Protocollen voor het visualiseren steroidogenic organen en hun Interactive Organen met Immunokleuring in de fruitvlieg

Het algemene doel van deze procedure is om de steroidogene organen en hun interactieve organen te visualiseren in larven of volwassen vrouwtjes van de fruitvlieg, Drosophila melanogaster. Deze methode kan helpen bij het begrijpen van de biosynthese van insectensteroïdhormonen en het neuronale regulatiemechanisme dat ten grondslag ligt aan de paring en metamorfose. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de innervatie van de steroidogene organen en het relatieve aandeel van hun interactieve organen intact blijven.

Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben, omdat de steroidogene organen in vlieglarven zeer klein en transparant zijn. Mijn lab en ik zijn verheugd onze dissectieprotocollen te delen. Laten we beginnen.

Nadat de larven zijn voorbereid, start u de dissectie in een schaal van drie centimeter gevuld met PBS, onder een dissectiemicroscoop. Pak eerst de mondhaak vast met een pincet. Knip vervolgens, met behulp van microschaartjes, het lichaam door op ongeveer een derde van de lengte vanaf de anterieure tip.

Houd vervolgens het voorste gedeelte vast met één pincet en gebruik een tweede pincet om de kop voorzichtig in het lichaam te duwen, om zo het larvale lichaam volledig binnenstebuiten te keren. Bereid op deze manier tot 20 larven voor binnen 10 minuten en breng ze daarna over naar de fixeeroplossing. Was de preparaten na 30 minuten en ga verder met de immunokleuring.

Begin hiermee door de larven ongeveer één uur in water ondergedompeld te laten, zodat ze verstikken en hiermee geïmmobiliseerd worden. Plaats vervolgens een larve met de rugzijde naar boven in een druppel PBS op een met silicone gecoate schaal. De rugzijde is herkenbaar aan de twee tracheale buizen.

Plaats met behulp van een dissectiemicroscoop en een pincet een insectenspeld in de voorzijde. Rek vervolgens het lichaam uit naar de achterzijde en plaats een tweede speld in de achterzijde. Maak daarna met microschaaren een kleine incisie nabij de staart.

Maak vanaf de incisie de dorsale cuticula voorzichtig in de lengte open langs de dorsale middellijn in de richting van de kop, zonder de weefsels onder de cuticula te beschadigen. Trek na het maken van de incisie de lichaamswanden uit elkaar en zet deze in de hoeken vast met insectenspeldjes. Verwijder vervolgens met een pincet het anterieure vetlichaam en de speekselklieren, waardoor het hersen-ringkliercomplex aan het oppervlak zichtbaar wordt.

Zuig nu de PBS af en dompel het preparaat onder in de fixeeroplossing. Verwijder na 30 minuten de insectenspeldjes met een pincet en breng het preparaat over in een microbuis gevuld met 0,3% PBT. Ga vervolgens verder met de immunokleuring.

Nadat de larven zijn geïmmunogekleurd, gebruikt u een wegwerppipet om de monsters over te brengen naar een schaaltje gevuld met 0,3% PBT. Pak onder een dissectiemicroscoop de cuticula of de mondhaak vast met een pincet. Gebruik vervolgens een naald van 27 gauge, bevestigd aan een spuit van één milliliter, als een mes om het complex van hersenring-klier-oogschijf uit de lichaamscuticula te verwijderen door de anterieure tip van de slokdarm en de oogschijven weg te snijden.

Scheid vervolgens met een pincet voorzichtig de slokdarm en het darmkanaal van het complex van hersenring-klier-oogschijf. Trek het darmkanaal naar de posterieure zijde, aangezien de slokdarm boven het ventrale zenuwstreng door de hersenen loopt. Snijd ten slotte, om het hersenring-kliercomplex te isoleren, voorzichtig de verbindingen tussen de hersenschijf, de oogschijven en de pootschijven door met een naaldmes.

Het is essentieel om tijdens de dissectie fijne pincetten met scherpe randen te gebruiken. Ik raad ten zeerste aan om de pincetten te slijpen met een slijpsteen, zodat de randen zonder tussenruimtes op elkaar aansluiten. Gebruik voor het overbrengen van de monsters een micropipet met een tip met een wijde opening.

Plaats de monsters in het midden van het glasplaatje. Gebruik vervolgens een pincet om de monsters op hun ventrale zijde te positioneren, zodat de ringklier, die zich aan de dorsale zijde van het brein bevindt, kan worden afgebeeld. Kantel daarna het plaatje en veeg zoveel mogelijk van het overtollige PBT weg.

Plaats vervolgens een druppel monteermiddel nabij de monsters en gebruik een pincet om langzaam een dekglas over het reagens en vervolgens over de monsters te laten zakken. Om het ovarium van ein volwassen vrouwtje te dissekeren, worden de vliegen geneutraliseerd met koolstofdioxidegas. Snijd vervolgens hun koppen af en breng hun lichamen over naar een schaal van drie centimeter gevuld met PBS.

Grijp vervolgens, onder een dissectiemicroscoop, de dorsale zijde van de thorax vast met een pincet en houd abdominal segment A-5 of A-6 vast met een tweede pincet. Pel daarna de abdominale cuticula af richting de posterieure zijde. Maak de kleverige cuticula van het pincet schoon voordat u verdergaat.

Knel vervolgens een oviduct af en isoleer de ovaria. Kam daarna de uiteinden van de ovaria uit en spreid deze met een pincet. Dompel de gespreide ovaria gedurende 30 minuten in een fixeeroplossing om ze voor te bereiden op de kleuring.

Om een preparaat te maken waarbij de innervatie van de eierstok behouden blijft, brengt u gesomatiseerde vrouwelijke vliegen over naar een met siliconen gecoate schaal gevuld met PBS. Houd onder de dissectiemicroscoop de proboscis vast en pel de cuticula van de kop weg om de hersenen bloot te leggen. Verwijder vanuit de hersenen de vastzittende trachea, terwijl de hersenen verbonden blijven met het ventrale zenuwkoord.

Houd vervolgens de thorax aan de dorsale zijde vast en verwijder de poten en vleugels. Pel daarna de ventrale cuticula van de thorax af, beginnend bij de basis van elke poot. Zodra de VNC is blootgelegd, worden de resterende dorsale cuticula en de aan de VNC gehechte spieren zeer voorzichtig met een pincet verwijderd.

Beschadig de verbindingen tussen de hersenen en de VNC niet. Pel vervolgens met een pincet de abdominale cuticula weg om de ovaria en hun interactieve organen bloot te leggen, waaronder de steunstructuur, het darmkanaal, de eileider, de baarmoeder en de accessoire klier. Verwijder tot slot alle resterende weefsels, inclusief de trachea en het vetlichaam.

Dompel de monsters vervolgens gedurende 30 minuten onder in de fixeeroplossing om ze voor te bereiden op immunokleuring. Breng de monsters na de immunokleuring met een micropipet over naar een glazen objectglas met 0,1% PBT. Bekijk daarna het objectglas onder een microscoop en scheid de strengen van de ovariolen van elkaar met een pincet.

Zorg ervoor dat de uiteinden van de ovariolen tijdens dit proces niet beschadigd raken. Deze bevatten de germaria. Verwijder bij het prepareren van het complex van brein en voortplantingsorganen eventuele resterende cuticula en spreid de structuren uit op het objectglas.

Veeg vervolgens het grootste deel van het overtollige PBT af en breng daarna een druppel monteermiddel aan op het monster. Plaats vervolgens voorzichtig met een pincet een dekglas op het preparaat en bewaar het preparaat bij vier graden celsius in het donker. Observeer later de monsters onder de microscoop en breng de steroidogene organen in het gezichtsveld.

Zodra het beeld is vastgelegd, schakelt u het beeldvormingssysteem over naar de modus voor beeldacquisitie. Tijdens de larvale stadia werd de prothoraxklier gelabeld met antilichamen tegen ecdysteroïdogene enzymen, waaronder het anti-shroud antilichaam. Om de neuronale verbinding tussen de prothoraxklier en de hersenen te visualiseren, is het hersen-ringkliercomplex gedisseceerd.

De filet-dissectiemethode toont het stomatogastrische zenuwstelsel, waarin een groep serotonerge neuronen projecteert naar de prothoracale klier, de proventriculus en de faryngeale spieren. Bij volwassen vrouwtjes beïnvloeden ovariale ecdysteroïden vele aspecten van de ovogenese, zoals de proliferatie van GSC's. De GSC's bevinden zich in het germarium aan de top van elke ovariole in het ovarium.

Binnen het germarium werden de GSC's specifiek gelabeld met behulp van twee antilichamen, 1B1 en DE-cadherine. Om de innervatie van het ovarium te visualiseren, werd het ovarium gedisseceerd, samen met de hersenen, VNC, darm, prop, uterus en spermatheca. Neuronen werden gevisualiseerd door mCD8:GFP onder controle van de n-Synaptobrevin GAL4-driver.

Daarnaast werden de spierstructuren gekleurd met geconjugeerd phalloïdine. Hoewel de dissectie van de steroidogene organen in het begin moeilijk kan aanvoelen, kunt u deze video gebruiken om het snijpunt van de weefsels te leren, zodat u het orgaan gemakkelijker en zonder beschadiging kunt isoleren. We hopen dat ons protocol informatief is, niet alleen voor beginners, maar ook voor ervaren onderzoekers.

Zodra u deze procedure onder de knie heeft, kunt u deze toepassen op uw onderzoek en aanpassen aan uw specifieke behoeften. We hopen dat dit protocol bijdraagt aan een uitgebreid begrip van de biosynthese van steroïdhormonen. Meer gedetailleerde stapsgewijze protocollen zijn beschikbaar in het manuscript.

Bekijk het a.u.b.