Anatomisch Geïnspireerde Driedimensionale Microweefsel Geanimeerde Neurale Netwerken voor Nervous System Reconstructie, Modulatie en Modellering

Dit protocol beschrijft de fabricage van micro-tissue engineered neural networks of micro-TENNs, wat miniatuur driedimensionale constructen zijn die bestaan uit lange, uitgelijnde axonale banen die verschillende neuronale populaties overspannen binnen het lumen van een tubulaire hydrogel. Micro-TENNs bootsen de algemene anatomie op systeemniveau van het connectoom van de hersenen na, specifiek functioneel vergelijkbare groepen neuronen die met elkaar verbonden zijn door lange axonale banen. Omdat ze vooraf zijn gekweekt om de cytoarchitectuur van hersenpaden na te bootsen, kunnen micro-TENNs worden toegepast voor de gerichte reconstructie van neurale circuits die verloren zijn gegaan door trauma of neurodegeneratieve ziekten, en als biofidele modellen voor neurobiologische studies.

Een van de meest uitdagende aspecten van dit protocol is het werken met de schaal in micrometers, wat uiteindelijk noodzakelijk is om een minimaal invasieve toediening in de hersenen mogelijk te maken. Begin met het handmatig breken van glazen capillaire buisjes in fragmenten van 2 tot 2,5 centimeter en plaats in elk fragment één acupuctuurnaald. Breng één milliliter drie procent agarose in DPBS aan op het oppervlak van een lege petrischaal.

Houd de capillaire buis in de ingevoerde naald en plaats één uiteinde van de buis in contact met de vloeibare agarosepool om deze door capillaire werking te vullen. Wanneer de vloeistof niet meer stijgt, wordt de capillaire buis uit de pool verwijderd en horizontaal op het oppervlak van een petrischaal geplaatst. Plaats vervolgens de duim en wijsvinger aan weerszijden van de buis en knijp stevig samen.

Gebruik de andere hand om de naald snel terug te trekken, terwijl de duim en wijsvinger voorkomen dat de microkolom zelf uit de buis glijdt. Voer vervolgens een naald van 30 gauge in de capillaire buis in om de microkolom langzaam in een schaal met DPBS te duwen. Verplaats voorzichtig één microkolom van de DPBS naar een lege schaal met behulp van een fijne pincet.

Voeg met een micropipet 10 µL DPBS toe aan de bovenkant van de microkolom om uitdroging te voorkomen. Trim de microkolom onder een stereomicroscoop met een microscalpel tot de gewenste lengte. Gebruik vervolgens een fijne pincet om de getrimde microkolom over te brengen naar een andere petrischaal met DPBS.

Steriliseer de microkolommen in de petrischalen met DPBS gedurende 30 minuten onder ultraviolet licht. Gebruik een boortje om 16 gaatjes in het deksel van een petrischaal van 10 centimeter te maken, in een matrix van 4 bij 4 over een oppervlak van 4 centimeter met een tussenruimte van 1 centimeter. Weeg in een chemische zuurkast 27 gram PDMS en drie gram uithardingsmiddel af in de bodem van een petrischaal.

Roer met een microspatel om het middel gelijkmatig te verspreiden. Dek vervolgens het PDMS-uithardingsmiddel af met het geperforeerde deksel. Verbind één uiteinde van een slang met de vacuümpoort van de zuigkast en steek het andere uiteinde in de steel van een trechter van passende grootte.

Plaats een 1-ml pipetbulb op een 1-ml tip in de slang en trek de slang omhoog tot de bulb de slangtenziensluiting in de steel van de trechter vormt. Plaats vervolgens de trechter op het geperforeerde schoteldeksel en bevestig de slang met een beschikbare stevige ondersteuning. Open de vacuümklep gedurende vijf minuten om vacuüm te trekken en de luchtbellen naar het oppervlak te brengen.

Sluit na vijf minuten het ventiel, verwijder de trechter en tik de petrischaal een paar keer tegen het oppervlak van de zuurkast om eventuele resterende luchtbellen te laten knappen. Plaats een 3D-geprinte mal met piramidevormige putjes in elk van de putjes van een 12-wells kweekplaat, waarbij de piramides naar boven wijzen. Giet vervolgens het PDMS-uithardingsmiddel over de mallen totdat elk putje van de plaat is gevuld.

Plaats de afgedekte plaat gedurende één uur in een oven bij 60 °C om te drogen. Nadat de PDMS-arrays door autoclaveren zijn gesteriliseerd en terwijl er in een veiligheidskabinet wordt gewerkt, wordt in elke put van een steriele 12-wells plaat één micro-well array geplaatst. Om de neurale aggregaten te vormen, wordt met een micropipet 12 µL celсусpensie in elke micro-well van de PDMS-array toegevoegd.

Centrifugeer de plaat bij 200 ×g gedurende vijf minuten om de aggregatie van cellen op de bodem van de microwells te forceren. Voeg vervolgens voorzichtig ongeveer twee milliliter cultuurmedium toe aan de bovenkant van elke PDMS-array om alle gezaaide microwells te bedekken. Incubeer de plaat gedurende 12 tot 24 uur bij 37 °C in 5% koolstofdioxide.

Om te beginnen met de fabricage van de CEM-kern, mengt u Type 1 collageen, laminine en kweekmedium in een microcentrifugebuisje en stelt u de pH in op 7,2 tot 7,4. Plaats vervolgens de buis met CEM op ijs. Gebruik steriele pincetten om de microkolommen over te brengen naar lege petrischalen van 35 of 60 millimeter.

Gebruik vervolgens, terwijl u onder een stereomicroscoop werkt, een 10-µL tip bevestigd aan een 1000-µL tip om resterende DPBS en luchtbellen uit het lumen te verwijderen. Zuig snel vier tot vijf µL CEM op met een micropipet, plaats de punt van de micropipet aan één uiteinde van een microkolom en breng voldoende CEM aan om het lumen te vullen. Voeg om uitdroging te voorkomen twee µL CEM rondom elke microkolom toe.

Incubeer de hydrogel CEM-microkolommen in petrischalen bij 37 °C in 5% koolstofdioxide gedurende 15 minuten. Ga direct na de incubatie over tot het uitzaaien van de cellen. Breng ongeveer 10 tot 20 µL kweekmedium over naar twee vrije gebieden in de petrischalen waarin de microkolommen zich bevinden.

Gebruik een micropipet om de neuronale aggregaten afzonderlijk op te vangen en breng deze over naar de petrischaal waarin de constructen zich bevinden. Verplaats de aggregaten met een pincet naar een van de kleine plasjes cultuurmedium om de celvitaliteit te behouden. Gebruik, terwijl u door een stereomicroscoop observeert, een pincet om een aggregaat aan één uiteinde van de microkolommen te plaatsen voor unidirectionele micro-TENNs, of aan beide uiteinden voor een bidirectionele architectuur.

Verplaats de gezaaide microkolom vervolgens naar het andere kleine reservoir met kweekmedium om uitdroging te voorkomen en de gezondheid van de aggregaten te behouden. Wanneer alle microkolommen zijn geladen, worden deze gedurende 45 minuten geïncubeerd bij 37 °C in 5% koolstofdioxide om de aggregaten aan het CEM te laten hechten. Controleer na incubatie met het stereomicroscoop of de aggregaten aan de uiteinden van de microkolommen zijn gebleven.

Vul tot slot de petrischalen met de micro-TENNs voorzichtig met kweekmedium met behulp van een pipet. Plaats de schalen in een incubator bij 37 °C in 5% koolstofdioxide voor langdurige kweek. Deze fasecontrastbeelden tonen unidirectionele micro-TENNs van 2 mm lang tot acht dagen in-vitro.

Let in deze afbeeldingen op de neuronale aggregaten aan de uiteinden van de microkolom, terwijl de uitgelijnde axonale banen over het lumen lopen. Zoals hier te zien is, strekken de axonale banen zich na vijf dagen in-vitro over bijna de volledige lengte van de microkolom uit. Voor bidirectionele micro-TENNs van 5 millimeter bezetten de axonale banen na 5 dagen in-vitro de volledige lengte van de microkolom, en deze architectuur blijft ten minste tot 10 dagen in-vitro behouden.

De volgende twee afbeeldingen kunnen helpen bij het oplossen van problemen met de procedure. Deze afbeelding toont een volledig gedehydrateerde gedroogde hydrogel-microkolom als gevolg van de volledige verwijdering en/of verdamping van DPBS, CEM of kweekmedium tijdens de fabricage. Deze afbeelding toont een microkolom waarbij het lumen langs de buitenwand loopt door een gebrek aan concentrische uitlijning van de acupuctuurnaald met de capillaire buis.

Ten slotte laat deze confocale afbeelding een bidirectioneel micro-TENN zien na 28 dagen in vitro, waarbij celkernen zijn gekleurd met Hoechst in blauw, axonen zijn gelabeld met tauge one in rood en presynaptische boutons zijn gelabeld met synapsine 1 in groen. Celmigratie vanuit de aggregaten langs de axonale banen is zichtbaar in de aanwezigheid van presynaptische terminals, zoals gesuggereerd. Micro-TENNs zijn zelfvoorzienende, anatomisch geïnspireerde constructen die cruciale aspecten van de cytoarchitectuur van het connectoom nabootsen; daarom kunnen micro-TENNs een middel bieden om verloren neurale banen te vervangen na implantatie in de hersenen.

Cruciale componenten van deze methode omvatten het schema voor de tubulaire biomateriaalomhulling, dat longitudinale axonale groei mogelijk maakt, en de aggregaatmethode, die waarborgt dat de juiste cytoarchitectuur van cellichamen wordt verkregen, beperkt tot de uiteinden van de axonale banen langs het interieur. Na het beheersen van deze methoden kunnen de principes van deze techniek worden toegepast om micro-TENN's te bouwen met andere celphenotypes en biomateriaalcomponenten, afhankelijk van de specifieke toepassing.