Microgel-extracellulaire matrixcomposietondersteuning voor het ingebed 3D-printen van menselijke neurale constructies

Ingebed 3D-printen in SHAPE-composieten overwint traditionele biofabricagebeperkingen om nauwkeurige patronen van mechanisch gevoelige weefsels in hydrogels mogelijk te maken die lijken op de oorspronkelijke extracellulaire omgeving. SHAPE toolbox vertrouwt op modulair biomateriaalontwerp, waardoor eenvoudige wijzigingen in de formulering van de afdrukondersteuning mogelijk zijn. Het maakt ook gebruik van goedkope materialen en toegankelijke apparatuur voor eenvoudige aanpassing door andere onderzoeksgroepen.

Deze benadering kan worden toegepast om ruimtelijk gedefinieerde menselijke neurale weefselmodellen te creëren voor het onderzoeken van neuronale ontwikkeling en communicatie bij neurodegeneratieve aandoeningen zoals Parkinson. Begin met het bereiden van calciumcarbonaatoplossing in ultrapuur water met een concentratie van twee milligram per milliliter. Meng het met de alginaatoplossing in een gelijke verhouding en roer het magnetisch bij 650 RPM gedurende een uur bij kamertemperatuur.

Voeg vervolgens azijnzuur toe aan dit mengsel in een verhouding van één tot 500 en roer opnieuw een nacht. Fragmenteer de volgende dag de gelei alginaatoplossing mechanisch in microdeeltjes bij 15.000 RPM gedurende 10 minuten met behulp van een homogenisator. Centrifugeer vervolgens om de microdeeltjes te verkrijgen.

Gooi het supernatant voorzichtig weg en resuspendien de deeltjes in de DMEM, die twee millimolaire natriumhydroxide en 1% penicillinestreptomycine bevatten. De kleur van de suspensie moet weer rood worden. Incubeer de suspensie 's nachts bij vier graden Celsius.

Na incubatie, homogeniseer de suspensie gedurende drie minuten bij 15.000 RPM en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 18.500 G. Verwijder na het centrifugeren het supernatant en observeer de pellet op dicht opeengepakte alginaatmicrodeeltjes. Om het SHAPE-composiet te genereren, mengt u de alginaatmicrodeeltjespellet met verdund en geneutraliseerd collageen in een verhouding van twee tot één en pipet u het op en neer op ijs.

Breng het gegenereerde composietmateriaal over in een gekoelde 24-putplaat. Dissocieer voor het afdrukken de eerder gekweekte menselijke neurale stamcellen of hNSC's met behulp van een 0,025% trypsine-oplossing gedurende vijf minuten bij 37 graden Celsius. Neutraliseer vervolgens de trypsine met het groeimedium en centrifugeer de celsuspensie gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur op 400 G.

Na het verwijderen van het supernatant, resuspendien de celkorrel in twee tot drie milliliter groeimedium. Laad met behulp van een 21 gauge stompe metalen naald 100 microliter dicht opeengepakte alginaat microdeeltjes in de spuit. Laad vervolgens de voorbereide celsuspensie in een spuit.

Vervang voor het afdrukken de laadnaald door een 27 gauge stompe metalen naald. Met behulp van software waarnaar wordt verwezen, klikt u, zodra de af te drukken structuur is ontworpen, op genereren voor het genereren voor het genereren van een G-codegeneratie. Plaats de met cellen geladen spuit in een volumetrische extrusiekop op een op extrusie gebaseerde bioprinter en noteer de naaldlengte door te klikken op het starten van het naaldlengtemeetproces.

Plaats vervolgens de 24-putplaat geladen met SHAPE-composiet op de printer en klik op SHM om de hoogte van het lege putoppervlak te meten. Selecteer pH 2 gevolgd door het moersleutelsymbool. Wijzig vervolgens onder de parameterset het volumedebiet in 3,6 microliter per seconde en druk op Parameter toepassen, gevolgd door Opslaan en Gereed.

Laad de G-code in de gebruikersinterface van de printer door op een pictogram voor open G-code te klikken. Selecteer het pictogram voor het programma uitvoeren om de afdrukprocedure te starten. Incubeer de SHAPE-gel onmiddellijk na het afdrukken gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius voor het gloeien.

Voeg vervolgens voorzichtig groeimedium toe aan de gegloeide SHAPE-gelondersteuning. Verwijder voor immunostaining het overtollige medium uit de gel en breng de gel met behulp van een spatel over in een container met DPBS. Zodra de plaat in de zuurkast is geplaatst, verwijdert u de DPBS.

Bedek de gel met 4% formaldehyde-oplossing en incubeer gedurende een uur bij kamertemperatuur. Voeg na het wassen met DPBS de blokkerende oplossing toe aan de gel. Rock de plaat zachtjes en incubeer gedurende zes uur bij kamertemperatuur om niet-specifieke binding te voorkomen.

Zodra de blokkerende oplossing is verwijderd, voegt u het primaire antilichaam toe aan de gel en wiegt u het zachtjes. Incubeer de plaat gedurende 48 uur bij vier graden Celsius. Na DPBS-wassen, behandel de gel op dezelfde manier met de secundaire antilichaamoplossing gedurende 24 uur.

Plaats de gekleurde gel met een spatel in een putplaat met een dunne beeldvormende bodem voordat u de afbeelding maakt. In de huidige studie printte de hNSC-inkt een filament van cellen met een diameter van ongeveer 200 micrometer. De geprinte strengen waren rijk aan levensvatbare cellen met rondom morfologie.

Na 30 dagen printen vertoonden de cellen neurale morfologie met kleine cellichamen en lange dunne processen, wat wees op de succesvolle differentiatie van hNSC's. Kleuring met tubuline bèta drie maakte visualisatie van de gegenereerde neurale netwerken met behoud van geometrie mogelijk. En tijdens het differentiatieproces migreerden de cellen niet uit de geprinte strengen.

SHAPE-composiet kan worden gebruikt om doorlaatbare kanalen te produceren door opofferingsinkt te printen in plaats van cellen. Bovendien kan de ondersteuning zuurstofgevoelige kralen bevatten om de zuurstofspanning in 3D-geprinte structuren in tijd en ruimte te bewaken.