).</li>
<li>Kwon, Y. D., Kim, S., Lee, S. Y., Kim, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+continuous+adaptation+of+Escherichia+coli+to+high+succinate+stress+and+transcriptome+analysis+of+the+tolerant+strain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biosci+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Long-term continuous adaptation of Escherichia coli to high succinate stress and transcriptome analysis of the tolerant strain.</a> J Biosci Bioeng. 111, 26-30 (2011).</li>
<li>Barrick, J. E., Lenski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+dynamics+during+experimental+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Genome dynamics during experimental evolution.</a> Nat Rev Genet. 14, 827-839 (2013).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sequence+Alignment%2FMap+format+and+SAMtools%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25, 2078-2079 (2009).</li>
<li>McKenna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Genome+Analysis+Toolkit%3A+a+MapReduce+framework+for+analyzing+next-generation+DNA+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">The Genome Analysis Toolkit: a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data.</a> Genome Res. 20, 1297-1303 (2010).</li>
<li>Deatherage, D. E., Barrick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+mutations+in+laboratory-evolved+microbes+from+next-generation+sequencing+data+using+breseq%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of mutations in laboratory-evolved microbes from next-generation sequencing data using breseq.</a> Methods Mol Biol. 1151, 165-188 (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Micro-organismen zijn in staat aan te passen aan bijna alle omgevingen vanwege hun snelle groei en de genetische diversiteit. Adaptive laboratorium evolutie stelt micro-organismen om te evolueren onder omstandigheden ontworpen, die een manier van het selecteren van de individuele organismen harboring spontane mutaties die gunstig onder de gegeven omstandigheden biedt. De chemostaat techniek robuuster te bereiken kunstmatig aangedreven evolutie dan transfertechniek om de volgende redenen: (a)...

Micro-organismen kunnen overleven en zich aan te passen aan verschillende omgevingen. Onder zware stress, kan de aanpassing gebeuren via de overname van heilzame fenotypes door willekeurige genomische mutaties en de daaropvolgende positieve selectie 1-3. Daarom kan microbiële cellen aangepast door het veranderen van metabole of regulerende netwerken voor een optimale groei, die wordt aangeduid als &quot;adaptieve evolutie&quot;. Recente belangrijke microbiële tendensen, zoals het uitbreken van superbugs en het optreden van sterke microbiële stammen, zijn nauw verwant aan adaptieve evolutie onder stressvolle omstandigheden. Onder laboratoriumomstandigheden gedefinieerd, kunnen wij de mechanismen van moleculaire evolutie bestuderen en zelfs de richting van microbiële evolutie verschillende toepassingen te beheersen. In tegenstelling tot meercellige organismen, eencellige organismen zijn zeer geschikt voor adaptieve laboratorium evolutie (ALE) om de volgende redenen: ze snel herstellen, onderhouden ze grote populaties, en het is eenvoudig te maken en te onderhouden homogeneous omgevingen. Gecombineerd met recente ontwikkelingen in DNA sequencing technieken en high-throughput technologieën ALE maakt de directe waarneming van genomische veranderingen die leiden tot structurele veranderingen in regelgeving. Mutatie dynamiek en diversiteit van de bevolking zijn ook waarneembaar. Genetische manipulatie strategieën kunnen worden bepaald uit de analyse van ALE stammen 4,5. Chemostaat cultuur is een methode die wordt gebruikt om steady-state cellen te verkrijgen en de productiviteit in fermentatieprocessen 6 te verhogen. Vers medium wordt toegevoegd en kweekbouillon wordt tijdens het proces (de laatste omvat medium en biomassa) geoogst. Langdurige kweek chemostaat echter verandert de steady-state productiviteit van de kweek en brengt de accumulatie van spontane mutaties en selectie in kweek (Figuur 1a). Onder verschillende selectiedruk (stressoren), zal de accumulatie van mutaties verbeterd. Een geleidelijke toename van stress op lange termijn<html> chemostaat voorziet in een continue selectie van mutaties die werken tegen de gegeven stressoren, zoals temperatuur, pH, osmotische druk, voedingsmiddel verhongering, oxidatie, toxische eindproducten, enz Colony transfer van een vast medium en seriële overdracht van een vloeibaar medium (herhaalde batch cultuur) ook kunnen onderzoekers ontwikkelde micro-organismen (figuur 1b en 1c) ​​te verkrijgen. Hoewel chemostaat cultuur ingewikkelde methodes vereist, het zwembad van de diversiteit (het aantal herhalingen en de grootte van de populatie) is hoger dan die verkregen door kolonie overdracht en serial transfer technieken. De stabiele spanning blootstelling aan individuele cellen en verminderde variatie in de cellulaire toestand tijdens chemostaat cultuur (steady state) zijn andere voordelen van ALE in vergelijking met batch-cultuur gebaseerde technieken. Stress geïnduceerde ALE van Escherichia coli onderworpen aan hoge succinate omstandigheden die in dit artikel. iles / ftp_upload / 54446 / 54446fig1.jpg &quot;/&gt; Figuur 1: Methoden van adaptieve laboratorium evolutie (A) Chemostat;. (B) seriële overdracht; (C) kolonie overdracht. De bovenste cijfers illustreren het concept van de methoden voor het ALE en de onderste cijfers illustreren het aantal cellen die groeide tijdens ALE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54446/54446fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

<table><tbody><tr><td>Mini-chemostat fermentor</td><td>Biotron Inc.</td><td>-</td><td>vervaardigd op speciale bestelling</td></tr><tr><td>siliconen slang</td><td>Cole-Parmer</td><td>Masterflex L/S 13</td><td>slangmaat kan worden gevarieerd afhankelijk van de verdunningssnelheid en de grootte van de fermentorpot.</td></tr><tr><td>reservoirpot</td><td>Bellco</td><td>Media opslag fles</td><td>20 L</td></tr><tr><td>chemicaliën</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>-</td><td>reagenskwaliteit</td></tr><tr><td>glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td>ACS reagens</td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9434</td><td>voor moleculaire biologie, geschikt voor celcultuur, &ge;99,5%</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746398</td><td>ACS reagens, &ge;99%</td></tr><tr><td>Na2HPO4&middot;2H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>4272</td><td>98,5-101%</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>795488</td><td>ACS reagens, &ge;99%</td></tr><tr><td>MgSO4&middot;7H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td>ACS reagens, &ge;98%</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>793639</td><td>ACS reagens, &ge;96%</td></tr><tr><td>thiamine&middot;HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4625</td><td>reagenskwaliteit, &ge;99%</td></tr><tr><td>Na2&middot;succinate&middot;6H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2378</td><td>ReagentPlus, &ge;99%</td></tr></tbody></table>

procedure voor adaptive laboratorium evolutie van micro-organismen met behulp van een chemostat

Procedure for Adaptive Laboratory Evolution of Microorganisms Using a Chemostat

Natuurlijke evolutie omvat genetische diversiteit zoals veranderingen in de omgeving en een selectie tussen kleine populaties. Adaptieve laboratoriumevolutie (ALE) verwijst naar de experimentele situatie waarin evolutie wordt waargenomen met behulp van levende organismen onder gecontroleerde omstandigheden en stressfactoren; organismen worden daarbij kunstmatig gedwongen om evolutionaire veranderingen door te voeren. Micro-organismen worden in de omgeving blootgesteld aan verschillende stressfactoren en zijn in staat om bepaalde stress-induceerbare eiwitten te reguleren om hun overlevingskansen te vergroten. Natuurlijk voorkomende spontane mutaties brengen veranderingen teweeg in het genoom van een micro-organisme die zijn overlevingskansen beïnvloeden. Langdurige blootstelling aan chemostaatcultuur veroorzaakt een accumulatie van spontane mutaties en maakt de meest aanpasbare stam dominant. Vergeleken met de kolonie-overdracht- en seriële overdrachtmethoden brengt chemostaatcultuur het hoogste aantal celdelingen en dus het hoogste aantal diverse populaties met zich mee. Hoewel chemostaatcultuur voor ALE complexere kweekapparaten vereist, is het minder arbeidsintensief zodra de operatie begint. Vergelijkende genomische en transcriptoomanalyses van de aangepaste stam geven evolutionaire aanwijzingen over hoe de stressfactoren bijdragen aan mutaties die de stress overwinnen. Het doel van het huidige artikel is om versnelde evolutie van micro-organismen onder gecontroleerde laboratoriumomstandigheden tot stand te brengen.

Voor high-succinaat stress-adaptatie, de wild-type E. coli W3110 stam werd gekweekt in een chemostat bij D = 0,1 h-1 gedurende 270 dagen (figuur 2). <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/54446/54446fig2.jpg" /> Figuur 2: High-succinaat spanning aanpassing van E. coli W3110 gebruik chemostaat cultuur. Dunne pijlen geven de tijdstippen waarop de concentratie stressor werd verhoogd en vetge...

Hier presenteren we een protocol laboratorium adaptieve evolutie van micro-organismen onder omstandigheden met behulp chemostaat cultuur te verkrijgen. Ook is genomische analyse van het vrijkomende stam besproken.

Procedure voor Adaptive Laboratorium Evolutie van micro-organismen met behulp van een Chemostat

Natural evolution involves genetic diversity such as environmental change and a selection between small populations. Adaptive laboratory evolution (ALE) ...

Het algemene doel van deze procedure is om een micro-organisme in staat te stellen om zich onder laboratoriumomstandigheden te ontwikkelen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van de microbiologie, zoals relaties met de bijnierschorsfunctie, stressresponsen, metabole engineering en uiteraard evolutie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de continue selectie van de meest aangepaste nakomeling onder specifieke laboratoriumomstandigheden.Begin deze procedure met de voorbereiding van de apparatuur, evenals het initiële medium, het stressmedium en het medium voor hoge stress, zoals beschreven in het tekstprotocol. Inoculeer een enkele kolonie of wild-type E.coli in een reageerbuis van 15 ml met vier milliliter initieel medium. Incubeer de reageerbuis in een schudincubator gedurende 12 uur bij 37 °C en 220 rpm.Incubeer de chemostaatpot onder beluchting en agitatie bij 37 °C gedurende zes uur. Sluit na de incubatie de uiteinden van de siliconen slangen van de pompen aseptisch aan op de chemostaatpot. Draag aseptisch één milliliter van de precultuur over naar de chemostaatpot.Start de uitlaatpomp en verzamel de cultuur in de exponentiële fase. Controleer de optische dichtheid bij 600 nanometer van de cultuur uit de uitlaatleiding. Start vervolgens de inlaatpomp.Controleer elke 24 uur de optische dichtheid van de cultuur bij 600 nanometers vanuit de uitlaatslang. Nadat de chemostaat 96 uur heeft gedraaid, wat overeenkomt met 9,6 volledige omzettingen, wordt het reservoir vervangen door het medium met de laagste concentratie hoge stress. Wanneer u het reservoir vervangt door een medium met een hogere stress, kunnen de cellen in shock raken.Als de celdichtheid te laag is, stop dan tijdelijk met het toevoegen van het medium met hogere stress om de celdichtheid te herstellen. Als de optische dichtheid lager is dan 0,2, stop dan de toevoerpomp gedurende zes uur. Start de toevoerpomp opnieuw op en controleer of de optische dichtheid boven de 0,2 ligt.Verhoog geleidelijk de concentratie van de stressfactor door stapsgewijs over te stappen naar een reservoir met een hogere stressfactorconcentratie. Neem monsters van de aangepaste cultuur telkens wanneer een mijlpaal in de stressadaptatie wordt bereikt en bewaar deze voor verdere genomische analyse. Meng voor de bewaring van de monsters het cultuurmonster van 0.5 milliliter met 0.5 milliliters van een gesteriliseerde 80%glyceroloplossing en bewaar dit bij 80 degrees celsius.Bereid 1,6% agarplaatmedium voor dat dezelfde stressfactor in dezelfde concentratie bevat als in het medium. Plaat 0,1 milliliter van de uitlaatcultuur van de chemostaat en incubeer dit gedurende 16 uur bij 37 graden celsius. Selecteer na incubatie individuele kolonies van de plaat met een steriele tandenstoker en inoculeer deze in testbuisjes van 15 milliliter die dezelfde stressfactor bevatten in dezelfde mediumconcentratie als in de chemostaat.Incubeer gedurende zes uur. Draag één milliliter van het kweekmedium over naar een erlenmeyer van 250 milliliter die 50 milliliter medium bevat. Oogst elk uur 0,5 milliliter van het kweekmedium en meet de optische dichtheid bij 600 nanometer.Vergelijk de groeisnelheid van de aangepaste stam met die van de wildtype-stam bij blootstelling aan de stressfactor. De wildtype E.coli-stam werd 270 dagen lang geëvolueerd onder omstandigheden met een hoge succinaatstress, wat overeenkomt met bijna 930 generaties. Telkens wanneer er een hogere succinaatstress werd toegevoegd, daalde de biomassaconcentratie onmiddellijk om vervolgens weer te worden hersteld.Hier wordt een schematisch diagram getoond van de chemostaat met een mutant die tolerant is voor de hoge succinaatstress. De meeste wildtype-cellen worden onder de stresscondities uitgewassen en de mutant groeit meer. Uiteindelijk neemt de populatie van de nakomelingen van de mutant toe.De tweede en derde mutaties worden continu geselecteerd en domineren uiteindelijk de chemostaat. Deze figuur laat zien dat de aangepaste stam zonder vertraging groeide onder omstandigheden met een hoge succinaatstress, terwijl de wildtype-stam dat niet deed. Een vergelijkbare strategie kan worden toegepast op adaptieve laboratoriumevolutie met behulp van een chemostaat met een variatie aan stressfactoren.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u het micro-organisme kunt verkrijgen en laten evolueren onder een specifieke conditie. Zodra deze techniek onder de knie is, kan dit in enkele maanden worden voltooid. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om erop te letten dat de chemostaatcellen niet worden uitgespoeld door in één keer te veel stress toe te voegen, en vergeet niet om elke dag de optische dichtheid te controleren.Na deze procedure kunnen methoden zoals genoomanalyse en transcriptoomanalyse worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals welke mutatie bijdraagt aan de stresstolerante evolutie?

procedure-for-adaptive-laboratory-evolution-microorganisms-using

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Source: Jian, X., et al., Automated Microbial Cultivation and Adaptive Evolution using Microbial Microdroplet Culture System (MMC). J. Vis. Exp. (2022).This video demonstrates the use of a microbial microdroplet culture system to drive adaptive evolution of bacteria toward methanol tolerance. By mixing engineered bacterial cultures with a high-methanol stress medium and segmenting them into microdroplets, the system selects for mutants that exhibit improved growth under methanol stress. Through...

Adaptive Evolution of Bacteria Using a Microbial Microdroplet Culture System

Source: Jeong, H., et. al. Procedure for Adaptive Laboratory Evolution of Microorganisms Using a Chemostat. J. Vis. Exp. (2016).This video demonstrates the selective isolation and growth of stress-adapted bacteria from a culture exposed to prolonged stress conditions. The culture is plated on stressor-containing agar, and a single colony is selected to inoculate a liquid medium with the stressor. Absorbance is measured at regular intervals to monitor the growth and confirm the successful...

Isolation of Stress-Adapted Bacteria through Single Colony Selection

Celgroei tarief is een gereguleerd proces en een primaire determinant van cel fysiologie. Continue kweken met chemostaten maakt extrinsieke controle cellen groei met nutriënten limitatie de studie van moleculaire netwerken die celgroei en hoe deze netwerken ontwikkelen om optimale celgroei regelen vergemakkelijken.

Het gebruik van chemostaten in Microbiële Systems Biology

We ontwikkeld en gevalideerd een kleine voetafdruk array van miniatuur chemostaten opgebouwd uit gemakkelijk beschikbare onderdelen voor lage kosten. Fysiologische en experimentele evolutie resultaten waren vergelijkbaar met groter volume chemostaten. De Ministat reeks biedt een compacte, goedkope, en toegankelijk platform voor traditionele chemostaat experimenten, functionele genomica, en chemische screening toepassingen.

Ontwerp en gebruik van multiplexverzending chemostaat Arrays

We beschrijven een goedkope, configureerbare morbidostat die de karakterisering van antibioticaresistentie mogelijk maakt door de medicijnconcentratie dynamisch aan te passen. Het apparaat kan worden geïntegreerd met een multiplex microfluïdisch platform. De benadering kan worden opgeschaald voor laboratoriumstudies naar antibioticaresistentie.

Ontwerp en gebruik van een Low Cost, Automatiseren Morbidostat voor Adaptive evolutie van bacteriën onder antibioticum selectie

Het evolver Framework maakt een continue microbiële cultuur met hoge resolutie en dynamische controle over experimentele parameters mogelijk. Dit protocol laat zien hoe het systeem toe te passen om een complex fitness-experiment, begeleiden gebruikers op de programmering geautomatiseerde controle over vele individuele culturen, meten, verzamelen en interactie met experimentele gegevens in real-time.

Het ontwerpen van geautomatiseerde, high-throughput, continue celgroei experimenten met behulp van evolver

Dit protocol beschrijft hoe het Microbial Microdroplet Culture-systeem (MMC) kan worden gebruikt om geautomatiseerde microbiële teelt en adaptieve evolutie uit te voeren. MMC kan micro-organismen automatisch en continu cultiveren en subcultureren en online hun groei volgen met een relatief hoge doorvoer en goede parallellisatie, waardoor het arbeids- en reagensverbruik wordt verminderd.

Geautomatiseerde microbiële teelt en adaptieve evolutie met behulp van microbieel microdruppelcultuursysteem (MMC)

Dit protocol beschrijft hoe het Escherichia coli Long-Term Evolution Experiment (LTEE) kan worden gehandhaafd door de dagelijkse overdrachten en periodieke bevriezingen uit te voeren en hoe wedstrijdtests kunnen worden uitgevoerd om fitnessverbeteringen in geëvolueerde bacteriën te meten. Deze procedures kunnen dienen als een sjabloon voor onderzoekers die hun eigen microbiële evolutie-experimenten starten.

Dagelijkse overdrachten, archivering van populaties en het meten van fitness in het langetermijnevolutie-experiment met Escherichia coli

Hier presenteren we een experimenteel evolutieprotocol voor aanpassing bij thermofielen met behulp van goedkope, energiezuinige bench-top thermomixers als incubatoren. De techniek wordt gedemonstreerd door de karakterisering van temperatuuraanpassing in Sulfolobus acidocaldarius, een archaeon met een optimale groeitemperatuur van 75 °C.

Aanpassing aan de uitersten van het leven: experimentele evolutie met de extremofiele Archaeon Sulfolobus acidocaldarius

We presenteren een protocol voor het millifluidische continue kweekapparaat (MCCD), waarmee bacteriële populaties onder constante omstandigheden met weinig nutriënten (tot honderden nanomolaire concentraties) of temporele nutriëntenfluctuaties op een minimale tijdschaal kunnen worden gekweekt.

Een continu kweek millifluidisch apparaat voor de studie van Escherichia coli onder lage en fluctuerende voedingsomstandigheden

Leer adaptieve laboratoriumevolutie van micro-organismen met behulp van een chemostaat. Deze methode maakt continue selectie van stressbestendige afstammelingen mogelijk voor microbiologisch onderzoek.

Procedure voor Adaptive Laboratorium Evolutie van micro-organismen met behulp van een Chemostat

Meer video's verkennen