Anatomisch Geïnspireerde Driedimensionale Microweefsel Geanimeerde Neurale Netwerken voor Nervous System Reconstructie, Modulatie en Modellering
31 mei 2017
Dit manuscript bevat informatie over de fabricage van micro-tissue-gemanipuleerde neurale netwerken: driedimensionale micron-grootte constructies die bestaan uit lange uitgelijnd axonale tracten die de geaggregeerde neuronale populatie (n) in een buisvormige hydrogel bekleden. Deze levende steigers kunnen dienen als functionele relais om neurale circuits te reconstrueren of te moduleren of als biofidelische testbedden die grijze-witte materie-neuroanatomie nabootsen.
Dit protocol beschrijft de fabricage van micro-weefsel geënginnerde neurale netwerken of micro-TENNs, die zijn miniatuur driedimensionale constructies bestaande uit lange uitgelijnde axontracten die discrete neuronale populaties binnen het lumen van een buisvormige hydrogel overspannen. Micro-TENNs repliceren de algemene anatomie van het connectoom van de hersenen op systeemniveau, specifiek functioneel vergelijkbare groepen neuronen verbonden door lange axontracten. Omdat ze vooraf zijn gekweekt om de cytoarchitectuur van hersenpaden na te bootsen, kunnen micro-TENNs worden toegepast voor de gerichte reconstructie van neurale circuits die verloren zijn gegaan door trauma of neurodegeneratieve ziekte en als biofidele modellen voor neurobiologische studies.
Een van de meest uitdagende aspecten van dit protocol is het werken met de micron schaalformaat, die uiteindelijk noodzakelijk is om een minimaal invasieve levering in de hersenen mogelijk te maken. Begin door handmatig glazen capillaire buisjes in fragmenten van 2 tot 2,5 centimeter te breken en één acupunctuurnaald in elk fragment te steken. Breng één milliliter van drie procent agarose in DPBS over naar het oppervlak van een lege petrischaal.
Houd de capillaire buis in de geïntroduceerde naald vast, plaats één uiteinde van de buis in contact met de vloeibare agarosepool om deze door capillaire actie te vullen. Wanneer de vloeistof ophoudt te stijgen, verwijder de capillaire buis uit de pool en plaats deze horizontaal op het oppervlak van een petrischaal. Plaats vervolgens de duim en wijsvinger aan weerszijden van de buis en grijp stevig vast.
Gebruik de andere hand om snel de naald uit te trekken terwijl de duim en wijsvinger voorkomen dat de micro-kolom uit de buis glijdt. Steek vervolgens een 30-gauge naald in de capillaire buis om de micro-kolom langzaam uit een schaal met DPBS te duwen. Breng voorzichtig één micro-kolom van DPBS over naar een lege schaal met behulp van fijne pincetten.
Voeg 10 microliter DPBS toe aan de bovenkant van de micro-kolom met een micropipet om uitdroging te voorkomen. Terwijl u onder een stereomicroscoop werkt, kort de micro-kolom met een microscalpel om deze tot de gewenste lengte te verkorten. Gebruik vervolgens fijne pincetten om de bijgesneden micro-kolom over te brengen naar een andere petrischaal met DBPS.
Steriliseer de micro-kolommen in de DPBS-bevattende petrischalen onder ultraviolet licht gedurende 30 minuten. Gebruik een boortje om 16 gaten te maken als een 4 centimeter 4 bij 4 array met een 1 centimeter scheiding in het deksel van een 10 centimeter petrischaal. Gebruik binnen een chemische afzuigkap het onderste deel van een petrischaal om 27 gram PDMS en drie gram verhardingsmiddel te wegen.
Roer met een microlepel om het middel gelijkmatig te verdelen. Bedek vervolgens het PDMS-verhardingsmiddel met het geperforeerde deksel. Verbind één uiteinde van een slang met de vacuümpoort van de afzuigkap en steek het andere uiteinde in de stengel van een geschikt formaat trechter.
Plaats een 1-milliliter pipetbulb op een 1-milliliter punt in de slang en trek de slang omhoog totdat de bulb de slang in de stengel van de trechter afdicht. Plaats vervolgens de trechter op het geperforeerde schoteldeksel en zet de slang vast met een beschikbare stevige ondersteuning. Open de vacuümklep gedurende vijf minuten om de luchtbellen aan het oppervlak te brengen.
Na vijf minuten sluit u de klep, verwijdert u de trechter en slaat u de petrischaal een paar keer tegen het oppervlak van de afzuigkap om eventuele resterende luchtbellen te breken. Plaats een piramidale 3D-geprinte mal in elk van de putjes in een 12-wels kweekplaat met de piramides naar boven wijzend. Giet vervolgens het PDMS-verhardingsmiddel bovenop de mallen totdat elke put van de plaat is gevuld.
Breng de bedekte plaat gedurende één uur bij 60 graden Celsius in een oven om te drogen. Nadat de PDMS-arrays zijn gesteriliseerd door middel van autoclavage en werken in een bioveiligheidskast, steekt u een micro-puttenarray in elk putje van een steriele 12-welsplaat. Om de neuronale aggregaten te vormen, gebruikt u een micropipet om 12 microliter celsuspensie in elk microputje van de PDMS-array toe te voegen.
Centrifugeer de plaat gedurende vijf minuten bij 200 keer g om de aggregatie van cellen op de bodem van de microputjes te forceren. Voeg vervolgens voorzichtig ongeveer twee milliliter kweekmedium toe aan de bovenkant van elke PDMS-array om alle gezaaide microputjes te bedekken. Incubeer de plaat gedurende 12 tot 24 uur bij 37 graden Celsius in 5% koolstofdioxide.
Om te beginnen met de fabricage van CEM-kern, meng Type 1 collageen, laminine en kweekmedium in een microcentrifugebuis en pas de pH aan tot 7,2 tot 7,4. Plaats vervolgens de buis met CEM op ijs. Gebruik steriele pincetten om de microkolommen over te brengen naar lege 35 of 60 millimeter petrischalen.
Gebruik vervolgens, terwijl u onder een stereomicroscoop werkt, een 10-microliter punt die is bevestigd aan een 1000-microliter punt om resterend DPBS en luchtbellen uit het lumen te extraheren. Trek snel vier tot vijf microliter CEM op in een micropipet en plaats de punt van de micropipet aan één uiteinde van een micro-kolom en laat voldoende CEM uit om het lumen te vullen. Om uitdroging te voorkomen, voegt u twee microliter CEM toe rond elke micro-kolom.
Incubeer de hydrogel CEM micro-kolommen in petrischalen bij 37 graden Celsius in 5% koolstofdioxide gedurende 15 minuten. Ga direct na incubatie verder met celzaaien. Breng ongeveer 10 tot 20 microliter kweekmedium over naar twee vrije gebieden in de petrischalen met de microkolommen.
Gebruik een micropipet om de neuronale aggregaten individueel te verzamelen en breng ze over naar de petrischaal met de constructen. Verplaats de aggregaten met pincetten naar een van de kleine zwembadjes kweekmedium om de gezondheid van de cellen te behouden. Terwijl u onder een stereomicroscoop observeert, gebruikt u pincetten om een aggregaat aan één uiteinde van de
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit manuscript beschrijft de fabricage van micro-weefsel-gebouwde neurale netwerken (micro-TENN's), driedimensionale constructen met uitgelijnde axon-tracts en geaggregeerde neuronale populaties binnen een hydrogel. Deze levende skeletten kunnen neurale circuits reconstrueren of moduleren en dienen als modellen voor neurobiologische studies.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Weefselengineering
- Neurobiologie
Achtergrond
- Micro-TENN's repliceren de anatomie van de hersenconnectome.
- Ze bestaan uit lange axon-tracts die neuronale populaties verbinden.
- Deze constructen zijn ontworpen voor minimaal invasieve levering in de hersenen.
- Ze kunnen helpen bij het reconstrueren van neurale circuits die verloren zijn gegaan door trauma of ziekte.
Doel van het onderzoek
- Om micro-TENN's te fabriceren voor reconstructie van neurale circuits.
- Om biofidelic modellen te creëren voor neurobiologische studies.
- Om de cytoarchitectuur van hersenpaden na te bootsen.
Gebruikte methoden
- Handmatig breken van glazen capillaire buisjes in fragmenten.
- Inbrengen van acupuncturnaalden in de fragmenten.
- Bereiding van agarose-oplossing voor de constructen.
- Gebruik van een buisvormige hydrogel voor neuronale aggregatie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle fabricage van micro-TENN's die hersenstructuren nabootsen.
- Aangetoond potentieel voor reconstructie van neurale paden.
- Een methode vastgesteld voor het creëren van levende skeletten voor onderzoek.
- Uitdagingen gesignaleerd in het werken met micron-schaal constructen.
Conclusies
- Micro-TENN's zijn veelbelovende tools voor neurowetenschappelijk onderzoek.
- Ze kunnen de studie van neurale circuits en hersenfunctie vergemakkelijken.
- Verdere ontwikkeling kan hun toepassing in regeneratieve geneeskunde verbeteren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Micro-tissue engineered neural networks (micro-TENNs) offer a reproducible platform for reconstructing lost neural pathways and modeling brain connectome architecture in vitro. This technology addresses a critical gap in CNS repair and provides a scalable system for studying neurobiological mechanisms relevant to neurodegeneration and trauma. The approach enables predictive confidence in translational research and supports risk-adjusted portfolio decisions in neurotherapeutic development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of neuronal connectivity and pathway-specific mechanisms in a controlled 3D environment.
- Supports biological de-risking by recapitulating brain cytoarchitecture for functional target validation.
- Facilitates predictive confidence in selecting disease-relevant neural circuits for intervention.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, reproducible constructs for quantitative assessment of neuronal and axonal responses.
- Enables assay development with aligned axonal tracts and defined neuronal populations for compound evaluation.
- Supports scalability and platform reuse for high-content screening of neuroactive agents.
Translational & Preclinical Research
- Offers biofidelic models for studying synaptic integration, network modulation, and regenerative processes.
- Aligns with translational biomarker strategies by enabling in vitro modeling of CNS circuitry and repair.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation of neuroregenerative interventions.
Pipeline & Workflow Integration
Micro-TENNs integrate into the discovery-to-preclinical continuum by providing a modular system for hypothesis testing, mechanistic de-risking, and quantitative analytics in neural tissue engineering.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis-driven studies of neuronal aggregation, axonal growth, and synaptic formation.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for comparing neuroactive conditions and interventions.
- Analytics: Enables measurement of axonal extension, synaptic distribution, and intrinsic electrical activity.
- Translational Research: Bridges in vitro modeling with preclinical strategies for CNS reconstruction and modulation.
- Enterprise Reuse: Provides a flexible platform adaptable to various cell types and biomaterials for diverse R&D needs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in CNS pathway studies.
- Operational Value: Standardizes fabrication and culture of neural constructs for reproducible results.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital allocation in neuroregenerative portfolios.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of CNS repair and modeling programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neural tissue engineering and microscale fabrication techniques.
- Demands access to stereomicroscopy, cell culture, and imaging infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization for construct preparation and analysis.
- Adaptable to different neuronal phenotypes and biomaterial compositions as supported by application needs.
- Practical limitations include handling at micron scale and maintaining construct hydration and alignment.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
9:51
Conclusion
8:14
Results: Observation of Axonal Growth in Micro-TENNs by Phase-contrast Imaging and Cytoarchitecture by Confocal Microscopy
0:58
Micro-column Fabrication Using Capillary Tubes
2:04
Micro-column Trimming and Sterilization
2:48
Preparation of the Pyramidal Micro-well Array
4:46
Formation of Neuronal Aggretates
5:27
ECM Core Fabrication
6:42
Neuronal Aggregate Seeding of Micro-columns
