Protocollen voor het visualiseren steroidogenic organen en hun Interactive Organen met Immunokleuring in de fruitvlieg Drosophila melanogaster
14 april 2017
We beschrijven een protocol voor dissectie, fixatie en immunokleuring van steroidogenic organen in Drosophila larven en volwassen vrouwtjes steroïde hormonen biosynthese en haar reguleringsmechanisme bestuderen. Naast steroïdogene organen visualiseren we de innervatie van steroidogenic organen en steroidogene doelcellen zoals kiemlijn stamcellen.
Het algemene doel van deze procedure is om de steroïdogeene organen en hun interactieve organen te visualiseren in larven of volwassen vrouwtjes van de fruitvlieg, Drosophila melanogaster. Deze methode kan helpen bij het begrijpen van de biosynthese van insectensteroïden en het neuronale regulerende mechanisme dat ten grondslag ligt aan paring en metamorfose. Het grote voordeel van deze techniek is dat de innervatie van steroïdogeene organen en het relatieve gedeelte van hun interactieve organen intact blijft.
Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn in deze methode worstelen omdat de steroïdogeene organen in vliegenlarven vrij klein en transparant zijn. Mijn lab en ik zijn verheugd om onze dissectieprotocollen te delen. Dus, laten we beginnen.
Na het voorbereiden van de larven, start de dissectiecursus in een drie centimeter schaal gevuld met PBS, onder een dissectiemicroscoop. Grijp eerst de mondhaak met een pincet. Snijd vervolgens met microschaar het lichaam op ongeveer een derde van de lengte vanaf de voorkant af.
Houd vervolgens de voorkant met een paar pincetten vast en gebruik een tweede paar om voorzichtig de punt van het hoofd in het lichaam te duwen, om uiteindelijk het larvenlichaam binnenstebuiten te draaien. Bereid op deze manier maximaal 20 larven binnen 10 minuten voor en breng ze vervolgens over in een fixeervloeistof. Na 30 minuten wast u de preparaten en gaat u verder met immunokleuring.
Om te beginnen, laat de larven ongeveer een uur in water weken, om de larven te verstikken en zo te immobiliseren. Plaats vervolgens een larve met de rugzijde naar boven in een druppel PBS op een met siliconen gecoate schaal. De rugzijde heeft de twee trachea buizen.
Gebruik onder een dissectiemicroscoop een pincet om een insectenspeld in de voorkant te steken. Rek vervolgens het lichaam uit naar de achterkant en steek een tweede speld in de achterkant. Maak vervolgens een kleine incisie nabij de staart met microschaar.
Vanuit de incisie snijdt u voorzichtig de dorsale cuticula longitudinaal langs de dorsale middenlijn naar de kop, zonder de weefsels onder de cuticula te beschadigen. Nadat u de incisie hebt gemaakt, rek de lichaamswanden uit elkaar en zet ze vast met insectenspelden op de hoeken. Vervolgens verwijdert u met een pincet het voorste vetlichaam en de speekselklieren, waardoor het hersen-ringkliercomplex aan de oppervlakte wordt blootgesteld.
Zuig nu het PBS op en dompel de voorbereiding in een fixeervloeistof. Gebruik na 30 minuten pincet om de insectenspelden te verwijderen en breng de voorbereiding over in een microbuisje gevuld met 0,3% PBT. Ga vervolgens verder met immunokleuring.
Na het immunokleuren van de larven, gebruikt u een wegwerppipet om de monsters over te brengen naar een schaal gevuld met 0,3% PBT. Grijp onder een dissectiemicroscoop de cuticula of mondhaak vast met een paar pincetten. Gebruik vervolgens een naald van 27 gauge die aan een spuit van één milliliter is bevestigd, als een mes, om het hersen-ringklieroogschotelcomplex uit de lichaamscuticula te verwijderen, door de voorste punt van het slokdarm en de oogschotels weg te snijden.
Gebruik vervolgens een pincet om voorzichtig het slokdarm en het darmkanaal te scheiden van het hersen-ringklieroogschotelcomplex. Trek de darm naar de achterkant, omdat de slokdarm door de hersenen boven het ventrale zenuwsnoer passeert. Ten slotte snijdt u om het hersen-ringkliercomplex te isoleren voorzichtig de verbindingen tussen het hersendisco, oogdisco's en beendisco's door, met een naaldmes.
Het is heel belangrijk om tijdens de dissectie fijne pincetten met scherpe randen te gebruiken. Ik raad u ten zeerste aan om pincetten te slijpen met een stuk slijpsteen om hun randen samen te brengen zonder enige openingen. Gebruik een micropipet met een wijd boring tip om de monsters over te brengen.
Leg de monsters op het midden van de glasplaat. Gebruik vervolgens pincet om de monsters op hun ventrale kanten te plaatsen, zodat de ringklier, die zich aan de dorsale kant van de hersenen bevindt, kan worden afgebeeld. Kantel vervolgens de plaat en veeg zoveel mogelijk overtollig PBT weg.
Plaats vervolgens een druppel montagereagens nabij de monsters en gebruik pincet om langzaam een dekglas over het reagens en vervolgens over de monsters te laten zakken. Om de volwassen vrouwelijke eierstok te dissecteren, verdooft u de vliegen met kooldioxidegas. Snijd vervolgens hun hoofd af en breng hun lichaam over naar een drie centimeter schaal gevuld met PBS.
Grijp vervolgens onder een dissectiemicroscoop de dorsale kant van het borststuk met pincet en grijp een tweede paar pincetten aan het buiksegment A-5 of A-6 vast. Schil vervolgens de buikcuticula in de richting van de achterkant. Reinig voor het verdergaan de plakkerige cuticula van de pincetten.
Klep vervolgens een eileider vast en isoleer de eierstok. Kam vervolgens uit en spreid de punten van de eierstok met behulp van pincet. Eenmaal uitgespreid, dompelt u de eierstok gedurende 30 minuten in een fixeervloeistof om ze voor te bereiden op kleuring.
Om een voorbereiding te maken die de innervatie van de eierstok behoudt, brengt u verdoofde vrouwelijke vliegen over naar een met siliconen gecoate schaal gevuld met PBS. Onder de dissectiemicroscoop houdt u de slurf vast en schilt u de hoofdcuticula af om de hersenen bloot te leggen. Verwijder vanuit de hersenen de gehechte trachea, waardoor de hersenen verbonden blijven met het ventrale zenuwsnoer.
Houd vervolgens het borststuk aan de dorsale kant vast en verwijder de poten en vleugels. Schil vervolgens de ventrale cuticula van het borststuk af, beginnend bij de basis van elke poot. Zodra het VNC is blootgelegd, verwijdert u heel voorzichtig de resterende dorsale cuticula en spieren die aan het VNC zijn bevestigd, met behulp van pincet.
Schaad de verbindingen tussen de hersenen en het VNC niet. Gebruik vervolgens pincet om de buikcuticula a
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor het dissekeren, fixeren en immunokleuring van steroïdogenese organen in Drosophila-larven en volwassen vrouwtjes. De methode is bedoeld om de biosynthese van steroïde hormonen en de regulerende mechanismen ervan te visualiseren, inclusief de innervatie van deze organen en hun doelcellen.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Ontwikkelingsbiologie
- Endocrinologie
Achtergrond
- Drosophila melanogaster dient als modelorganisme voor het bestuderen van de biosynthese van steroïde hormonen.
- Het begrijpen van de neuronale regulerende mechanismen is cruciaal voor inzichten in paring en metamorfose.
- De techniek behoudt de innervatie van steroïdogenese organen.
- Het dissekeren van kleine en transparante organen kan uitdagend zijn voor nieuwkomers.
Doel van de studie
- Om steroïdogenese organen en hun interacties in Drosophila te visualiseren.
- Om de mechanismen van steroïde hormoonbiosynthese te verduidelijken.
- Om de neuronale controle van reproductieve en ontwikkelingsprocessen te onderzoeken.
Gebruikte methoden
- Dissectie van Drosophila-larven en volwassen vrouwtjes.
- Fixatie van steroïdogenese organen.
- Immunocleurtechnieken om structuren te visualiseren.
- Analyse van innervatiepatronen en interacties van doelcellen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle visualisatie van steroïdogenese organen bij zowel larven als volwassenen.
- Demonstratie van intacte innervatie van steroïdogenese organen.
- Inzichten in de interacties tussen steroïdogenese organen en stamcellen uit de kiemcellen.
- Totstandbrenging van een betrouwbaar protocol voor toekomstige studies.
Conclusies
- Het protocol biedt een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van steroïde hormoonbiosynthese.
- Het begrijpen van de regulerende mechanismen kan de kennis van insectenontwikkeling verbeteren.
- Deze methode kan worden aangepast voor verschillende onderzoekstoepassingen in neurobiologie en endocrinologie.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This protocol enables visualization of steroidogenic organs and their neuronal interactions in Drosophila, providing a genetically tractable model for studying hormone biosynthesis regulation. The method supports mechanistic de-risking in early discovery by preserving innervation patterns and tissue architecture, which is critical for understanding endocrine signaling pathways relevant to metabolic and reproductive targets. It offers a scalable approach for target validation in invertebrate models, facilitating hypothesis testing before mammalian translation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of steroid hormone biosynthesis pathways through direct visualization of ecdysteroidogenic organs and their enzymatic markers.
- Scientific Value: Supports functional target validation by mapping neuronal innervation of steroidogenic tissues, clarifying regulatory mechanisms.
- Operational Value: Provides a reproducible dissection and immunostaining workflow for consistent sample preparation across experiments.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative imaging readouts of organ structure and innervation, enabling phenotypic screening of genetic or pharmacological perturbations.
- Operational Value: Standardizes tissue preparation and staining protocols, improving assay reproducibility and cross-lab comparability.
- Scientific Value: Facilitates co-visualization of germline stem cells and steroidogenic organs, supporting biomarker-aligned assay development for reproductive signaling.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Establishes a disease-relevant system for studying steroid hormone regulation, with direct links to germline stem cell proliferation and developmental timing.
- Operational Value: Enables longitudinal analysis of organ interactions, supporting predictive modeling of endocrine disruption effects.
- Strategic Value: Supports mechanistic de-risking by linking neuronal activity to hormonal output, reducing uncertainty in target pathway validation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows, supporting progression from target hypothesis testing to mechanistic validation in neuroendocrine systems before lead identification stages.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of steroidogenic regulation by visualizing enzyme expression and neuronal connections in intact tissue preparations.
- Screening: Delivers quantitative, imaging-based outputs for assessing compound or genetic effects on organ morphology and innervation patterns.
- Analytics: Provides spatial and fluorescence readouts that allow comparative analysis across conditions, supporting data-driven target prioritization.
- Translational Research: Connects steroidogenic organ function to germline stem cell activity, offering a translational biomarker pathway for reproductive development studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for neuroendocrine phenotyping, adaptable across multiple targets and genetic backgrounds in Drosophila.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in steroid hormone regulatory networks.
- Operational Value: Enhances standardization and scalability of organ visualization workflows, enabling high-throughput sample processing.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by providing direct evidence of target engagement and pathway modulation in a physiological context.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by validating target relevance through conserved endocrine mechanisms observable in a genetic model.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microdissection and fluorescence microscopy for accurate tissue handling and imaging.
- Dependent on immunostaining reagents and transgenic lines for specific labeling of enzymatic and neuronal markers.
- Necessitates standardized fixation and permeabilization protocols to maintain antigenicity and tissue integrity across samples.
- Involves adaptation challenges when applying the protocol to different developmental stages or tissue types due to size and fragility variations.
- Limited by the need for specialized equipment such as fine forceps, micro scissors, and silicone-coated dishes to prevent tissue damage during dissection.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:57
Dissecting the Larval Ring Gland-brain Complex
1:53
Filleting Larvae to Maintain Relative Tissue Positions
3:35
Fine Dissection of the Brain-ring Gland Complex and Mounting
5:34
Dissection of Adult Ovary
6:36
Dissection of Adult Reproductive Organs Along with Other Interactive Tissues
8:15
Mounting of Adult Structures and Imaging
9:33
Results: Preparation images
11:13
Conclusion
